PERCOBAAN II

Kromatografi Lapis Tipis ( K . L . T )

I. Tujuan

Adapun tujuan dari percobaan ini, yaitu :

 Mempelajari salah satu metode pemisahan komponen-komponen dalam

suatu bahan.

II. Dasar Teori

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas

perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara
dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).
Pemisahan campuran dengan cara kromatografi didasarkan pada perbedaan
kecepatan merambat antara partikel-partikel zat yang bercampur pada medium
tertentu. Dalam kehidupan sehari-hari pemisahan secara kromatografi dapat
kita temui pada rembesan air pada dinding yang menghasilkan garis-garis
dengan jarak ternentu. Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka
dikenal istilah kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila
fase diam berupa zat cair, maka teknik ini disebut kromatografi pembagian
(partition chromatography).
Pemisahan KLT dikembangkan oleh Ismailoff dan Schraiber pada tahun
(1938). Tekniknya menggunakan penyokong fase diam berupa lapisan tipis
sepreti lempeng kaca, aluminium atau plat inert. Prinsip kerjanya memisahkan
sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang
digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat silika
dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan.
Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin
dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin
terbawa oleh fase gerak tersebut. Derajat retensi pada kromatografi lempeng
biasanya dinyatakan sebagai factor resensi (RF).
 Pada fase gerak, pada proses serapan, yang terjadi jika menggunakan silika
gel, alumina dan fase diam lainnya, pemilihan pelarut mengikuti aturan
kromatografi kolom serapan. System tak berair paling banyak digunakan dan
contoh pelarut organik dalam seri pelarut mikroskop diberikan dalam Tabel
25, yang meliputi (sifat hidrofob menaik) methanol, asam asetat, etanol,
aseton, etil asetat, eter, kloroform (perlu diperhatikan pada kloroform yang
distabilkan dengan etanol) benzene, sikloheksana, dan eter petroleum.
KLT mempunyai beberapa kelebihan, yaitu:
1. Waktu pemisahan lebih cepat.
2. Sensitive, artinya meskipun jumlah cuplikan sedikit masih dapat
dideteksi.
3. Daya resolusinya tinggi, sehingga pemisahan lebih sempurna.

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ini mirip dengan kromatografi kertas,

hanya bedanya kertas digantikan dengan lembaran kaca tau plastik yang
dilapisi dengan lapisan tipis adsorben seperti alumina, silike gel, selulosa atau
materi lainnya. Lapisan tipis adsorben pada proses pemisahan berlaku sebagai
fasa diam. Kromatografi lapis tipis lebih bersifat reproduksibel ( bersifat boleh
diulang) dari pada kromatografi kertas.
Sebagai fasa diam dalam KLT berupa serbuk halus dengan ukuran 5 – 50
mikrometer. Serbuk halus ini dapat berupa adsorben penukar ion. Bahan
adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan gel, alumina, dan serbuk selulosa.
Partikel silica gel mengandung gugus hidrosil dipermukaannya yang akan
membentuk ikatan hydrogen dengan molekul – molekul pokar.
Untuk membuat lapisan tipis pada KLT perlu dibuat bubur (slurry) ber air
dari serbuk halus tadi. Zat pengikat dapat menggunakan gips, barium sulfat,
polivenil alcohol atau kanji perlu ditambahkan, untuk membantu peletakan
lapisan tipis pada penyangga. Bubuk halus ini kemudian ditebarkan pada
papan penyangga (kaca, plastik atau aluminium), secara merata sehingga
diperoleh ketebalan lapisan 0,1 – 0,3 mm. lapisan tipis adsorben diaktifkan
dengan pengeringan didalam oven pada suhu 100 oC selama beberapa jam.
(Anonim. 2009)
Sifat umum penyerap-penyerap untuk kromatografi lapis tipis adalah
mirip dengan sifat- sifat penyerap untuk kromatografi kolom. Dua sifat
penting dalam penyerap adalah besar partikel dan homogenitasnya karena
adhesi terhadap penyokong sangat tergantung kepada keduanya.
Harga Rf merupakan karateristik kromatografi kertas dan kromatografi
lapis tipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa
pada kromatogram dan pada kondisi konstan merupakan besaran karakteristik
dan reprodusibel. Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak
senyawa dari titik awal dan titik tepi muka pelarut dari awal.
Jarak yang digerakkan oleh senyawa dari titik asal
Harga Rf =
Jarak yang digerakkan oleh pelarut dari titik asal

Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu pelarut,suhu,ukuran

dari bejana,kertas dan sifat dari campuran. (Khopkar, S. M. 1990)
III. Alat Dan Bahan

Adapun alat dan bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah
sebagai berikut :

A. Alat.
1. Pipa kapiler
2. Chamber
3. Gelas kimia 100 mL
4. Gunting
5. Kertas saring
6. Pipet tetes.
7. Pensil
8. Erlenmeyer 100 mL
9. Semprotan
10. Tissue
11. Mistar
12. Aluminiumfoil

B. Bahan.
1. Larutan Ninhidrin
2. Ekstrak metanol kembang merah
3. Eluen BBA ( n-butanol:asam asetat:air, 4:1:5)
4. Sampel asam amino ( Glysin’dan sistein )
5. Plat TLC/Plat KLT.
IV. Prosedur Kerja

Adapun prosedur kerja yang kami lakukan pada percobaan ini adalah
sebagai berikut:

A. Penjenuhan eluen
1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Memasukkan eluen ke dalam chamber
3. Menjenuhkan eluen selama 30 menit dengan cara memasukkan kertas
saring dengan rapat.
B. Proses KLT sampel
a) Ektrak bunga kembang merak merah.
1. Menyiapkan plat yang digunakan yakni silika gel
2. Menotolkan sampel (ekstrak bunga kembang merak merah) sebanyak
4 kali pada plat
3. Memasukkan plat kedalam chamber yang telah disediakan pada tahap
awal
4. Membiarkan proses elusi terjadi selama ± 15 menit sampai terjadi
proses penyerapan sampel.
5. Mengeluarkan sampel dan mengidentifikasinya
b) Asam amino
1. Menyiapkan plat yang digunakan yakni silika gel
2. Menotolkan sampel (Asam amino) sebanyak 4 kali pada plat
3. Memasukkan plat kedalam chamber yang telah disediakan pada tahap
awal.
4. Membiarkan proses elusi terjadi selama ± 15 menit sampai terjadi
proses penyerapan sampel.
5. Mengeluarkan sampel dan mengidentifikasinya.
V. Hasil Pengamatan

Adapun hasil pengamatan yang diperoleh dalam percobaan ini adalah

sebagai berikut :

NO PERLAKUAN HASIL PENGAMATAN

1. Asam amino  Terdapat satu komponen berwarna
ungu Rf = 0,771

2. Ekstrak bunga kembang

merak
A. Sebelum diuapkan  Terdapat dua komponen
dengan NH3  Komponen I : Ungu
 Komponen II : Kuning

B. Setelah diuapkan  Terdapa dua komponen

dengan NH3  Komponen I : Ungu
Rf = 0,945
 Komponen II: Kuning
Rf = 0,243
VI. Reaksi

O O
O
H O
OH

OH + NH 2 OH N

H
O O
O
Ninhidrin Glisin anion
Ungu
O O
H H
OH H2O
OH + NH 2 COOH N COOH

H H
O O
Ninhidrin O O
H H
- CO 2 - H2O
H N H +
N H
Penataan ulang HCHO
O O
O

O O O O
O
+
H
O - -
H N H N
H2O
O O O O
Biru violet
VII. Perhitungan
Berdasarkan hasil pengamatan dari percobaan ini maka dilakukan
perhitungan sebaga berikut :

Jarak yang digerakkan oleh senyawa dari titik asal

Harga Rf =
Jarak yang digerakkan oleh pelarut dari titik asal

1. Rf ekstrak methanol bunga kembang merak merah

Diketahui :
Jarak komponen I = 2,7 cm
Jarak komponen II = 3,3 cm
Jarak eluen = 3,5 cm

Ditanya : Rf komponen 1 dan 2 = ...?

Penyelesaian :

 Komponen I
2,7 𝑐𝑚
Rf =
3,5 𝑐𝑚
= 0,771

 Komponen II
3,3 𝑐𝑚
Rf =
3,5 𝑐𝑚
= 0,945
2. Asam amino
Diketahui :
Jarak komponen : 0,9 cm
Jarak eluen : 3,7 cm

Ditanya : Rf = ...?

