VALIDASI DAN VERIFIKASI

METODE ANALISA

FFS UHAMKA
Tim Dosen UHAMKA
2022
 GLOBALISASI PER
DAGANGAN BEBAS

PERLU DIDUKUNG PENEGAKKAN

KESEHATAN
HASIL UJI LAB. HUKUM

HASIL UJI YANG

VALID

TIDAK BERGAN DIAKUI SECARA DIHINDARI DUPLI

TUNG PADA LAB. INTERNASIONAL KASI PENGUJIAN
 KOMPONEN YANG MEMPENGARUHI UNTUK
MENDAPATKAN HASIL UJI YANG VALID
1. Personil yang kompeten: diklat dan pengalaman
kerja yang cukup.
2. Peralatan yang handal: dirawat, dikalibrasi,
diverifikasi.
3. Metode yang sesuai : divaladasi / verifikasi.
4. Bahan yang memenuhi persyaratan: contoh uji,
baku/standar, pereaksi.
5. Informasi dan penunjang laboratorium: data,
laporan, pustaka.
 Lanjutan...seleksi
• Setiap laboratorium dapat memutuskan
sendiri metode pengujian mana yang akan
digunakan yang disesuaikan dengan kondisi
dan kemampuan laboratorium.
• Verifikasi :
penyediaan bukti objektif bahwa barang
tertentu memenuhi persyaratan yang
ditentukan
 DEFINISI
Validasi metode analisis :
 Penilaian parameter analitik tertentu berdasarkan
percobaan untuk memenuhi syarat sesuai dengan tujuan
penggunaan.
 Konfirmasi melalui pengujian dan bukti objektif agar
persyaratan untuk maksud khusus dipenuhi.
( SNI -17025-2008 )

Verifikasi metode analisis :

 Proses konfirmasi kembali untuk menunjukkan metode
telah sesuai dan memenuhi kebutuhan laboratorium.
 TUJUAN
Didapat hasil analisis :
 Absah / valid
 Dapat dipercaya
 Dapat dipertanggungjawabkan secara
ilmiah
 Kesesuaian dengan tujuan
 KLASIFIKASI METODE ANALISA

1. Metode standar / baku / acuan

2. Metode resmi
3. Metode pustaka
4. Metode yang dikembangkan oleh
laboratorium
5. Metode yang dikembangkan oleh
organisasi profesional
 METODE STANDAR
 Definisi: metode yang dikembangkan oleh organisasi / badan
standarisasi baik nasional maupun internasional.
 Sifat :
 Dikerjakan oleh banyak ahli
 Divalidasi oleh banyak laboratorium
 Terbukti akurat dan yang paling terbaik.
 Contoh :
 SNI : dikembangkan oleh BSN
 ASTM: dikembangkan oleh American Society for Testing and
Materials.
 ISO : dikembangkan oleh International Organization for
Standarization
 METODE RESMI
 Definisi: metode yang dipersyaratkan oleh undang-undang atau
peraturan untuk digunakan oleh pemerintah atau organisasi /
lembaga / industri yang diatur oleh pemerintah.
 Sifat:
• Karena pentingnya metode ini dalam pemberlakuan undang-
undang, maka metode ini sebelum digunakan sudah divalidasi
dahulu dengan teliti.
• Laboratorium yang terlibat dalam pemberlakuan metode ini
tidak perlu melakuakan validasi lagi, tetapi cukup melakuan
verifikasi.
 Contoh:
• FI dan KMI
• USP
• BP
 METODE PUSTAKA
 Definisi: metode yang dipublikasikan dalam berbagai
majalah ilmiah yang terspesilalisasi, seperti: kimia
analitik, kimia makanan, kimia farmasi, dan lain-lain
 Sifat:
 Seringkali penulis artikel orisinil melakukan bias
dalam asesmen kegunaannya
 Sebelum digunakan wajib divalidasi dengan teliti.
 Contoh:
 Jurnal-jurnal
 Buku Pustaka
 METODE YANG DIKEMBANGKAN
OLEH LABORATORIUM

