Training Teknik Pembacaan

Kromatogram (Spektrofotometer
UV-Vis, HPLC, GC, AAS)
Wiwin Mujiati
Minggu, 3 Desember 2023
DAFTAR ISI
Pengenalan Prinsip Kerja
Instrumen 1

Preparasi Sampel 2

Pembacaan dan interpretasi hasil 3

Teknik analisis kualitatif dan

4
kuantitatif

Contoh Pembacaan
5
Kromatogram
Perkenalan Diri
PROFIL
Nama : Wiwin Mujiati
Tempat, tanggal lahir : Cilacap, 24 Juli 1998
No HP : 0895612957964
Email : wiwinmujiati72@gmail.com

RIWAYAT PENDIDIKAN
2016 – 2020 : Sarjana Kimia
Institut Teknologi Bandung

RIWAYAT PEKERJAAN
Desember 2020 – sekarang : Sales Support
PT Wiralab Analitika Solusindo
Bagian 1.

Pengenalan Prinsip Kerja Instrumen

Bagian 1.

Spectrofotometer UV-Vis
Pengenalan Prinsip Kerja Instrumen
Bagian 1. Definisi

SPEKTROFOTOMETRI
• Suatu metode analisis instrumental berdasarkan pada interaksi radiasi elektromagnetik
dengan materi (sampel)

SPEKTROFOTOMETER
• Alat atau instrument yang digunakan untuk mengukur jumlah cahaya yang diserap

SPEKTROFOTOMETRI UV VIS
• Metode analisis menggunakan radiasi UV (ultra violet) dan Vis (visible/tampak).
• Pada metoda ini, larutan sampel menyerap radiasi elektromagnetik (REM) dari sumber yang
cocok dan jumlah yang diserap berhubungan dengan konsentrasi analit dalam larutan.
Bagian 1. Radiasi Elektromagnetik

Setiap spesies
Suatu foton
Radiasi kimia
memiliki energi
Elektromagnetik mempunyai Jenis energy
tertentu dan
(REM) terdiri dari tingkat energi transisi pada
dapat
berkas sinar dari yang berbeda -> spektrum sinar
menyebabkan
partikel dimana transisi/perubah UV Vis adalah
transisi tingkat
partikel tersebut an energinya transisi
energi suatu
memiliki energi juga berbeda -> elektronik
atom atau
(foton) berguna untuk
molekul
identifikasi
Bagian 1. Spektrum Elektromagnetik

Tipe Radiasi Panjang Gelombang

Gamma-rays < 1 pm

X-rays 1 nm – 1 pm

Ultraviolet 400 nm – 200 nm

Visible 750 nm – 400 nm

Near-infrared 2.5 um – 750 um

Infrared 25 um – 2.5 um

Microwaves 1 mm – 25 um

Radio waves > 1 mm

 Bagian 1. Interaksi REM dengan Materi

Sinar yang diserap akan

ditransfer ke atom atau
molekul dalam sampel

Sinar Masuk
(REM) Sinar keluar
Bagian 1. Istilah dalam Spektrofotometri

Kromofor
1
Gugus fungsi yang menyerap atau mengabsorbsi radiasi elektromagnetik di daerah panjang gelombang
ultraviolet dan daerah cahaya tampak. Contoh kromofor : C=O, C=C, N=N dan NO2

Auksokrom
2 Gugus yang dicirikan oleh adanya pasangan electron bebas yang menempel secara langsung pada gugus
kromofor. Contoh gugus auksokrom : -OH, -OR, dan -NHR

Geseran batokromik (Bathochromic shift) atau geseran merah

3
Geseran atau perubahan panjang gelombang maksimum ke arah yang lebih besar. Penyebab terjadinya
peristiwa ini adalah adanya perubahan struktur, misalnya adanya auksokrom

Pergeseran hipokromik atau pergeseran biru

4 Geseran perubahan panjang gelombang maksimum ke arah yang lebih kecil. Munculnya gejala ini juga
disering disebabkan oleh adanya penghilangan auksokrom atau pergantian pelarut
Bagian 1. Istilah dalam Spektrofotometri
Bagian 1. Spektrofotometri UV Vis

Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri UV

adalah zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut tidak
berwarna, memiliki gugus kromofor dan atau auksokrom

Senyawa-senyawa organic sebagian besar tidak berwarna

sehingga spektrofotometer UV lebih banyak digunakan dalam
analisis senyawa organic

Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri

visible adalah zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut
berwarna. Jika tidak berwarna dengan cara memberi reagen
tertentu yang spesifik. Dikatakan spesifik karena hanya
bereaksi dengan spesi yang akan dianalisis.
Bagian 1. Spektrofotometri UV Vis

• Cahaya yang diserap oleh suatu zat

berbeda dengan cahaya yang
ditangkap oleh mata manusia.
• Cahaya yang tampak atau cahaya
yang dilihat dalam kehidupan
sehari-hari disebut warna
komplementer
 Bagian 1. Hukum Lambert Beer

T = I/I0
I : Intensitas cahaya setelah melewati sampel
I0 : Intensitas cahaya awal
Bagian 1. Hukum Lambert Beer

Hubungan linear antara absorbansi dengan

konsentrasi zat yang diserap

A = abc
A : Absorbansi
a : Molar absorptivity dalam L/[(mol)(cm)]
b : Panjang kuvet dalam cm

c : Konsentrasi sampel dalam (mol/L)

Bagian 1. Spektrofotometer UV Vis
UV-Vis operation uses a light source, a filter
(monochromspectrophotometerator), a sample vial and a
detector
Bagian 1.

HPLC/KCKT
Pengenalan Prinsip Kerja Instrumen
Bagian 1. What is Chromatography?

The IUPAC Definition of Chromatography

Chromatography is a physical method of separation, in which the

components to be separated are distributed between two phases, one
of which is stationary whilst the other moves in a definite direction.
Bagian 1. What is Chromatography?

1 2 3

Chromos: warna
Grafe: menulis Flow

Mikhail Tswett (1901) – used calcium

carbonate to separate plant pigments

Glass column
Stationary phase ‒ precipitated chalk
Mobile phase – petroleum ether/ethanol
Flow ‒ gravity
Bagian 1. Chromatography

• Chromatography is an analytical
Mixture of Compound
technique for separating compound in
a mixture Chromatography

• Chromatography uses two phases to

DOWN

separate the compounds :

1. Mobile phase
Separated, Individual Compound
- Liquid → HPLC
Data Analysis
- Gas → GC
2. Stationary phase
Solid - Column Identification and Quantification
Bagian 1. Chromatography Process

Continous stream of mobile phase

Column Stationary Phase Mobile Phase

• The stationary phase retains analytes due to various interactions.

• When different chemical components pass through the column at different rates
they become separated in single zones.
Bagian 1. HPLC Overview

1 Fasa Gerak

2 Pompa

3 Injektor/Autosampler

4 Kolom Compartment
Computer
5 Detektor with control software

6 Software
• System control
• Data acquisition
Bagian 1. HPLC Mode

There are four major separation modes that are used to separate most
compounds :

• Reversed-phase chromatography (most popular)

• Normal-phase and adsorption chromatography

• Ion exchange chromatography

• Size exclusion chromatography

 Bagian 1. HPLC Mode

1. Reverse Phase Chromatography

Principle : Partition of analytes between mobile phase and
stationary phase inside the pore space + adsorption on the
surface of bonded phase
• Nopolar (nonspecific) interaction of analytes with
hydrophobic adsorbent surface
• C18, C8, Phenyl, C3, etc
• Different sorption affinities between analytes results in
their separation
• More polar analytes retained less
• Analytes with larger hydrophobic part are retained longer
• Mobile phase : water (buffer) + water miscible organic
solvet, e.g. MeOH, ACN
• Water (buffer) + water miscible organic solvents, e.g
• Can be used for non-polar, polar, ionizable and ionic
molecules
• Gradient elution is often
 Bagian 1. HPLC Mode

2. Normal Phase Chromatography

Key Points
• Column packing is polar
• Silica (strongest) > amino > diol > cyano
(weakest)
• Mobile phase is non-polar
• Hexane, iso-octane, methylene chroride,
ethyl acetate, etc
• Retention decrease as polariy of mobile phase
increases

Reasons to choose normal phase

• Resolve strongly retained hydrophobic samples
• Isomer separation
• Sample injection solvent is non-polar
• Recovery in non-polar solvents is desirable
Separation of Nitroanilines on HPLC Column packed with
silica gel using hexane (mobile phase component A) mixed
with methylene chloride (mobile phase component B)
 Bagian 1. HPLC Mode

