PRAKTIKUM KESEPULUH

METODE PEMURNIAN FRAKSI

TUJUAN PRAKTIKUM
Melakukan pemurnian fraksi yang diperoleh dari hasil fraksinasipada praktikum 3 sehingga
dapat memisahkan suatu senyawa/bercak/isolat dengan metode Kromatografi Lapis Tipis
Preparatif atau Kromatografi Kolom.

TUJUAN INSTRUKSIONAL
Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa mampu memahami dan mampu melakukan
pemurnian fraksi sehingga diperoleh suatu isolat dengan berbagai metode kromatografi.

TEORI DASAR
Pemurnian fraksi dimaksudkan untuk memisahkan suatu komponen dari komponen lainnya
yang sama-sama terkandung dalam suatu fraksi. Terdapat beberapa metode untuk melakukan
pemisahan komponen dan biasanya dilakukan dengan satu atau beberapa kombinasi teknik
kromatografi. Teknik kromatografi yang biasa digunakan adalah kromatografi lapis tipis,
kromatografi kolom, kromatografi cair kinerja tinggi dan kromatografi gas cair. KLT
(Kromatografi Lapis Tipis) merupakan salah satu teknik kromatografi, yaitu suatu teknik atau
metode pemisahan / pemurnian senyawa kimia berdasarkan pada perbedaan koefisien partisi
senyawa dalam fasa diam dan fasa gerak, atau berdasarkan daya adsorpsi senyawa pada adsorben
yang bertindak sebagai fasa diam.
Fasa diam adalah fasa yang terikat pada pendukung, sedangkan fasa gerak adalah fasa yang
bergerak melalui fasa diam.
Senyawa yang akan dipisahkan ikut bergerak bersama fasa gerak. Selama senyawa bergerak terjadi
proses partisi komponen di antara fasa gerak dan fasa diam, atau terjadi proses adsorpsi senyawa
oleh adsorben yang bertindak sebagai fasa diam. Akibat adanya perbedaan koefisien partisi dan /
atau afinitas adsorpsi, terjadilah perbedaan kecepatan gerakan senyawa-senyawa yang
menyebabkan terjadinya pemisahan. Berdasarkan jenis fasa gerak dan fasa diam, kromatografi
dapat
dibedakan atas berbagai tipe sebagai berikut :

Fase Gerak Fase Diam Tipe Kromatografi

Cairan Padatan Kr. Cair-Padat
Gas Cairan Kr. Gas-Padat
 Cairan Padatan Kr. Cair-Cair
Gas Cairan Kr. Gas-Cair
Selain itu, penggolongan kromatografi juga dapat dilakukan berdasar pada jenis fasa
geraknya saja, berdasarkan mekanisme pemisahan, berdasarkan jenis pendukung, atau berdasarkan
proses pengembangannya. Penggolonggan berdasarkan fasa gerak memberikan dua tipe
kromatografi sebagai berikut :

Fase Gerak Tipe Kromatografi Dasar Pemisahan

Gas Kromatografi Gas Keatsirian dan kestabilan termal senyawa
Cairan Kromatografi Cair Proses partisi atau adsorpsi

Penggunaan kromatografi berdasarkan mekanisme pemisahan :

Mekanisme Pemisahan Tipe Kromatografi

Adsorpsi Kromatografi Adsorpsi
Partisi Kromatografi Partisi
Pertukaran Ion Kromatografi Pertukaran Ion
Perbedaan Ukuran Kromatografi Saringan Gel
Partikel Kromatografi Eksklusi Molekular

Pembagian kromatografi berdasarkan jenis pendukungnya adalah sebagai berikut :

Arah Pengembangan Tipe Kromatografi

Kertas Kromatografi Keras
Kaca/Lempeng Logam Tipis Kromatografi Lapis Tipis
Kolom Kromatografi Kolom
Fast Cromatography

Berdasarkan arah pengembangannya kromatografi dapat dibedakan atas beberapa tipe, yaitu :

Arah Pengembangan Tipe Kromatography

Horizontal Kromatografi Horizontal
 Vertikal Menurun Kromatografi Vertikal Menurun
Vertikal Menaik Kromatografi Vertikal Menaik
Sirkular Kromatografi Sirkular
Dua Arah Tegak Luruh Kromatografi Dua Arah
Pada kromatografi dibedakan istilah pengembangan dan elusi. Istilah pengembangan
digunakan untuk kromatografi datar yang fasa geraknya berjalan melalui fasa diam tanpa terjadi
pengeluaran senyawa dari fasa diamnya. Istilah ini digunakan pada kromatografi datar seperti
kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT). Istilah elusi digunakan pada kromatografi
yang fasa geraknya melalui fasa diam sambil membawa senyawa keluar dari fasa diam. Istilah ini
digunakan pada kromatografi kolom. Kromatografi lapis tipis adalah salah satu tipe dari
kromatografi datar, dengan fasa diam berupa adsorben yang melekat pada pendukung berupa
lempeng kaca atau logam tipis.Penjerap yang berbeda-beda dapat disaputkan pada pelat kaca atau
penyangga lain, seperti silika gel, alumunium oksida,celite, kalisium hidroksida, damar penukar
ion, magnesium sulfat, poliamida, sephadex, polifenilpirolidon, selulosa atau campuran dua atau
lebih bahan diatas.

