KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

I. TUJUAN :
Setelah praktikum diharapkan mahasiswa dapat :
1. Mengetahui tentang cara pembuatan KLT
2. Memahami fungsi penggunaan KLT dalam bidang fitokimia
3. Mampu mengaplikasikan cara analisiskandungankimia dari simplisia menggunkan metode
KLT

II. TEORI
Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode yang paling cocok untuk
menentukan dan analisis obat di laboratorium farmasi, metode ini hanya memerlukan investasi
yang kecil untuk perlengkapan, menggunakanwaktu yang singkat untuk menyelesikan analisis
(15- 60 menit) dan memerlukan cuplikan yang sangat sedikit (kira – kira 0,1g)

1. Definisi dan Prinsip KLT

Kromatografi lapis tipis ialah metode pemisahan fisikokimia.lapisan yang memisahkan
yang terdiri dari bahab berbutir – butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa
pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang dipisahkan, berupa larutan,
titotolkan berupa bercak atau pita (awal). Setelah pelat atau lapisan ditaruh didalam
bejana tertutup rapat (chamber) yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak),
pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan), selanjutnya yang tidak
bewarna harus ditampakkan (dideteksi)

2. Kondisi Baku

a) Fase Diam (Lapisan penyerap)

Lapisan dibuat dari salah satu penyerap khusus yang digunakan untuk KLT yang
diproduksi oleh berbagai perusahaan, panjang lapisan tersebut 20cm dengan lebar 20
cm atau 10 cm. untuk analisis tebalnya 0,1 – 0,3mm, biasanya 0,2 mm, sebelum
digunkan, lapisan disimpan dalam lingkunagn yang tidak lembab dan bebas dari uap
lanoratorium. Penyerap yang umum digunakan silica gel, alumunium oksida, kieselgur,
selulosa dan turunannya, poliamida dan lain – lain.
 b) Fase gerak (Larutan pengembang/ Laruta eluasi)
Fase gerak adalah media angkut dan terdiri dari satu atau beberapa pelarut, ia
bergerak di dalam fase diam, yaitu lapisan berpori, karena adanya gaya kapiler. Angka
banding campuran senderhana atau multi komponen pelarut dinyatakan dalam bagian
volume sedemikian rupa sehingga volume total 100.

III. BAHAN DAN ALAT

Bahan
 Silika gel G atau GF 254
 Air suling
 N – heksana
 Etil asetta
 Anisaldehida
 Asam Sulfat
 Serbuk simplia piper nigri fructus
 Methanol
 Alat
 Oven
 Pelat kaca ukuran 20 x 20 cm
 Erlenmeyer
 Tabung reaksi
 Plat KLT
 Pipa Kapiler
 Chamber
 Lampu UV

IV. CARA KERJA

1) Lempeng KLT
a) Lapisan Fase diam Silika gel GF 254
b) Pelat KLT siap pakai

2) Pengembang (fase gerak)

Penjenuhan bejana n – heksana + etil asetat (65 : 35)
 3) Deteksi
 1100C 5 mnt
Pereaksi Anisaldehida –Asam Sulfat disemprot periksa dgn UV