 Definisi: metode yang dirancang, diuji coba, dan divalidasi

secara luas oleh suatu laboratorium sehingga metode
tersebut dapat dipercaya dan memberikan hasil yang
akurat.
 Sifat:
• Metode ini dapat merupakan karya orisinil laboratorium
tertentu atau hasil modifikasi dari metode yang lainnya
(metode standar, resmi atau pustaka).
• Sebaiknya dilakukan uji banding antar laboratorium.
 Contoh:
• Metode Analisa PPOMN
 METODE YANG DIKEMBANGKAN OLEH
ORGANISASI PROFESIONAL
 Definisi: metode yang dikembangkan oleh suatu organisa
si profesional ilmiah yang penggunaanya relevan dengan
bidang ilmu profesional tersebut.
 Sifat:
 Pada umumnya telah digunakan dalam uji profisiensi
antar laboratorium baik nasional maupun internasional.
 Biasanya akurat dan telah divalidasi antar laboratorium
 Contoh:
 AOAC: dikembangkan oleh Association of Analitycal
Chemists.
 PARAMETER VALIDASI
1. Presisi (Ketelitian / Keseksamaan)
2. Akurasi (Ketepatan / kecermatan)
3. Sensitifitas (LOD dan LOQ)
4. Spesifisitas / Selektifitas
5. Linieritas
6. Range (Rentang)
7. Ruggednes (Kekasaran)
8. Robustness (Ketahanan)
 PARAMETER VERIFIKASI
1. KUALITATIF :
a. Batas deteksi
b. Spesifisitas
2. KUANTITATIF :
a. Presisi
b. Akurasi
 PRESISI / KETELITIAN
Kedekatan hasil uji yang diperoleh dari beberapa pengulang
an (replikasi) pada penetapan contoh yang sama (homogen).

Cara penetapan:
 Dilakukan pengujian berulang kali (mulai dari penyiapan
sampel sampai perhitungan akhir) sebanyak 6 x atau lebih
terhadap contoh yang sama.
 Presisi dinyatakan sebagai RSD.
 Nilai RSD yang dapat diterima tergantung dari konsentrasi
analit dalam matriks contoh.
 TINGKATAN PRESISI
1. Presisi metode (Repeatabilitas) : pengujian ulang de
ngan kondisi contoh, metode, laboratorium, analis, alat
dan waktu yang sama.
2. Presisi antara (Reprodusibilitas internal) : pengujian
ulang terhadap contoh, metode, laboratorium dan alat
yang sama, tetapi analis dan waktu pengujiannya ber
beda.
3. Presisi antar laboratorium (Reprodusibilitas eksternal
atau Ruggedness) : pengujian ulang dengan mengguna
kan contoh dan metode yang sama, tetapi laboratorium,
alat, analis dan waktu pengujiannya berbeda.
UKURAN PRESISI DAN PENETAPANNYA

 Presisi Sistem (Replikabilitas) :

Penyuntikan berulang minimum 6 kali dari contoh
homogen untuk menunjukkan kinerja alat pada
kondisi dan hari pengujian.

 Presisi Metode (Repeatabilitas) :

Minimum 3 konsentrasi analit dalam rentang
tertentu, masing-masing 3 replikasi atau minimum 6
penetapan pada konsentrasi pengujian 100 %
Presisi (Lanjutan)

SD = √ [ ∑ ( Xi – Xrata-rata )] / N – 1

RSD = [ SD / Xrata-rata )]

Reproduksibilitas menurut Horwitz :

RSD = 2 (1-0.5 log C )
C = fraksi konsentrasi
Semakin kecil konsentrasi analit, nilai RSD atau CV
yang dapat diterima semakin besar.
 FRAKSI KONSENTRASI ( C )
• C harus ditulis dalam satuan yang sama, misalnya :
b/b b/v
kg/kg kg/L
g/g g/mL
mg/mg mg/10 –3 mL
• Dengan demikian apabila konsentrasi dalam ppm,
misalnya 1 ppm maka :
• Konsentrasi = 1 mg/L
• Fraksi konsentrasi (C) = 1.10 –6 kg/L
• RSD (%) = 2 1-0,5 log 0,000001
 HASIL PRESISI YANG MASIH DAPAT
DITERIMA

No. Konsentrasi Analit Dalam % RSD

Matriks Contoh
1. 100 g / kg 2
2. 10 g / kg 3
3. 1 g / kg 4
4. 100 mg / kg 5
5. 10 mg / kg 7
6. 1 mg / kg 11
7. 100 μg / kg 15
8. 10 ug / kg 21
9. 1 ug / kg 30
10. 0,1 ug / kg 43
 AKURASI / KETEPATAN
 Kedekatan hasil uji yang diperoleh (menggunakan metode
yang sedang divalidasi) dengan nilai sebenarnya yang ter
dapat dalam contoh uji.
 Akurasi biasanya dinyatakan sebagai prosen Recovery.
 Metode penetapan Akurasi :
• Recovery analit : untuk contoh yang komposisinya diketahui.
• Standar adisi : untuk contoh yang komposisinya tidak
diketahui.
• Membandingkan hasil yang diperoleh dengan menggunakan
metode yang telah valid
CARA PENETAPAN AKURASI

 Recovery Analit dan Metode Standard Adisi :

Minimum 3 konsentrasi analit / baku pembanding
yang ditambahkan dalam rentang 80 % – 120 % ,
masing-masing 3 replikasi.