Pemisahan pada KLT dapat berlangsung melalui dua mekanisme, yaitu mekanisme adsorpsi
dan mekanisme partisi. Bertitik tolak dari kedua mekanisme tersebut, pada KLT selain polaritas
sistem yang merupakan penentu keberhasilan pemisahan, pemilihan sistem adsorpsi, sistem
partisi, serta pelarut merupakan faktor-faktor yang harus diperhatikan. Selain pemilihan pelarut
yang berdasar pada falsafah polar loves polar, adsorben merupakan faktor yang harus diperhatikan
untuk keberhasilan pemisahan pada metode KLT. Berbagai adsorben dapat digunakan pada KLT,
namun yang paling umum digunakan adalah silika gel, alumina, kieselguhr (tanah diatomae), dan
selulosa.

Pemisahan adsorben untuk suatu pemisahan KLT selain mempertimbangkan sifat kimia
senyawa sifat kimia adsorben juga harus diperhatikan tingkat / derajat aktif adsorbennya. Menurut
Brockmann, derajat aktif adsorben ini dapat dilihat dari kandungan air dalam adsorben tersebut.
Adsorben dengan kandungan air paling rendah merupakan adsorben yang mempunyai derajat aktif
tertinggi dan dinyatakan sebagai adsorben dengan derajat aktif I, sedangkan adsorben dengan
derajat aktif terendah dinyatakan sebagai adsorben derajataktif V. Adsorben derajat aktif 1 dapat
ditingkatkan derajat aktifnya dengan cara memanaskan adsorben tersebut pada suhu 105 o C dalam
waktu tertentu. Proses tersebut dikenal dengan sebutan pengaktifan adsorben. Proses
pengembangan pada KLT umumnya dibedakan atas pengembangan satu kali dan pengembangan
berulang.
Metode pengembangan berulang ini merupakan modifikasi dari pengembangan biasa, yaitu
kromatogram dikembangkan dengan suatu fasa gerak, kemudian diangkat dan dikeringkan tanpa
pemanasan. Setelah itu kromatogram dikembangkan dengan fasa gerak yang sama. Banyaknya
pengulangan proses pengembangan yang optimal untuk memperoleh pemisahan yang baik
dinyatakan oleh Thomas dengan persamaan :

Atau :

Nilai Rf merupakan ukuran relatif letak suatu bercak senyawa dalam kromatogram terhadap
garis akhir pergerakan fasa gerak.

Berbeda dengan kromatografi kertas, keterulangan (reproduksibilitas) nilai Rf pada KLT

sangat tidak dapat diharapkan karena berbagai faktor penyebab seperti misalnya derajat aktif
adsorben, kejenuhan tabung pengembang, kondisi pengembangan, homogenitas adsorben, suhu,
dan lain-lain. Selain pengembangan satu arah (menaik atau menurun, tetapi umumnya menaik),
KLT juga dapat dikembangkan dalam dua arah yang saling tegak lurus dengan fasa gerak yang
sama atau berbeda. Pengembangan seperti itu dikenal dengan sebutan KLT dua arah. Sebagai
pendeteksi bercak pada kromatogram dapat dilakukan dengan visual untuk komponen yang
berwarna, sinar UV 254 nm dan 366 nm, pereaksi penampak bercak seperti uap iodium,asam sulfat
pekat dalam etanol, asam sulfat kromat, ninhidrin dalam butanol, asam difenil borat, vanillin sulfat,
dragendorff dan sebagainya.
KLT PREPARATIF

Kromatografi lapis tipis preparatif dimaksudkan untuk memisahkan senyawa dalam jumlah
gram. Pelat dapat dipersiapkan lebih tebal (0,5 – 2 mm). Sampel diteteskan ke pelat dengan alat
syringe membentuk suatu pita (band). Pendeteksian senyawa tidak boleh merusak senyawa. Pita
yang akan dipisahkan dapat dikerok dan dilarutkan dalam pelarut untuk mendapatkan senyawa
yang diinginkan.

Cara pembuatan pelat Silika gel pada penyangga kaca : Bersihkan dulu kaca yang sudah
diatur di atas alat Desaga dengan aseton, supaya bebas dari lemak. Buat bubur Silika gel 25 g
dalam 50 ml air suling dan dikocok kuat dalam labu erlenmeyer. Tuangkan semua bubur ke dalam
tabung desaga lalu cepat-cepat dibalik diatas kaca pertama, kemudian segera diratakan pada kaca
berikutnya sampai kaca terakhir. Diamkan lapisan silika pada pelat hingga mengering pada suhu
kamar kira-kira 10-20 menit, lalu pelat dikeringkan dalam oven dengan suhu 110-120 ˚C selama
1-2 jam.

