VALIDASI

 Validasi metoda adalah suatu tindakan penilaian terhadap

parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium,
untuk
membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi
persyaratan
untuk pengunaannya.
TUJUAN VALIDASI

Untuk menjamin metode analisis yang digunakan mampu

memberikan hasil yang tepat dan teliti hingga dapat
dipercaya.
Atau dengan kata lain validasi disebut:
- Absah / valid
- Dapat dipercaya
- Dapat dipertanggung jawabkan secara ilmiah
- Kesesuaian dengan tujuan pengujian
PARAMETER METODE VALIDASI

1. Akurasi (Ketepatan/Kecermatan)
2. Presisi (Keseksamaan/Ketelitian)
3. Spesifitas (Selektifitas)
4. Linieritas
5. Rentang Linieritas (Range)
6. Sensifitas (LOD dan LOQ)
7. Ruggedness (Kekasaran)
8. Robustness (Ketahanan)
 METODE ANALISIS YANG DIVALIDASI :

1) Metode Analisis yang BARU DIKEMBANGKAN

Dimana karakteristik unjuk kerja metodenya belum diketahui (terkait
dengan persyaratan dan penggunaannya).

2)Metode analisis yang DIMODIFIKASI dan atau diterapkan pada matriks/

bentuk sediaan yang berbeda

 Metode Analisis yang DIVERIFIKASI :

Metode baku dan metode resmi yang diadopsi, tidak perlu divalidasi
tetapi cukup diverifikasi.

46
PENGGOLONGAN METODE ANALISIS

1. Metode Standard atau Metode Baku

2. Metode Resmi
3. Metode yang dikembangkan dilaboratorium ( In house Developed
Methods)
4. Metode Pustaka
5. Metode yang dikembangkan oleh Organisasi Profesional Ilmiah
dan penggunaannya relevan dengan bidang ilmu profesional
tersebut.
 BATASAN DAN URAIAN VALIDASI METODE
ANALISIS DAPAT DILIHAT:

 The European Community

 The United States Food & Drug Administration
 The United States Pharmacopeia (USP)
 The Japanese Ministry of Health and Welfare
 The International Conference on Harmonization (ICH)
 The Canadian Health Protection Branch
TIPE UMUM PROSEDUR METODE ANALISIS KIMIA

Uji Identifikasi
Uji Cemaran :
- Uji Kuantitatif Kandungan Cemaran
- Uji Batas Cemaran
Uji Kuantitatif Komponen Utama dalam Matriks
Uji Kuantitatif Performance Karakteristik
 PARAMETER VERIFIKASI METODE ANALISIS

 Uji
Identifikasi :
- Spesifitas atau selektivitas (kemampuan untuk mengukur yang dituju

secara tepat dan teliti dengan adanya komponen lain yang mungkin
ada
dalam matriks sampel). Spesifitas ditunjukkan oleh daya pisah dua
senyawa yang berdekatan.
- Batas Deteksi
 Uji Kuantitatif
- Akurasi
- Presisi
 AKURASI/KETEPATAN

 Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan kedekatan hasil

analisis yang diperoleh dengan kadar analit yang sebenarnya
terhadap nilai benar yang dapat diterima.
Nilai benar = Bobot analit atau baku pembanding yang ditambahkan.

Akurasi dinyatakan dalam % Recovery yaitu persentase nilai yang

diperoleh terhadap nilai sebenarnya.
METODE PENETAPAN

1. Metode Simulasi (Spike Placebo Recovery)

Analit ditambahkan ke dalam matriks sample (Placebo)
kemudian kadarnya dianalisis ini disebut juga Analisis Formulasi
Buatan)
2. Metode Standar adisi ( Spiked Sample, standard addition method)
Jika matriks dan eksipien tidak tersedia maka akurasi dinyatakan
sebagai persen perolehan kembali kadar analit yang ditambahkan
pada produk jadi yang sudah mengandung analit.
 AKURASI DAN KRITERIA AKURASI

Menentukan Recovery Analit pada Metode Standard Adisi :

