KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Kromatografi Lapis Tipis-Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik, dimana

komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan diantara dua fase, salah satu fasa tersebut
adalah soatu lapisan stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang
mengalir lembut disepanjang landasan stasioner. Dalam teknik kromatografi zat-zat terlarut yang
dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom, atau seperti dalam kromatografi kertas atau lapis tipis,
ekivalen fisik kolom, dan tentu saja dasar pemisahan terletak pada laju perpindahan yang berbeda
untuk larutan yang berbeda (Khopkar, 2007).

Kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kertas (KKt) adalah metode kromatografi
cair yang paling sederhana yang akan disajikan. Karena di sebagian besar laboratorium KKt telah
diganti dengan KLT. Kromatografi Lapis Tipis dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai
selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, atau preparative. Kedua,
dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam
kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi (Gritter, Roy,J. 1991:107-108).

Kromatografi lapis tipis ( KLT ) dikembangkan oleh Izmailof dan Schaiber pada tahun
1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis.
Berbeda dengan kromatografi kolom yang mana fasa diamnya diisikan atau dikemas didalamnya,
pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada
permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, plat amilum atau dapat dikatakan
sebagai bentuk-bentuk terbuka dari kromatogarfi kolom (Anonim, 2009). Pada hakikatnya
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) melibatkan dua peubah, sifat fasa diam atau lapisan, dan sifat
fasa gerak atau campuran pelarut pengembang, fasa diam dapat berupa serbuk halus yang
berfungsi sebagai penyangga kromatografi cair-padat, atau berfungsi sebagai penyangga untuk
lapisan zat cair (kromatografi cair-cair), fasa diam pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT) sering
disebut penyerap (Day, 2002: 497). Fasa diam Kromatografi Lapis Tipis (KLT) terbuat dari serbuk
halus dengan ukuran 5-50 cm, serbuk halus ini dapat berupa suatu adsorbs, suatu penukar ion,
suatu pengayak molekul atau dapat merupakan penyangga yang dilapisi suatu cairan yang
membuat lapisan tipis menjadi bubur (slury), yang berair dari serbuk tadi. Zat pengikat seperti
gipz, barium sulfat, polivinil (Soebagio, 2003:87).

Menurut Gandjar dan Rohman( 2007), fase yang digunakan pada KLT yaitu:
1. Fase Diam
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan
diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin
sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja kromatografi lapis tipis dalam hal
efisiensi dan resolusinya. Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa,
sementara mekanisme sorpsi yang utama pada kromatografi lapis tipis adalah adsorpsi dan partisi.
2. Fase Gerak
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba
karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2
pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa
sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam
memilih dan mengoptimasi fase gerak :
a. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik
yang sensitif.
b. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-
0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
 c. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase
gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf.
Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar
seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
d. Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai fase
geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan
sedikit asam etanoat atau amonia masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang
bersifat basa dan asam.

Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan
sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur
kromatografi lain, jika sampel yang digunakan terlalu banyak akan menurunkan resolusi. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa penotolan sampel secara otomatis lebih dipilih daripada penotolan
secara manual terutama jika sampel yang akan ditotolkan lebih dari 15 µl. Tepi bagian bawah
lempeng lapis tipis yang telah ditotolkan sampel dicelupkan kedalam fase gerak kurang lebih 0,5-
1 cm. Tinggi fase gerak harus dibawah lempeng bertotol sampel.

Pertimbangan untuk memilih pelarut pengembang (eluen) umumnya sama dengan

pemilihan eluen untuk kromatografi adsorbs pengelusi eluen naik sejalan dengan polaritas misal
(heksana, aseton, alcohol dan air). Eluen pengembang dapat dapat berupa pelarut tunggal atau
campuran pelarut dengan susunan tertentu. Pelarut-pelarut pengembang harus mempunyai
kemurnian yang tinggi. Terdapatnya sejumlah kecil air atau zat pengotor lainnya dapat
menghasilkan kromatografi yang tidak diharapkan (Soebagio, 2003:88). Deteksi terhadap noda
yang timbul pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT) kadang-kadang lebih mudah dibandingkan
kromatografi kertas karena dapat dipakai cara-cara yang lebih umum. Untuk senyawa organic
dipakai cara menyemprot lempeng dengan asam sulfat kemudian dipanaskan dan timbul noda-
noda hitam. Cara ini adalah cara kualitatif (Tim dosen, 2010:13). Data yang diperoleh dari
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai
Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf dapat
didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa (Underwood,1986:286).
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan media dalam KLT yang juga mempengariuhi nilai Rf
yaitu (Surmono, 1986):
1. Struktur kimia dan senyawa yang sedang dipisahkan
2. Sifat dari penyerap dan derajat aktivitasnya
3. Suhu dan kesetimbangan
4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase gerak
5. Derajat kejenuhan