3. Ion Exchange Chromatography

In ion exchange :
• Column packing contains ionic groups, e.g
sulfonic, tetraalkylammonium
• Mobile phase is an aqueous buffer (e.g.
phosphate, formate, etc)
• Used infrequently
• Similarities to ion pair chromatography
• Well suited to the separation of inorganic,
organic anions and organic cations in
aqueous solution

Basic protein on strong cation exchanger (-SO3-)

1. RNA polymerase
2. Chymotrypsinogen
3. Lysozyme
 Bagian 1. HPLC Mode

4. Size Exclusion Chromatography (SEC)

• There are two modes :
• Non- aqueous SEC (sometimes termed Gel Permeation
Chromatography (GPC))
• Aqueous SEC (sometimes referred to as Gel Filtration
Chromatography (GFC))
• No interaction between the sample compounds and packing
material
• Molecules diffuse into pores of a porous medium
• Molecules are separated depending on their size relative to the
pore size • Gel Permeation Chromatogram of
• Molecules larger than the pore opening do not diffuse into the Polybutadiene polymer on no-aqueous
particles while molecules smaller than the pore opening enter SEC (GPC) column
the particle and are separated • Monomers elute after the polymer
• Large molecule elute first, smaller molecules elute later • Column : Plgel mixed-D gel
• The mobile phase is chosen mainly to dissolve the analyte • Mobile phase : Tetrahydrofuran (THF)
• Used mainly for polymer characterization and for protein
Bagian 1. Elution System

Isocratic
• An isocratic elution is defined as an elution system in which the
strength of the mobile phase is kept constant from the start to
the end of the analysis.
• In this system, elution is carried out with one type of solvent or
more than one type of solvent in a fixed ratio. For example
methanol : water = 50% ; 50% v/v.

Gradient
• Gradient elution is defined as the increase in mobile phase
strength during the chromatographic analysis.
• The gradient elution system can shorten the retention time of
the compounds which are firmly held in the column.
• In this system the elution is carried out with a mixed solvent
whose ratio changes over a certain time. For example methanol
: water = 40% : 60% v/v with an increase in methanol content of
8% every minute.
• The gradient can be paused or continued.
Bagian 1. Column Selection

• Phase
• Reverse Phase
• Normal Phase
• Others: Ion Exchange, Size
Exclusion…

• Length
• The longer the better separation
• The longer the more time spent

• Particle size
• The smaller the better separation
• The smaller the higher back pressure
Bagian 1. Column Selection

Column ID Flow Rate Technique

4.6 mm 1.0 mL/min Conventional HPLC
2.1 mm 200~300 µL/min Analytical HPLC
1.0 mm 40~50 µL/min Micro HPLC
300 µm 4~5 µL/min Capillary HPLC
150 µm 1~2 µL/min Capillary HPLC
75 µm 200 nL/min Nano HPLC
Bagian 1. Detektor

1 UV Vis Detector 4 Charge Aerosol Detector (CAD)

• Variable Wavelength Detector (VWD)
• Multiple Wavelength Detector (MWD)
• Diode Array Detector / Photo Diode Array
Detector (DAD/PDA)
2 Fluorescence Detector (FLD) 5 Evaporative Light Scattering
Detector (ELSD)

3 Reflaxtive Index Detector (RID) 6 Mass Spectrometry Detector (MS)

Bagian 1.

GC
Pengenalan Prinsip Kerja Instrumen
Bagian 1. GC Basic Theory

GC
GC

Semi-
Volatile
Volatile

Non-
Elemental
Volatile

AAS, ICP,
HPLC ICPMS etc
 Bagian 1. Principle

5.1. Chromatography | MOOC: Instrumental analysis of cultural heritage objects (ut.ee)

Bagian 1. Mobile Phase

Most common mobile phase gases are

N2, He or H2

• Nitrogen – Somewhat viscous

• Helium – Very inert
• Hydrogen – Best gas to use (explosive)

UHP (Ultra High Purity), 99,99%

Bagian 1. Column

I.D. ：0.53 mm－GC-FID－>3ml/min

0.32 mm－GC-MS－1~3ml/min
0.25 mm－GC-MS－0.5~1.5ml/min
Length ： The longer the better separation The longer the
more time waste (Length of the shopping street)

Film Thickness ：Choose thicker film when separating high volatile

sample (Density of the stores in the shopping street)

