KROMATOGRAFI

KOLOM VAKUM
DAN
KONVENSIONAL
 Kelompok 2
1. Nur Setyo (2013-258)
2. Rika Febriani (2014-
3. Irma Septin (2015-008)
4. Oktami (2015-097)
5. Nur Fadhilah (2015-131)
6. M Aditya N (2015-172)
7. Dyah Ervy P (2015-192)
8. Nofitasari (2015-205)
 Kromatografi
• Yaitu proses pemisahan yang tergantung pada perbedaan distribusi
campuran komponen antara fase gerak dan fase diam (Christian,
Kromatografi 1994).

• Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan yang didasarkan pada pemisahan daya
adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya.
Kromatografi (Kasiman,2006)
kolom

• Kromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode fraksinasi yaitu dengan
memisahkan crude extract menjadi fraksi-fraksinya yang lebih sederhana. Pemisahan tersebut
memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa geraknya dibantu dengan pompa
Vakum vakum. Fasa diam yang digunakan dapat berupa silika gel atau alumunium oksida
(Ghisalberti, 2008).
 Cara Pembuatan dengan Kromatografi Kolom
• Cara pembuatannya ada dua macam (Hargono,1986)
• Cara kering yaitu silika gel (fase diam) dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi
kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi (fase gerak) hingga seluruh kolom
terbasahi.
• Cara basah yaitu fase diam dibasahi dengan fase gerak hingga menjadi bubur di luar
kolom, dan kemudian dituangkan perlahan-lahan ke dalam kolom. Larutan bahan
organik diletakkan di bagian atas fasa diam menggunakan pipet. Lapisan ini biasanya
ditutup dengan lapisan kecil pasir atau katun atau wol kaca untuk melindungi bentuk
lapisan organik dari tuangan eluen. Eluen kemudian dialirkan perlahan melalui
kolom sambil membawa sampel bahan organik. .
Prinsip Kerja Kromatografi Kolom
 Prinsip Kerja Kromatografi Kolom
• Prinsip kerja kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan daya
serap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan
dalam sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan
mengalir kedalam zat menyerap. Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih
kuat sehingga turun lebih lambat dari senyawa non polar terserap lebih lemah
dan turun lebih cepat.
 Mendeteksi komponen yang dipisahkan
Kromatografi kolom yang konvensional tidak dilengkapi detektor, namun
sekarang dapat digunakan dengan mengalirkan eluate (efluen) pada detektor
untuk mendeteksi komponen. Yang umum digunakan dan mudah dikerjakan
adalah dengan memonitor fraksi dengan KLT. Fraksi yang mempunyai profil
bercak KLT yang mirip digabungkan. Selanjutnya gabungan ini dapat dianalisis
lebih lanjut.
 Fase Diam dan Fase Gerak
• Fase Diam : Fase diam atau penjerap dalam kromatografi kolom adalah zat padat. Fase diam
yang paling umum untuk kromatografi kolom adalah silika gel,diikuti dengan alumina,.
Ukuran partikel fase diam bisanya lebih besar dari ukuran partikel fase dian untuk KLT,
ukuran yang digunakan antara 63-250mikrometer.
• Fase Gerak : Fasa gerak atau eluen dapat berupa pelarut murni atau campuran pelarut.
Pemilihan fase gerak sangat menentukan berhasil tidaknya pemisahan. Untuk menentukan
fase gerak yang akan digunakan, dilakukan pendekatan:
- Penelusuran literature/pustaka.
- Mencoba dengan KLT. Cara ini dikerjakan dengan memilih fase diam KLT sejenis dengan
fase diam kolom yang akan digunakan. Biasanya dicoba dikembangfcan dengan fase gerak non
polar kemudian diikuti dengan fase gerak yang lebih polar.
 Elusi (pengembangan)
• Elusi isokratik yaitu selama proses elusi menggunakan fase gerak dengan
polaritas tetap.
• Elusi gradien (bertahap) yaitu selama proses elusi menggunakan fase gerak
berubah-ubah polaritasnya. Untuk membuat polaritas berubah-ubah maka
komposisi fase gerak berubah. Pada umumnya dimulai fase gerak non polar
kemudian berubah kepelarut yang polar. Perubahan ini dapat diprogramkan
sesuai dengan pemisahan yang diinginkan.
 Kromatografi Kolom Lambat
• Kelebihan
Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative.
Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran.
Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi.