 Pembandingan Metode :
Minimum 6 kali pengujian menggunakan metode
analisis yang sedang divalidasi dan 6 kali pengujian
menggunakan metode standard atau metode resmi
 HASIL AKURASI YANG MASIH DAPAT DITERIMA

No. Konsentrasi Analit Dalam Rentang % Recavery

Matriks Contoh
1. 100 % 98 - 102
2. > 10 % 98 - 102
3. > 1 % 97 - 103
4. > 1000 ppm 95 - 105
5. > 100 ppm 90 - 107
6. > 10 ppm 80 - 110
7. > 1 ppm 80 - 110
8. > 100 ppb 80 - 110
9. > 10 ppb 60 - 115
10. > 1 ppb 40 - 120
Contoh metode standard adisi
Berat rata-rata tablet Aspirin yang mengandung
100 mg aspirin (etiket) = 300 mg. Rentang
spesifik : 80%, 100%, 120% dan setiap rentang
mengandung 70% analit contoh dan 30% baku
pembanding.

- Rentang 80% = 80% .100 mg = 80 mg aspirin.

70% analit = 70% . 80 mg = 56 mg aspirin =
(56/100) . 300 mg = 168 mg serbuk tab Aspirin.
Baku pembanding = 30% . 80 mg = 24 mg.
 Contoh metode standard adisi
(Lanjutan)
- Rentang 100% = 100% .100 mg = 100 mg aspirin.
70% analit = 70% . 100 mg = 70 mg aspirin =
(70/100) . 300 mg = 210 mg serbuk tab Aspirin.
Baku pembanding = 30% . 100 mg = 30 mg

- Rentang 120% = 120% .100 mg = 120 mg aspirin.

70% analit = 70% . 120 mg = 84 mg aspirin =
(84/100) . 300 mg = 252 mg serbuk tab Aspirin.
Baku pembanding = 30% . 120 mg = 36 mg
Contoh metode standard adisi
(Lanjutan)

Jadi berat serbuk tablet Aspirin dan baku

pembanding Aspirin yang harus ditimbang
adalah sebagai berikut :

Berat yang ditimbang Rentang % aspirin

No
( mg ) 80% 100% 120%
1. Serbuk tab. Aspirin 168 210 252
2. Baku pembanding 24 30 36
Contoh metode standard adisi (Lanjutan)

Tetapkan kadar contoh produk obat, misalnya

didapat B unit analit.
Baku pembanding analit yang ditambahkan ke
dalam contoh produk obat misalnya X unit.
Tetapkan kadar dari jumlah total analit,
misalnya didapat A unit analit.
Hitung % recovery ( R ) adalah
% Recovery ( R ) = [ ( A − B ) / X ] . 100 %
 SENSITIFITAS
1. Batas deteksi (LOD)
kadar terendah analit dalam contoh yang masih
dapat diteteksi, namun tidak harus kuantitatif.

2. Batas kuantitasi (LOQ)

kadar terendah analit dalam contoh yang masih
dapat ditetapkan kadarnya dengan presisi dan
akurasi yang masih dapat diterima.
 CARA PENETAPAN SENSITIFITAS

• Prosedur non instrumen

Contoh dengan konsentrasi yang diketahui dilakukan
analisa melalui evaluasi visual.
• Prosedur instrumen
– Rasio signal to noise: membamdingkan hasil uji contoh
yang mengandung analit dengan kadar rendah terhadap
hasil uji blanko
LOD = 3x noise LOQ = 10 x noise
– Berdasarkan simpangan baku respon analit dengan
slope kurva kalibrasi
Contoh penetapan sensitifitas
µg/ml
No Area (yi) (yi)topi [(yi)topi - (yi)] 2
Analit (xi)

1. 12.9 3910 4966.7 1116614.89

2. 25.7 7686 8767.5 1169642.25
3. 51.5 17875 16428.6 2092072.96
4. 102.9 33336 31691.3 2705038.09
5. 206.0 61759 62305.8 298990.24
6. 308.9 92103 92860.9 574412.41
7. 411.9 123794 123445.7 121312.89
Contoh penetapan sensitifitas
(Lanjutan)