Penyelesaian :
0,9 𝑐𝑚
Rf =
3,7 𝑐𝑚
= 0,243
VIII. Pembahasan
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas
perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara
dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).
Pemisahan campuran dengan cara kromatografi didasarkan pada perbedaan
kecepatan merambat antara partikel-partikel zat yang bercampur pada
medium tertentu.Pada percobaan kali ini digunakan meode kromatografi
lapis tipis. kromatografi Lapis Tipis (KLT) ini mirip dengan kromatografi
kertas, hanya bedanya kertas digantikan dengan lembaran kaca tau plastik
yang dilapisi dengan lapisan tipis adsorben seperti alumina, silike gel,
selulosa atau materi lainnya. Lapisan tipis adsorben pada proses pemisahan
berlaku sebagai fasa diam. Kromatografi lapis tipis lebih bersifat
reproduksibel ( bersifat boleh diulang) dari pada kromatografi kertas.
Perbedaan nyatanya terlihat pada fase diamnya atau media pemisahnya,
yakni digunakan lapisan tipis adsorben sebagai pengganti kertas. Bahan
adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan silika gel, alumina dan serbuk
selulosa. Partikel selika gel mengandung gugus hidroksil pada
permukaannya yang akan membentuk ikatan hidrogen dengan molekul polar
air. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung
substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase
gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai (Roy J, 1991).

Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan

kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini
biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya
disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau
campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat
kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa
oleh fase gerak tersebut. Derajat retensi pada kromatografi lempeng
biasanya dinyatakan sebagai factor resensi (RF). Nilai Rf sendiri dapat
ditentukan dengan :
 Jarak yang digerakkan oleh senyawa dari titik asal
Harga Rf =
Jarak yang digerakkan oleh pelarut dari titik asal

Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu

pelarut,suhu,ukuran dari bejana,kertas dan sifat dari campuran.
Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip yang sama.
Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau
cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase
gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen - komponen dari
campuran bersama-sama. Komponen - komponen yang berbeda akan bergerak pada
laju yang berbeda pula.
Pada percobaan ini bertujuan untuk mempelajari salah satu metode
pemisahan komponen komponen dalam suatu bahan.Pada percobaan ini,
tahapan yang terjadi dapat diuraikan dalam 3 tahap penting yaitu penotolan
pengembangan dan teknik elusi tehnik elusi sendiri terbagi atas 2 jenis
berdasarkan proses pengenbangnya yaitu ascending (naik) dan descending
(turun).
Pada percobaan ini ada tiga tahap yang akan dilakukan yaitu
penjenuhan eluen, proses KLT sampel bunga kembang merak., dan yang
terakhir yaitu proses KLT sampel asam-asam amino. Pada proses KLT
dengan menggunakan sampel ekstrak bunga kembang merak dilakuan
beberapa tahap. Diawali dengan mengukur atau membuat garis dan
menemukan titik potong untuk tempet penotolan. Selanjutnya jika sudah
menemukan maka daerah penotolannya di atas garis tersebut. Kemudian
menotolkan sampel yaitu ekstrak bunga kembang merak pada plat sebanyak
4 kali. Kemudian jika penotolan telah selesai masukkan plat kedalam
chamber yang berisi eluen. Proses berikutnya dari kromatografi lapis tipis
adalah tahap visualisasi. Tahapan ini sangat penting karena diperlukan
suatu keterampilan dalam memilih metode yang tepat karena harus
disesuaikan dengan jenis sampel yang sedang di uji. Pada percobaan ini
lakukan penyemprotan dengan larutan ninhidrin pada sampel asam
amino. Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione) adalah suatu larutan
yang digunakan untuk mendeteksi adanya gugus amina. Dan setelah
dilakukan penyemprotan ternyata pelat yang berisi campuran asam amino
memberikan warna ungu. Hal ini karena asam amino memiliki gugus amina.
Dari hasil pengidentifikasian sebelum diuapkan dengan larutan NH3
diperoleh dua komponen. Komponen pertama berwarna ungu sedangkan
komponen kedua berwarna kuning. Selanjutnya diuapkan dengan larutan
NH3 dan terdapat dua komponen. Akan tetapi komponen pertama berubah
warnaang tadinya sebelum diupakan dengan larutan NH3 berwarna ungu
setelah diuapkan mejadi warna biru dengan nilai Rfnya 0,943. Komponen
kedua tidak terjadi perubahan warna ketika diaupakan dengan NH3 yaitu
berwarna kuning dengan nilai Rfnya 0,243.
Tahapan selanjutnya yaitu proses KLT dengan menggunakan sampel
asam-asam amino ada beberapa perlakuan untuk membuat plat. Mengukur
atau membuat garis dan menemukan titik potong untuk tempet penotolan.
Selanjutnya jika sudah menemukan maka daerah penotolannya di atas garis
tersebut. Kemudian menotolkan sampel yaitu asam amino pada plat
sebanyak 4 kali. Kemudian jika penotolan telah selesai masukkan plat
kedalam chamber yang berisi eluen. Disinilah terjadi proses elusi dimana
proses elusi menggunakan dua teknik. Dan metode yang terlihat pada perose
elusi ini yaitu teknik ascending ( menaik) dimana fase gerakanya bergerak
keatas. Hal ini dipengaruhi oleh efek kapiler. Proses slanjutnya yaitu
mengeluarkn plat dari dalam chamber kemudian identifikasi komponen
dengan cara dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin.
Ninhidrin akan bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa -
senyawa yang berwarna, umumnya coklat atau ungu. Pada perobaan ini
diperoleh satu komponen yaitu berwarna ungu.
Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak
bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat
membandingkan dua sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi
yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang polar dan
berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis.
Pada pengujian dengan metode kromatografi lapis tipis ini, metode
elusi yang digunakan adalah metode elusi ascending. Metode ini adalah
metode ilusi yang memanfaatkan daya kapilaritas pada permukaan plat lapis
tipis.
Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada
lempengan, tergantung pada:
 Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini bergantung pada
bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan
pelarut.

 Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Hal ini
tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan silika
gel.

Dengan adanya daya kapilaritas pada lapisan plat yang digunakan

maka aliran fasa gerak yang membawa komponen-komponen sampel akan
merembes ke atas. Pada proses rembesan inilah terjadi pemisahan
komponen pada sampel. Penyerapan bersifat tidak permanen, terdapat
pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terserap pada permukaan
silika gel dan yang kembali pada larutan dalam pelarut Senyawa yang dapat
membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada silika gel lebih kuat
dibanding senyawa lainnya. Kita mengatakan bahwa senyawa
ini terserap lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penyerapan merupakan
pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan.
Permukaan silika gel sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat
membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai
disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der waals dan atraksi dipol-
dipol.

Pada percobaan ini, pemisahan komponen dapat dilihat dari

penampakan noda, penampakan noda dilakukan dengan menyemprotkan
larutan inhidrin. Larutan disemprotkan bukan direndam agar saat larutan
bereaksi dengan komponen sampel baik pada ekstrak kembang merak
maupun pada asam amino maka tidak terjadi lagi proses perembesan dan
pelepasan komponen pada plat KLT.
IX. Kesimpulan

Berdasarkan tujuan dan hasil pengamatan maka diperoleh kesimpulan

yaitu metode untuk memisahkan komponen-komponen dalam suatu bahan
adalah kromatografi lapis tipis (KLT), pada sampel asam amino
memisahkan 1 komponen berwarna ungu dan pada sampel ekstrak metana
kembang merak memisahkan 2 komponen berwarna biru dan kuning.
 Daftar Pustaka

Anonim. 2009.http://greenhati.blogspot.com/2009/01/kromatografi-lapis-
tipis.html . diakses 15 Mei 2013.

Anonim. 2010. http://www.jejaringkimia.web.id/2009/12/ Kromatografi lapis

tipisi.html (diakses pada tanggal 14 mei 2013)

Khopkar, S. M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia Press.

Jakarta.

Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar Kromatografi.

Penerbit ITB. Bandung.

Penanggung Jawab Mata Kuliah Dasar-Dasar Kimia Analitik. 2012. Pemisahan

Analitik. Untad Press. Palu.