• Kekurangan
Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual dan
membutuhkan waktu yang lama.
 Manfaat Kromatografi Kolom Konvensional

• Dalam bidang bioteknologi

Dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis obat baru.
• Dalam bidang klinikal
Dapat digunakan dalam menginvestigasi fluida badan, contohnya seperti air liur.
 Keuntungan dan Kerugian Kromatografi Cair
Vakum
• Keuntungan dari metode ini adalah prosesnya cepat dan senyawa tertarik
secara sempurna.
• Kerugiannya adalah pemisahanya tidak sempurna karena senyawa yang
ditampungbercampur dalam suatu penampungan tidak seperti pada kolom
konvensional yang dipisahkan berdasarkan warna, sehingga pemisahannya
lebih maksimal.
• sedangkan kekurangan metode ini adalah membutuhkan waktu yang cukup
lama (Hostettmann dkk, 1997).
 Manfaat Kromatografi Kolom Vakum
• Manfaat dari kromatografi ini yaitu menentukan ciri senyawa aktif penyebab
efek racun atau efek yang bermanfaat, yang ditunjukkan oleh ekstrak
tumbuhan kasar bila diuji dengan system biologi.
• Dalam hal ini kita harus memantau cara ekstraksi dan pemisahan pada setiap
tahap, yaitu untuk melacak senyawa aktif tersebut sewaktu dimurnihkan.
Kadang-kadang keaktifan hilang selama proses fraksinasi akibat
ketidakmantapan senyawa itu, dan akhirnya mungkin saja diperoleh senyawa
berupa kristal tetapikeaktifan seperti yang ditunjukkan oleh ekstrak asal
(Harborne,1987)
CONTOH JURNAL
 Metode Pengaplikasian
1. Metode Kromatografi Kolom Vakum dan
2. Kromatografi Kolom Lambat (Konvensional)
 METODE KROMATOGRAFI KOLOM VACUM

• Ekstrak kasar sebanyak 50,29 gram difraksinasi menggunakan n-heksana

menghasilkan ekstrak fraksi n-heksana kering sebanyak 11,255 gram. Fraksi n-
heksana tersebut kemudian dipisahkan menggunakan kromatografi kolom
cair vakum (KCV) menghasilkan 14 fraksi yang dikelompokkan menjadi 4
kelompok fraksi besar yaitu NHA, NHB, NHC dan NHD.
Pengelompokkan fraksi dilakukan berdasarkan kesamaan noda hasil elusi menggunakan
metode KLT

Gambar 1. Hasil fraksinasi metode KCV

sebanyak 14 fraksi yang dikelompokkan
menjadi 4
kelompok besar dengan eluen n-heksana:etil
asetat (8:2) diamati pada (1) sinar
tampak, (2) sinar UV 254 nm, dan (3) 366 nm
 Gambar 2. Hasil KLT 4 kelompok besar (A)NHA, (B)NHB, (C)NHC, (D)NHD
menggunakan eluen n-heksana:etil (8:2) diamati pada sinar UV 254 nm, dan 366 nm.
 METODE KROMATOGRAFI KONVENSIONAL

• Pemisahan dilanjutkan dengan menggunakan metode kromatografi kolom

konvensional. Fraksi yang dipisahkan yaitu NHB dan NHC, sedangkan
Fraksi NHA dan NHD memiliki berat yang terlalu sedikit untuk dilakukan
pemisahan sehingga sulit untuk dilakukan pemisahan lanjutan. Eluen yang
digunakan antara lain n-heksana:etil asetat (8:2) dan (7:3).
Gambar 3. Hasil KLT fraksi (1) NHB dan (2) NHC dengan eluen n-heksana:etil asetat (8:2)
diamati pada sinar tampak, sinar UV 254 nm, dan 366nm.
Hasil pengujian aktivitas antioksidan dan antibakteri fraksi-fraksi tersebut dapat
dilihat pada Tabel 1
Terdapat 2 fraksi yang memiliki baik aktivitas antioksidan maupun antibakteri
yaitu NHC1 dan NHC3.
• Berdasarkan hasil penelitian diketahui profil kromatografi senyawa
antioksidan dan antibakteri fraksi n-heksana daun Libo (Ficus variegata Blume.)
untuk memisahkan senyawa aktif antioksidan dan antibakteri diperoleh
melalui 2 metode pemisahan yaitu kromatografi kolom cair vakum (KCV)
dan kromatografi kolom konvensional (KK). Eluen yang digunakan untuk
menghasilkan pemisahan terbaik yaitu n-heksana:etil asetat dengan
perbandingan 8:2. Fraksi n-heksana daun Libo memiliki aktivitas antioksidan
dan antibakteri. Metabolit sekunder yang terkandung di dalam fraksi aktif
tersebut antara lain alkaloid, flavonoid, steroid/terpenoid.
 Kesimpulan
• Kromatografi kolom lambat • Kromatografi vakum
• Lebih akurat saat pemisahan • Banyak zat yang tertinggal di dalam
• Memakan waktu yang lebih lama kolom
• Memakan waktu yang lebih cepat
saat proses kromatografi
TERIMA KASIH…