Phase Type ：Different sample type need different phase of packing

material (Type of stores in the shopping street)
Bagian 1. Injector

Name Phase Polarity

Non Polar
TG 1/ TG 1MS 100 % dimethyl polysiloxane

TG 5/ TG5 MS (5% phenyl) methyl polysiloxane

TG V1 Cyanopropylphenyl polysiloxane

TG 1701 (14% cyanopropylphenyl) polysiloxane

TG 35 MS (35% phenyl) polysilphenylene siloxane

TG 50 MS (50% phenyl) polysilphenylene siloxane
TG Wax/TG Wax MS
Polyethylene glycol
TG Fame (70% cyanopropylphenyl) polysiloxane Polar
Bagian 1. Column Temperature

Temp
Time Time

Isothermal Temperature Program

Bagian 1. Detector

FID TCD NPD

Flame Ionization Det Thermal Conductivity Det Nitrogen Phosphorus Det

ECD MS
FPD

Electron Capture Det Flame Photometric Det Mass Spectrometry

Bagian 1.

AAS
Pengenalan Prinsip Kerja Instrumen
Bagian 1. Spektroskopi
Spektroskopi Molekuler Spektroskopi Atomik

▪ Spesi : Molekul ▪ Spesi : Atom

▪ Metode : Spektroskopi UV/Vis dan ▪ Metode : AAS, AFS, AES dll
Spektroskopi Inframerah ▪ Suhu tinggi karena diperlukan untuk
▪ Suhu rendah atomisasi (pelepasan ikatan kimia)
▪ Fase gas, cair atau padat ▪ Fase gas
Bagian 1. Atomic Spectroscopy

• Absorption • Emission

• Fluorescence
Bagian 1. What is AAS?

Atomic Absorption Spectrophotometer

(AAS) is a instrument used in analytical
method for the determination of metallic
elements and matalloids
Bagian 1. Definisi Trace Elements

Dalam analytical chemistry, disebut Trace elements apabila memiliki

konsentrasi rata-rata kurang dari 100 bagian per juta (ppm) atau kurang dari
100 mikrogram per gram. (IUPAC Compendium of Chemical Terminology.)

Tingkatan Konsentrasi dalam Elemental analysis

trace components side main
components components

1 ppt 1 ppb 1 ppm 1‰ 1% 100 %

ppt (w/w) ppp (w/w) ppm (w/w) ‰ (w/w) % (w/w)

10-12 g/g 10-9 g/g 10-6 g/g 10-3 g/g 10-2 g/g
pg/g ng/g µg/g mg/g 0.01 g/g
ng/kg µg/kg mg/kg g/kg 10 mg/kg
Bagian 1. Overview

Free Atoms

Irradiated with Visible or UV light of a specific wavelength

Amount of light absorbed is determined using optics and electronics

Comparison of absoprtion against a calibration allows concentration

to be determined
Bagian 1. Overview
Elemental analysis technique
Analysis metallic elements and metalloids in solution
 Bagian 1. AAS

Metode AAS berprinsip pada

absorpsi cahaya oleh atom. Atom-
atom menyerap cahaya tersebut
pada panjang gelombang tertentu,
tergantung pada sifat unsurnya.
Bagian 1. Component of AAS
Bagian 1. AAS

Hydride Vapour/uap
dingin
Bagian 1. Readout
Bagian 2.

Preparasi Sampel
Bagian 2.

Spektrofotometer UV Vis
Preparasi Sampel
Bagian 2. Preparasi Sampel

Spektrofotometri UV-Vis

Ultraviolet (200 – 400 nm) • Dilusi/pengenceran

Syarat senyawa : • Derivatisasi
• Memiliki gugus kromofor. Contoh • Ekstraksi
kromofor : C=O, C=C, N=N dan NO2
• Memiliki gugus auksokrom. Contoh
auksokrom : -OH, -OR
• Pewarnaan
Visible (400 – 800 nm) • Direaksikan dengan suatu
Syarat senyawa : senyawa agar berwarna
• Berwarna (senyawa kompleks)
 Bagian 2. Analisa Kafein di Kopi

Ditambahkan
CaCO3 1.5 gram

1 gram sampel Dilarutkan dalam

kopi bubuk Dimasukan ke
150 mL akuades Disaring dan dalam corong
panas diambil filtratnya pisah

Kadar Dieksitrasi 4 kali

dengan kloroform
masing2 25 mL

Diukur absorbansi Ekstrak kafein dencerkan Hasil ekstrak

pada panjang dengan aquades diuapkan dengan
sebanyak 10 kali rotary evaporator
Nur Hasani gelombang 272.5
Fajriana, 2018
 Bagian 2. Analisa Fe di Air Limbah

Sampel air limbah yang telah diawetkan Tutup dengan kaca arloji kemudian dipanaskan Tunggu hingga suhu sampel air
dipipet sebanyak 75 ml ke dalam gelas beker hingga volume sampel menjadi 45 ml sesuai dengan suhu ruang

Kemudian pipet masing-

Diamkan selama 15 menit dan masing sampel sebanyak
Kadar diukur absorbansinya pada 5 ml kedalam tabung
panjang gelombang 481 nm reaksi dan tambahkan 2
ml HCl 4M dan 5 mL
KSCN 2M
Bagian 2.