4) Larutan Cuplikan

Totolkan
Kocok Kuat pd A dan B
0,5 Simplisia  + 1m methanol ambil filtrate A B

V. HASIL PENGAMATAN
VI. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini dilakukan analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan senyaw
yang akan dianalisa adalah serbuk simplisia Piper nigri fructus. Piper nigri fructus merupakan
senyawa yang non polar sehingga fase gerak yang digunakan (eluen) adalah n-heksan - etil
asetat ( 65 : 35 ), fase diam yang digunakan adalah lapis tipis silica gel GF 254 yang tersebar
merata pada lempeng alumunium yang keras.
Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang
mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau
campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan warna yang
merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan dan isolasi pigment tanaman
yang berwarna hijau dan kuning.
Setelah dilakukan penotolan sampel pada titik awal maka Ketika pelarut mulai
membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan senyawa-senyawa dalam bercak yang
telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan cenderung bergerak pada
lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut. Bagaimana cepatnya
senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan, tergantung pada:
o Kelarutan senyawa dalam pelarut / eluen ( fase gerak ). Tergantung pada besar atraksi
antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
o Senyawa melekat pada fase diam, yaitu pada silica gel. Tergantung pada bagaimana
besar atraksi antara senyawa dengan silica gel.
Sebagaimana telah kita ketahui bahwa silica gel adalah bentuk dari silikon dioksida
(silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar.
Namun, pada permukaan silica gel, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.Jadi, pada
permukaan silica gel terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si.
Permukaan silica gel sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan
hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der
Waals dan atraksi dipol-dipol.. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-
aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita
sebutkan tentang silica gel kemudian digunakan serupa untuk alumina.
Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada silica gel lebih kuat
dibanding senyawa lainnya hanya dapat mengambil bagian interaksi van der Waals yang lemah.
Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penjerapan
merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan.
Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut
dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara
senyawa dengan silica gel. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang
penting-hal ini akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar
dari permukaan silika.
Dari hasil pengamatan dapat kita lihat bahwa ikatan antara sampel Piper nigri fructus
dengan permukaan silica gel tidak terlalu kuat, dan kelarutannya dengan pelarut juga baik, hal
ini dibuktikan dengan mudahnya senyawa dibawa oleh pelarut / fase gerak menuju keatas yang
dilihat dengan harga Rf.
Penyerapan pada kromatografi lapis tipis bersifat tidak permanen, terdapat pergerakan
yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan silica gel dan yang kembali pada
larutan dalam pelarut.
Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu
terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada silica gel , maka untuk sementara waktu
proses sampai proses penjerapan berhenti, pelarut akan bergerak tanpa senyawa. Itu berarti
bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.
Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik
ketika kita membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu
dengan baik termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut.
FUNGSI PENYEMPROTAN PEREAKSI ASAM SULFAT PEKAT 10 % dalam METANOL
Pada saat lempeng kromatografi dimasukkan dalam chamber, kemudian fase gerak
mengelusi senyawa Piper nigri pada fase diam maka dapat bercak - bercak ( spot ) yang akan
dianalisa tidak tampak dengan jelas atau hamper tidak berwarna. Untuk membuat bercak-
bercak menjadi tampak maka kita dapat mereaksikannya dengan zat kimia sehingga
menghasilkan produk yang berwarna. Dalam hal ini pereaksi yang kita gunakan adalah asam
sulfat pekat 10 % dalam methanol. Kromatogram dapat dikeringkan setelah disemprotkan
dengan larutan asam sulfat. Asam sulfat akan bereaksi dengan senyawa Piper nigri fructus
menghasilkan warna hijau kekuningan.
Disamping itu, fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi
yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar
ultraviolet (UV). Itu berarti jika menyinarkannya dengan sinar UV, akan berpendar.
Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun
bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa
menyinarkan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan
posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, dan tandai posisi-posisi dari bercak-
bercak dengan menggunakan pinsil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Seketika kita
mematikan sinar UV, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali.
KROMATOGRAM
 Untuk membuat sebuah kromatogram maka dapat dilakukan dengan cara : Sebuah garis
menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dengan jarak 2 cm dari dasar
lempeng. Kemudian setetes pelarut dari serbuk Piper nigri ditempatkan pada garis itu. Diberikan
penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini
dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram
dibentuk. Maka dari itu digunakan pensil untuk pembuatan garis dan penandaan.
Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam chamber
bertutup berisi pelarut n-heksan - etil asetat ( 65 : 35 ) dalam jumlah yang tidak terlalu banyak.
Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada.
Alasan untuk menutup chamber adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam
chamber terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam chamber
ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam chamber
dengan uap pelarut adalah untuk mencegah penguapan pelarut.
Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda
dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai
perbedaan bercak warna.
Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan memberikan
pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari
pelarut dan fase diam.

VII. KESIMPULAN
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi
senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya . Kromatografi juga merupakan analisis cepat
yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya yag dapat
digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida
dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas.
Pelaksanaan kromatografi lapis tipis bisa digunakan dengan kromatogram atau
perhitungan Rf atau pengidentifikasian senyawa-senyawa. Pelaksanaan kromatografi biasanya
digunakan dalam pemisahan pewarna yang merupakan sebuah campuran dari beberapa zat
pewarna. Jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh
dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul.
 Agar spot - spot yang dihasilkan tampak lebih jelas maka dapat dilakukan dilakukan
penyemprotan pereaksi yang sesuai. fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali
memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika
diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti jika menyinarkannya dengan sinar UV, akan
berpendar.

VIII. DAFTAR PUSTAKA