No µg/ml Analit (xi) (xi) 2 [(xi)- (xrata2)] 2

1. 12.9 166.41 21629.5849
2. 25.7 660.49 18028.4329
3. 51.5 2652.25 11765.7409
4. 102.9 10588.41 3256.9849
5. 206.0 42446.0 2118.7609
6. 308.9 95419.21 22180.1449
7. 411.9 169661.61 63468.7249
(xrata2) = 159.97 ∑ = 321584.38 ∑ = 142448.3743
Contoh penetapan
sensitifitas (Lanjutan)
Koefisien korelasi = r = 0.9996786 ≈ 0.99968
Persamaan regresi : y = a + b x = 1136.16 + 296.94 x
(yi)topi didapat dari persamaan regresi, misalnya untuk
x = 12.9 maka (yi)topi = [1136.16] + [(296.94).( 12.9)]
Sy/x 2 adalah variansi variabel respon (y)
Sy/x = √ ∑ [(yi)topi - (yi)] 2 / N – 2

Sa adalah simpangan baku dari intersept (a)

Sa = S y/x . √ ∑ xi 2 / N ∑ ( xi – x rata-rata ) 2
Contoh penetapan sensitifitas
(Lanjutan)
Menurut Miller : LOD = 3 . Sy/x / b
LOQ = 10 . Sy/x / b

Menurut IUPAC : LOD = 3 . Sa / b

LOQ = 10 . Sa / b
Dari data didapat :
Menurut Miller : Menurut IUPAC :
LOD = 12.84 µg/ml LOD = 7.29 µg/ml
LOQ = 42.81 µg/ml LOQ = 24.31µg/ml
SPESIFISITAS / SELEKTIFITAS
 Spesifisitas : Kemampuan metode analisis membe
dakan suatu analit yang ditetapkan dari kompo nen
lain yang berada dalam matriks contoh.

 Selektifitas : Kemampuan metode analisis memberi

kan signal analit pada campuran analit dalam
contoh tanpa adanya interaksi antar analit.

 Metode selektif merupakan seri metode spesifik.

 Prosedur spesifisitas tergantung pada tujuan
penggunaan prosedur analisis.
Spesifisitas / Selektifitas (Lanjutan)

 Metode yang memiliki kespesifikan rendah, dapat

berakibat pada analisa kualitatif akan terjadi
kekeliruan positif (positive false) dan pada analisa
kuantitatif akan terjadi hasil pengujian lebih besar
dari sebenarnya.

 Contoh metode yang memiliki kespesifikan tinggi

adalah penetapan logam dalam berbagai matriks
sampel secara Spektrofotometri Serapan Atom
(AAS).
CARA PENETAPAN SPESIFISITAS
 Untuk uji identifikasi dan penetapan kadar :
Contoh blangko dan contoh yang ditambah
sejumlah analit untuk mengetahui tidak adanya
gangguan dari komponen lain (produk hasil urai,
metabolit, senyawa aditif dll) dalam contoh
terhadap analit.

 Untuk uji kemurnian :

- Cemaran/impurity tersedia
- Cemaran/impurity tidak tersedia
Cara penetapan Spesifitas ( Lanjutan )

 Cemaran / impurity tersedia : dibandingkan hasil

uji contoh yang mengandung cemaran dengan
contoh tanpa cemaran. Spesifisitas merupakan
derajat bias / penyimpangan perbedaan hasil uji
tersebut.

 Cemaran/impurity tidak tersedia : diuji kemurnian

contoh misalnya secara kemurnian kromatografi.
Uji kemurnian puncak menunjukkan puncak
analit yang tidak diakibatkan oleh lebih dari satu
komponen / komponen lain.
 LINIERITAS
 Definisi : kemampuan untuk menghasilkan hasil uji yang
sebanding / berbanding lurus terhadap konsentrasi analit
dalam contoh pada kisaran konsentrasi tertentu.
 Cara penetapan :
• Ditetapkan terhadap min. 6 konsentrasi pada rentang 50
– 150 % dari kadar analit.
• Hitung regresi linier dan koefesien korelasi (R)
• Harga R menunjukkan linieritas.
Kriteria : R > 0.997 (bahan aktif)
R > 0.98 (cemaran / impurity)
 RANGE / RENTANG