Menambahkan Minimum 3 konsentrasi analit /baku pembanding

dalam rentang spesifik 80 %
100% dan
120%,
dengan masing-masingc 3 (tiga) replikasi.
PROSEDUR STANDARD ADISI ( LANJUTAN )

1. Ke dalam sampel obat ditambah baku pembanding analit ( X mg)

kemudian tentukan kadarnya (kadar total)
misal kadar yang diperoleh A mg
2. Sampel obat (tanpa penambahan baku pembanding) ditentukan
kadarnya
misal didapat B mg
3. Hitung % recovery ( R ) adalah

% recovery ( R ) = A mg- B mg/X mg x 100%

 CONTOH PERHITUNGAN METODE STANDARD ADISI

1. Misal, bobot rata-rata tablet alopurinol = 300 mg.

1 tablet mengandung 100 mg (etiket)

 Rentang spesifik : 80%

Setiap Rentang spesifik mengandung 70% analit dan
30% baku pembanding alopurinol
Rentang 80% = 80% x 100 mg = 80 mg .
70% analit = 70% x 80 mg = 56 mg
Bobot serbuk tablet alopurinol yang ditimbang =(56mg/100mg ) x 300 mg
= 168 mg
Artinya dalam 168 mg serbuk tablet mengandung 56 mg alopurinol.

Baku pembanding alopurinol (30%) yang ditambahkan = 30% x 80 mg

= 24 mg.
 CONTOH PERHITUNGAN METODE STANDARD ADISI
(LANJUTAN)

 Rentang 100% = 100%x 100 mg = 100 mg.

70% analit = 70%x 100 mg = 70 mg
Bobot serbuk tablet alopurinol yang ditimbang = (70/100) x 300 mg
= 210 mg
Artinya dalam 210 mg serbuk tablet, mengandung 70 mg alopurinol.

Baku pembanding alopurinol (30%) yang ditambahkan = 30%x 100

mg
= 30 mg
 CONTOH PERHITUNGAN METODE STANDARD ADISI
(LANJUTAN)

 Rentang 120% = 120%x 100 mg = 120 mg.

70% analit = 70%x 120 mg = 84 mg
Bobot serbuk tablet alopurinol yang ditimbang = (84/100) x 300 mg
= 252 mg
Artinya dalam 252 mg serbuk tablet, mengandung 84 mg alopurinol.

Baku pembanding alopurinol (30%) yang ditambahkan = 30%x 120

mg
= 36 mg
 CONTOH PERHITUNGAN METODE STANDARD ADISI
(LANJUTAN)

Bobot Serbuk yang ditimbang (tablet Alopurinol dan Baku

Pembanding)
No Berat yang ditimbang Rentang % alopurinol
( mg )
80% 100% 120%

1 Serbuk tab. Alopurinol 168 210 252

2 Baku pembanding (mg) 24 30 36

 TUGAS

1. Hitung Bobot penimbangan serbuk tablet dan Baku pembanding yang

ditambahkan pada rentang 80 %, 100% dan 120
Diketahui: Tablet cephadroksil mengandung (etiket): 500 mg/tablet
Bobot 20 tablet = 11061,3 mg ,
Bobot rara-rata = 553,06 mg

2. Hitung % recovery dengan 1 replikasi pada rentang 80%,

100% dan
120 %
 CONTOH PROSEDUR PERHITUNGAN VALIDASI

Uji validasi metode KCKT (penentuan kadar Cephadroksil tabl),

Prosedur dengan penambahan baku pada rentang spesifik 80 %
1. Serbuk tablet ditimbang dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml,
kemudian ditambah baku pembanding (120 mg) ---> ad fasa gerak
2. Larutan dipipet 0,05 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, --->ad

fasa gerak.
3. Larutan disuntikkan ke dalam sisitim KCKT,
4. Diperoleh Luas Area kromatogram untuk 80 % = 250185
Prosedur dengan tanpa penambahan baku pada rentang spesifik 80 %
1. Serbuk tablet ditimbang dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml,
---> ad fasa gerak
2. Larutan ini dipipet 0,05 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml,
--->ad fasa gerak.
3. Larutan disuntikkan ke dalam sisitim KCKT,
4. Diperoleh Luas Area kromatogram untuk 80 % = 190671
 PERHITUNGAN % RECOVERY