KROMATOGRAFI KOLOM
Kromatografi kolom biasanya digunakan untuk memisahkan komponen dalam jumlah lebih
besar (gram). Mempersiapkan kolom harus dilakukan dengan hati-hati agar dihasilkan kolom
kemas yang serba sama (homogen). Jika kolom tidak mempunyai penyaring kaca masir, maka kita
harus menyumbat kolom dengan segumpal kaca wool atau kapas. Sumbat ini harus terendam
dengan pelarut pengelusi setinggi 10 cm. Selanjutnya penjerap dijadikan bubur dalam gelas piala
menggunakan pelarut yang sama, lalu dituangkan hati-hati ke dalam kolom dan tidak terputus-
putus, untuk mencegah terbentuknya lapisan. Setelah itu penjerap dibiarkan turun dan kelebihan
pelarut dikeluarkan melalui keran. Pada poliamid dianjurkan kemasan direndam dulu selama satu
jam, supaya mengembang.
Langkah pertama pada kromatografi kolom ialah menempatkan larutan cuplikan pada kolom
sedemikian rupa sehingga terbentuk pita yang siap untuk dielusi. Untuk mencapai itu, cuplikan
harus dilarutkan dalam pelarut yang volumenya sesedikit mungkin. Pelarut yang dipakai harus
sama dengan pelarut pengelusi, dan sebaiknya pelarut yang kepolarannya paling rendah, walaupun
hal ini tidak selalu dapat dilaksanakan berhubung dengan kelarutannya. Menempatkan larutan
pekat pada kolom harus hati-hati supaya kemasan kolom tidak terganggu, dan untuk ini dianjurkan
menggunakan pipet. Cuplikan dibiarkan meresap ke dalam kolom, baru proses kromatografi
dimulai.

Jika cuplikan tidak dapat melarutdalam eluen, maka dapat digunakan cara penjerapan.
Cuplikan dilarutkan ke dalam sedikit pelarut sembarang yang cocok, dan dicampur dengan sedikit
penjerap. Lalu penjerap dikeringkan dan ditaburkan di atas kolom semerata mungkin sebagai
serbuk.
 Gambar. Kromatografi Kolom

ALAT :
1. Erlemeyer
2. Plat Kaca

3. Tabung Desaga
4. Oven

5. Plat KLT

BAHAN :
1. Silika Gel
2. Aquadest

PROSEDUR KLT PREPARATIF :

1. Pelat kaca dibersihkan dengan aseton dan disusun diatas alat Desaga.
2. Bubur silika gel dibuat dengan cara mencampurkan 25 gram silika gel dengan 50 mL aquades
dalam Erlenmeyer, kocok kuat-kuat sampai tercampur homogeny

3. Tuangkan semua bubur silika gel ke dalam alat tabung Desaga dan segera dibalik bubur silika
gel sehingga berada diatas kaca, kemudian segera diratakan pada kaca berikutnya sampai
dengan kaca terakhir
4. Biarkan lapisan silika gel mengering pada suhu kamar selama 10-20 menit lalu dipanaskan di
dalam oven dengan suhu 110-120°C selama 1-2 jam
5. Setelah kering pelat dapat digunakan untuk KLT preparatif. Caranya: sejumlah fraksi dilarutkan
dalam larutan pengembang yang telah disiapkan dan tutulkan cuplikan secara berderet sehingga
membentuk pita sebagai garis awal pengembangan. Keringkan di udara beberapa saat.

6. Pelat dimasukkan ke dalam chamber yang telah jenuh dengan larutan pengembang dan lakukan
kromatografi sampai tanda batas
7. Amati pita yang terbentuk secara visual atau dengan sinar UV, kerok salah satu pita yang
terbentuk dan saring hasil kerokan dengan pelarut pengembang yang digunakan.
8. Lakukan evaluasi terhadap isolat dengan Kromatografi Lapis Tipis.

HASIL PERCOBAAN :
Data analisis kromatografi lapis tipis preparatif :
Penjerap : ...................................................

Pengembang : ...................................................
Penampak bercak : ...................................................

Jumlah pita yang terbentuk : ..................................................

No. pita yang dikerok : ...................................................

Kromatogram Isolat : ...................................................

Kesimpulan : ...................................................

KESIMPULAN
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
........................................................................................................................

Paraf Asisten Praktikum Paraf Praktikan

(Hari/Tanggal) (Hari/ Tanggal)

DAFTAR PUSTAKA
1. Gritter, R.J., Bobbitt, J.M., Schwarting A.E. 1991. Introduction of Chromatography (Pengantar
kromatografi), terjemahan Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung.
2. Hostettmann, K, Hostettman M. 1995. Preparative Chromatography Techniques (Cara
Kromatografi Preparatif). Terjemahan Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB. Bandung.
3. Moelyono MW. 1996. Pengantar Kromatografi. Laboratorium Farmakognosi Jurusan Farmasi
FMIPA UNPAD.
4. Sastrohamidjojo, H. 1996. Sintesis Bahan Alam. Gajah Mada University Press. Yogyakarta.
5. Stahl, E. 1973. Drug Analysis by Chromatography and Microscopy : A Practical Supplement
to Pharmacopeias. Ann Arbor Science Publ. Michigan.