Wiwit Zuriati Uno,S.Farm., M.

Si
 Harborne, J. B. 2006. Metode Fitokimia.
Penerbit ITB Bandung
 Claus EP.,1961, Pharmacognosy, 4 nd Ed., Lea
and Febiger, Philadelpia
 Stahl,E., 1973, Drug analysis by
Chromatography and Microscopy, Ann Arbor
Science Publisher, Inc.
 Separasi adalah pemisahan komponen-komponen
dari satu campuran sehingga menjadi fraksi-fraksi
individual.
 Separasi dibagi menjadi dua yaitu separasi
mekanis dan separasi kimia
 Ada beberapa metode separasi yaitu
 ekstraksi (solvent extraction),
 destilasi,
 kristalisasi,
 kromatografi
 Ekstraksi (solvent extraction)
Pemisahan dengan menggunakan 2 pelarut
yang tidak saling campur.
 Prinsip pada pemisahan ini didasarkan pada
perbedaan kelarutan komponen yang akan
diambil terhadap 2 pelarut tersebut
(koefisien distribusi).
 Pemisahan dilakukan dengan menggunakan
corong pisah, digojog dan didiamkan.
Kekuatan dan lama penggojogan sangat
berpengaruh terhadap hasil.
 Pada pemisahan dengan cara destilasi
dilakukan berdasarkan perbedaan titik didih
dari komponen-komponen yang akan
dipisahkan.
 Campuran komponen yang akan dipisahkan
diletakkan pada sebuah labu destilasi dan
dipanaskan hingga menguap, dengan adanya
pendingin komponen-komponen tersebut
akan mengembun danterpisah dari
campurannya.
 Kritaslisasi
dilakukan apabila komponen yang
kita tuju dapat dikristalkan sedangkan
komponen pengotor lainnya tidak
mengkristal.
 Cara ini cukup sederhana dilakukan dengan
cara melarutkan campuran komponen pada
pelarut yang sesuai kemudian didinginkan
hingga terbentuk kristal, kristal kemudian
dipisahkan dari campuran tersebut
 Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan
fisik campuran komponen dalam suatu
sampel (ekstrak) berdasarkan pada
perbedaan migrasi komponen - komponen
tersebut dari fase diam oleh pengaruh fase
gerak
 Metode kromatografi merupakan
metode yang digunakan untuk
memisahkan komponen kimia yang
bercampur dalam sampel.

 Michael Tswett (1906) ahli botani dari

Rusia.
Menemukan pigmen warna dalam
ekstrak tumbuhan dengan
menggunakan serbuk kalsium
karbonat yang diisikan ke dalam
kolom, dan petroleum eter sebagai
pelarut

 Melibatkan 2 fasa yaitu fasa diam dan

fasa gerak
 Metode pemisahan suatu senyawa yang didasarkan
atas migrasi differensial komponen zat diantara 2
fasa yaitu fasa diam (fasa stasioner) dan fasa gerak
(fasa mobile)
 Fasa diam (bagian yang tidak bergerak dalam sistem
kromatografi): dapat berupa cair atau padat
 Fasa gerak (bagian yang membasahi sambil
mengambil senyawa yang dipisahkan): dapat berupa
gas atau cair. Fase gerak sering disebut dengan eluen,
yang fungsinya meng-elusi sampel sepanjang kolom
kromatografi melewati fase diamnya. Eluen yang
mengelusi dan keluar lagi diujung kolom disebut
dengan eluat.
 Analit yang berinteraksi kuat
dengan fasa diam tertahan
lebih lama, sehingga
pemisahaan dari kolom akan
lebih akhir dibandingkan
analit yang berinteraksi lemah.
 Analit akan terpisah dalam
dua pita.
 Analit terdeteksi saat keluar
kolom dan signalnya dicatat.
 Kromatogram berupa plot
antara waktu dan sinyal
detektor.
 Tujuan Kromatografi
 ANALITIK  menentukan komposisi kimia dari
sampel

 PREPARATIF  memurnikan dan mengisolasi

salah satu komponen dari sampel

Dalam kromatografi perhatikan:

- Jenis kromatografi
- Fasa diam
- Fasa gerak
 Memisahkan sampel/konstituen yang sangat kecil
(semi mikro & mikro)
 Memisahkan molekul-molekul besar seperti polimer
 Memisahkan senyawa-senyawa organik multi
komponen/ kompleks
 Waktu lebih singkat, relatif murah, sederhana
 Dapat memisahkan senyawa-senyawa yang tidak
stabil
Berdasarkan Tipe Gas/Cair GLC
Fase gerak Gas/Padat GSC
dan Fase diam Cair/Cair LLC
Cair/Padat LSC
Fluidasuperkritik/Cair SFLC
Fluidasuperkritik/Padat SFSC

Berdasarkan Krom.Partisi Φd=cair, Φg=cair

Mekanisme Krom.Adsorpsi Φd=padat, Φg=gas
Terbentuknya Pertukaran Ion Melibatkan ikatan kimia
Distribusi Fase

Berdasaarakan Kolom Kolom kemasan/kapiler

Geometri (packed)
Pipa terbuka (open tubular)
Planar/Bidang Kertas
Lapis Tipis
 Kromatografi

Cair Gas

Planar Kolom GSC GLC

TLC CZE PC LSC LLC BPC IEC BC

GPC GFC
Klasifikasi Kromatografi
Berdasarkan Jenis Fasa

Fasa gerak
Gas: Inert (helium, argon)
Fasa diam
Padat: silka, alumina
Klasifikasi Kromatografi
Berdasarkan Mekanisme Pemisahan Yang Terjadi