Luas Area kromatogram tambah Baku 80 % = 250185

Persamaan Regresi dari Kurva Kalibrasi Y = 25204,9942 X +
Luas Area kromatogram
24450,5993 tanpa Baku 80 % = 190671
Baku Pembanding ditambahkan
Faktor pengenceran dariuntuk
prosedur 80%
percobaan = 120 mg
50ml/0,05ml
=1000 x
Persamaan Regresi dari Kurva Kalibrasi Y = 25204,9942 X +
24450,5993

Faktor pengenceran dari prosedur percobaan 50ml/0,05ml =1000 x

Prosedur dengan penambahan baku pada rentang spesifik 100%
1. Serbuk tablet ditimbang dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml,
kemudian ditambah baku pembanding ( 150 mg) ---> ad fasa gerak
2. Larutan dipipet 0,05 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, --->ad
fasa gerak
3. Larutan disuntikkan ke dalam sisitim KCKT,
4. Diperoleh Luas Area kromatogram + Baku untuk = 301968
Luas area kromatogram tanpa baku = 226923

Persamaan Regresi dari Kurva Kalibrasi Y = 25204,9942 X + 24450,5993

Faktor pengenceran dari prosedur percobaan 50ml/0,05ml =1000 x
Prosedur dengan penambahan baku pada rentang spesifik 120%
1. Serbuk tablet ditimbang dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml,
kemudian ditambah baku pembanding (180 mg) ---> ad fasa gerak
2. Larutan dipipet 0,05 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, --->ad
fasa gerak
3. Larutan disuntikkan ke dalam sisitim KCKT,
4. Diperoleh Luas Area kromatogram + Baku untuk = 333493
Luas area kromatogram tanpa baku = 243132

Persamaan Regresi dari Kurva Kalibrasi Y = 25204,9942 X + 24450,5993

Faktor pengenceran dari prosedur percobaan 50ml/0,05ml =1000 x
 PRESISI/KETELITIAN/KESEKSAMAAN
 Presisi/ketelitian/ keseksamaan adalah,
Ttingkat kesesuaian antara hasil analisis sekelompok hasil uji jika
prosedur dilakukan berulang kali terhadap beberapa sampel yang
homogen.
 Presisi dinyatakan dengan simpangan baku / Standard Deviation (SD)
atau Simpangan Baku Relatif / Relative Standard Deviation ( RSD ) =
koefisien keragaman / coefisien variansi ( CV ).
 PRESISI (KETELITIAN)

Parameter Perhitungan untuk Ketelitian adalah RSD

SD
RSD  x 100%
RSD = Relatif Standar Deviasi (%) X
SD = Standar deviasi
X = kadar rata-rata sampel
 TINGKATAN PRESISI
ADA TIGA JENIS PRESISI, YAITU: REPEATABILITY (KETERULANGAN), PRESISI ANTARA
(REPRODUKSIBILTAS INTERNAL) DAN REPRODUKSIBILITAS

a.Repeatabilitas (keterulangan)
Keterulangan adalah kemampuan metode untuk memberikan hasil
analisis yang sama untuk beberapa sampel yang kadarnya sama
yang dilakukan oleh satu orang analisis pada waktu tertentu
terhadap beberapa sampel yang sama.
Keterulangan diukur terhadap tiga jenis sampel dengan konsentrasi
80%, 100% dan 120% dari konsentrasi aktual yang ditetapkan
masing-masing tiga kali (triplikasi) (ICH). atau diukur terhadap
enam jenis sampel dengan konsenrasi sama (100% dari
konsentrasi aktual
 TINGKATAN PRESISI
ADA TIGA JENIS PRESISI, YAITU: REPEATABILITY (KETERULANGAN), PRESISI ANTARA
(REPRODUKSIBILTAS INTERNAL) DAN REPRODUKSIBILITAS