• Kemampuan untuk memperoleh hasil uji yang

kadar analitnya masih linier dengan presisi dan
akurasi yang masih dapat diterima.
• Ditetapkan bersamaan dengan penetapan linieritas
dengan melakukan pengujian terhadap contoh
yang kadarnya dibawah dan diatas normal.
• Buat kurva regresinya dan tentukan batas bawah
dan batas atas dari kadar analit yang masih
memberikan garis linier.
 RUGGEDNESS / KEKASARAN

 Definisi : kemampuan untuk memberikan hasil uji

yang sama pada contoh yang sama, tetapi keragaman
kondisi pengujian berbeda.
 Tujuan: untuk mengetahui pengaruh faktor eksternal
terhadap metode (contoh dan metode sama, tetapi
laboratorium, alat, analis dan waktu pengujian
berbeda).
 Cara penetapan : melakukan uji kolaborasi antar
labotorium, lalu membandingkan presisi dan akurasi
dari hasil uji antar laboratorium tersebut.
ROBUSTNESS / KETAHANAN

• Definisi : ukuran kemampuan metode untuk tidak

terpengaruh oleh perubahan kecil dari parameter
metode yang sengaja dibuat.
• Tujuan : untuk mengetahui pengaruh faktor
internal terhadap metode (dilakukan sedikit
pengubahan pada metode seperti: kecepatan laju
alir pada kolom, komposisi fase gerak, suhu
kolom, lama penguapan).
• Cara penetapan : membandingkan presisi dan
akurasi hasil yang diperoleh dengan hasil yang
dilakukan pada kondisi normal.
 Karakteristik validasi menurut
USP 27 dan ICH

Metode analisis memerlukan karakteristik

validasi, tergantung tujuan metode atau
jenis pengujiannya.

USP 27 dan ICH memberikan batasan yang

sama terhadap karakteristik validasi yang
diperlukan saat metode analisis divalidasi.
Karakteristik validasi menurut
USP 27
Uji kemurnian Uji
Karakteristik Ka Identi
Uji Performance
Validasi dar Kuantitatif fikasi
Batas karakteristik
Akurasi Yes Yes * * No
Presisi Yes Yes No Yes No
Spesifisitas Yes Yes Yes * Yes
LOD No No Yes * No
LOQ No Yes No * No
Linieritas Yes Yes No * No
Rentang Yes Yes * * No
Karakteristik validasi menurut ICH
Uji kemurnian
Karakteristik Identi Kuantitatif
Kuantitatif Uji (kadar,disolusi)
Validasi fikasi
Batas
Akurasi No Yes No Yes
Repeatabilitas No Yes No Yes
Presisi Antara No Yes # No Yes #
Spesifisitas $ Yes Yes Yes Yes
LOD No * Yes No
LOQ No Yes No No
Linieritas No Yes No Yes
Rentang No Yes No Yes
Karakteristik validasi (Lanjutan)

Keterangan Tabel :
* = mungkin diperlukan, tergantung jenis/sifat.
# = bila telah dilakukan reproduksibilitas, presisi
antara tidak perlu dievaluasi.
$ = metode analisis yang kurang spesifik, harus
ditunjang oleh metode analisis lain untuk
memperbaiki spesifisitasnya.
 Metode analisis yang
memerlukan validasi
 Metode analisis yang baru dikembangkan :
karakteristik unjuk kerja metodenya belum
diketahui (terkait dengan persyaratan dan
penggunaannya).
 Metode analisis yang dimodifikasi dan atau
diterap kan pada matriks / bentuk sediaan
yang berbeda.
 Metode baku dan metode resmi yang akan
diadopsi, tidak perlu divalidasi tetapi cukup
diverifikasi.
Metode analisis yang memerlukan
validasi (Lanjutan)

Verifikasi diperlukan karena :

- Data verifikasi sebagai bukti metode tersebut telah
sesuai dan memenuhi kebutuhan laboratorium.
- Adanya perbedaan dalam personel, instrumen,
pereaksi yang dipakai dalam metode baku dan
metode resmi dengan laboratorium yang akan
menggunakannya kecuali jika terhadap metode
tersebut dilakukan modifikasi dan atau dilakukan
dalam matriks yang berbeda.
 Pustaka :
• Harmita, 2004. Petunjuk Pelaksanaan
Validasi Metode Dan Cara Perhitungannya.
Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.3,
Desember 2004, 117 - 135
• Badan Standarisasi Nasional, 2017, SNI
ISO/IEC 17025:2017 merupakan standar
internasional persyaratan kompetensi untuk
laboratorium.
 SEKIAN DAN
TERIMA KASIH