 Kromatografi Adsorpsi
 Kromatografi Partisi
 Kromatografi Penukar Ion
 Kromatografi Eksklusi (kromatografi permeasi gel
atau filtrasi gel)
 Kromatografi Afinitas
 Kromatografi Supercritical Fluida (SFC)
Kromatografi Adsorpsi

Kromatografi Partisi

Kromatografi Gas

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC)

Kromatografi Pertukaran Ion

Kromatografi Fluida Superkritik

 Kromatografi kolom adalah sebutan untuk semua jenis
pemisahan kimia menggunakan kolom sebagai wadah
fase diamnya.
 Tujuan : Analisis Kualitatif (menentukan senyawa yang
terkandung) dan Analisis Kuantitatif (menentukan
jumlah senyawa yang dibandingkan dengan standarnya)
 Fasa diam  kolom (padat/cair)
Fasa gerak  cair/gas

 Syarat penggunaan isi dalam kolom adalah digunakannya

material berpori. Hal ini digunakan agar fase gerak dapat
mengalir dan melewati kolom sambil membawa komponen
campuran yang hendak dipisahkan.
1. Sampel yang dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan
melalui atas kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam
adsorben (bahan penyerap).
2.Komponen dalam sampel diadsorbsi dari larutan secara
kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada
permukaan atas kolom.
3. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus,
masing-masing komponen akan bergerak turun melalui
kolom dan akan terbentuk pita yang setiap zona berisi satu
macam komponen.
4. Setiap zona yang keluar kolom dapat ditampung dengan
sempurna sebelum zona yang lain keluar kolom.
Gambar kromatogafi kolom
 Bentuk Kurva
kromatografi
Fase Gerak Adsorpsi
dan Fase
Diam
Pengertian
Adsorpsi
 Proses
adsorpsi suatu proses penarikan partikel di
permukaan materi.

 Dalam permukaan suatu lapisan akan ada penarikan

partikel oleh partikel lain aktivitas adsorpsi.
Hal ini dapat terjadi jika permukaan mempunyai situs
aktif/gugus fungsi yang dapat bereaksi dengan analit,
mempunyai permukaan yang luas (material berpori).

 Dalam proses kromatografi adsorpsi  berlaku Hukum

Kesetimbangan Adsorpsi-Desorpsi.
Proses pemisahan di permukaan dinyatakan dalam bentuk
isoterm adsorpsi (kurva hubungan jumlah senyawa yang
terserap di fs.diam = Cs dan jumlah senyawa yang larut dan
terbawa oleh fs.gerak = CM).
 Kurva A Kurva B Kurva C

• Kurva Konveks • Kurva Linier • Kurva Konkaf

(Cembung) • Terjadi jika n=1 (Cekung)
• Terjadi jika n>1 • Kesetimbangan • Terjadi jika n<1
• Kecepatan dipermukaan • Kurva melandai
tergantung pada berjalan normal di awal namun
jumlah situs aktif (proses adsorpsi kemudian
yang memenuhi dan desorpsi adsorpsi
lapisan terjadi secara berlangsung
permukaan dan simultan) cepat di akhir.
koefisien Terjadi jika di
distribusi tengah proses
menurun jika ditambahkan
konsentrasi pereaksi lain
bertambah. sehingga reaksi
berlangsung lebih
cepat.
SIFAT :
1 Polaritas relatif  kekuatan untuk
mengadsorpsi spesies tertentu.
-COOH > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > =C=O > -
COOR > -OCH3 > -CH=CH-
2. Kapasitas adsorpsi  jumlah gram solut yang
dapat diadsorpsi per gram adsorben
arang aktif > silika gel > alumina asam >
alumina basa > Cr2O3 > ZnS > Al2O3 > CaF2 >
CaO
Kemurnian Eluen

Pengotor dalam eluen  elusi terganggu

 Pelarut yang mengandung peroksida : pada
kolom alumina, peroksida tertahan sehingga
fungsi fs.diam terganggu
 Pelarut berhalogen : bila ada Na2CO3/K2CO3
dapat terbentuk HCl bebas
Fase diam  terdiri dari partikel polar, tergantung pada
gugus fungsi yang ada di permukaan. Ex: alumina-
karbon aktif-silika gel-magnesium-CaCO3-sukrosa-
amilum-selulosa.
Fase gerak  membawa senyawa turun pada waktu
elusi. Kekuatan pelarut dipertimbangkan karena dapat
menentukan kompetisi penyerapan molekul sampel.

Jika senyawa sangat larut dalam fs.gerak  elusi

berlangsung cepat, jika senyawa tidak larut dalam
fs.gerak  elusi berlangsung lama.
 Kromatografi partisi menggambarkan kesetimbangan cair-
cair di permukaan fase diam.
 Terjadi distribusi senyawa komponen antara eluen
(fs.gerak) dan lapisan cairan tipis yang menempel
dipermukaan padatan (fs.diam).
 Membutuhkan larutan penyangga untuk menjaga kelarutan
masing-masing komponen sebelum dan sesudah terpisah
dalam kolom.
 Dalam kromatografi partisi biasanya terdiri dari fs.diam
POLAR dan fs.gerak NON POLAR untuk mengelusi sampel.
 Fs. Diam : Cairan yang melapisi partikel penyangga
ex:selulosa, silika gel, C8, C18.
 Fs. Gerak : cairan yang tidak dapat bercampur dengan
fs. diam
 Sampel : berbeda kelarutannya dalam fs.diam
 Komponen yang lebih besar kelarutannya dalam fs.
diam akan tertahan lebih lama