 B. Presisi Antara (intermediate Precision), ( Reproduksibilitas Internal) :

Presisi antara adalah pengukuran kinerja metode dimana sampel diuji dan
dibandingkan, dilakukan oleh analis berbeda, menggunakan peralatan
berbeda dan pada hari yang berbeda. nama lain dari presisi antara adalah
“Ruggedness”
Metode, laboratorium, alat sama; contoh identik; penguji dan waktu
berbeda.
 C. Reproduksibilitas (ketertiruan, Reproduksibiltas Eksternal / Ruggedness ) :
Metode sama; diuji oleh beberapa laboratorium (studi kolaboratif) alat,
penguji dan waktu pengujian berbeda.
LINIERITAS

Linieritas adalah,
Kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara
langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada rentang yang
diberikan.
Linieritas suatu metode ,merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi
yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x).
Linieritas yang baik bila koefisien korelasi (r) mendekati 1
 CARA PENETAPAN LINIERITAS

 Ditetapkan minimum 6 konsentrasi pada rentang minimum 50 % −

150 % dari kadar analit.

 Dihitung :
- koefisien korelasi (r)
- persamaan regresi : y = a + bx.

a = intersept (ukuran bias metode analisis yang dicoba) dan

b = slope / kemiringan (gambaran linieritas).

26
KRITERIA PENERIMAAN RSD

No Konsentrasi Analit dalam % RSD

Matriks contoh
1 100 g / kg 2
2 10 g / kg 3
3 1 g/ kg 4
4 100 mg / kg 5
5 10 mg / kg 7
6 1 mg / kg 11
7 100 µg / kg 15
8 10 µg / kg 21
9 1 µg / kg 30
10 0.1 µg / kg 43
SPESIFISITAS / SELEKTIFITAS

Selektifitas : Kemampuan metode analisis memberikan signal

analit pada campuran analit dalam contoh tanpa
adanya interaksi antar analit.
Spesifisitas : Kemampuan metode analisis membedakan suatu

analit yang ditetapkan dari komponen lain yang

berada dalam matriks contoh.
 LIMIT DETEKSI (LIMIT OF DETECTION)

Limit deteksi (LOD) adalah,

Konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat
dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi.

LOD dapat dihitung berdasarkan pada simpangan baku

residual
dan kemiringan (slope) kurva baku.

LOD = 3 x Sy/X / Slope

 LIMIT KUANTIFIKASI (LIMIT OF QUANTIFICATION)

Limit Kuantifikasi adalah,

Konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat
ditentukan
dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima pada kondisi
operasional metode yang digunakan.

LOQ = 10 x Sy/X / slope

CONTOH PERHITUNGAN BATAS DETEKSI (LOD)
DAN BATAS KUANTITASI (LOQ)

Persamaan regresi : Y = ax + b
Y = 13933,66857 X + 3448,8
Konsentrasi Luas Area
Yi Y – Yi ( Y – Yi )2
X Y
5,0 79907 83390,9142 -3483,9142 12137658,15
10,0 134743 148949,7485 -14206,7485 201831702,9
15,0 210484 214508,5828 -4024,5828 16197266,71
20,0 282565 280067,4171 2497,5829 6237920,342
25,0 355035 345626,2514 9408,7486 88524550,22
30,0 420994 411185,0857 9808,9143 96214799,74
  ∑ ( Y – Yi )2
421143898,1
 Standar Deviasi ( Sy / x) 
 (Y  Yi ) 2

n2

Sy / x 
421143898, 1
62

Sy/x = 10260,8954
LOD = 2,2092 µg/ ml
3 x 10260,8954
LOQ = 7,3641
LOQ 
10µg/ ml,8954
x 10260
LOD  13993,66857
13933,66857 3 x Sy / x
Batas Deteksi ( LOD )  10 x Sy / x
Batas
Slope Kuantitasi ( LOQ ) 
Slope