HPLC & GC
Preparasi Sampel
Bagian 2. HPLC Application

Samples suitable for HPLC analysis

Derivatization of Amino Acid
• Non volatile compound
• Have functional group (Chromophor, Flourophor dst)

Samples preparation for HPLC sample

• Dilution
• Derivatization
• To make the compound more non-volatile
• To make decrease the polarity of the
compound
• To enable detection of a selective detector
• Sample clean up
To avoid non-volatile components from entering
the HPLC
 Bagian 2. GC Application

Samples suitable for GC analysis

• Thermally stabile
• Sufficiently volatile (can be vaporized at 400-
450’C or below)

Samples preparation for GC sample

• Dilution
• Derivatization
- To make the compound more volatile
- To make the compounf more thermally stable
- To make decrease the polarity of the
compound
- To enable detection of a selective detector
• Sample clean up :
To avoid non-volatile components from entering
the GC
Bagian 2. Sample Extraction & Clean Up

Liquid-liquid Extraction (LLE)

Advantages

• Inorganic salts easily removed

• Short method development time
• Love cost

Disadvantages

• Labor intensive
• Large volume of organics
• Difficult to automate
• Emulsion formation
 Bagian 2. Sample Extraction & Clean Up

Solid Phase Extraction (SPE)

The process of solid phase extraction

completes in four steps:

1. Conditioning of sorbent
2. Loading step
3. Washing of sorbent
4. Elution
Bagian 2. Sample Extraction & Clean Up

Solid Phase Extraction (SPE)

Advantages

• Very selective
• Effective with variety of matrix
• Concentration effect
• High recoveries
• High reproducibility

Disadvantages

• Greater complexity/difficult to master

• Length method development
• Costly
• Many choise
Bagian 2. Sample Extraction & Clean Up

Quechers Workflow
Bagian 2. Sample Extraction & Clean Up
The QuEChERS method is a two-step process: extraction followed by clean-up
Bagian 2.

AAS
Preparasi Sampel
Bagian 2. Preparasi Sampel

Sampel padatan, Cairan jernih

Dianalisa
cairan, gas homogen, bebas
menggunakan AAS
matriks pengganggu

Destruksi

Destruksi Basah Destruksi Kering

Bagian 2. Destruksi Basah

• Destruksi basah adalah perombakan sampel dengan asam-

asam kuat baik tunggal maupun campuran, kemudian
dioksidasi dengan menggunakan zat oksidator
• Pelarut-pelarut yang dapat digunakan untuk destruksi basah
antara lain asam nitrat, asam sulfat, asam perklorat, dan
asam klorida
• Semua pelarut tersebut dapat digunakan secara tunggal
maupun campuran
Bagian 2. Contoh Destruksi Basah

Ditambahkan larutan
Dipanaskan di atas
1 gram sampel sayuran aqua regia atau
hotplate selama kurang
dimasukan dalam gelas campuran HNO3 pekat :
lebih 30 menit sampai
beker 100 mL HCl pekat (1:3) sebanyak
tidak terbentuk gas
3 mL

Semua sampel
Dianalisis menggunakan Saring dan disimpan di
terdestruksi dan
AAS dalam botol
terbentuk larutan
Bagian 2. Destruksi Kering

• Destruksi kering merupakan perombakan organik logam di

dalam sampel menjadi logam-logam anorganik dengan jalan
pengabuan sampel dalam muffle furnace dan memerlukan
suhu pemanasan tertentu
• Pada umumnya dalam destruksi kering ini dibutuhkan suhu
pemanasan antara 400 – 800 oC, tetapi suhu ini sangat
tergantung pada jenis sampel yang akan dianalisis
Bagian 2. Contoh Destruksi Kering

Diabukan di dalam tanur

1 gram sampel Diuapkan dengan oven
selama 8 jam pada suhu
ditempatkan pada cawan sampai temperature 105
450 oC sampai sampel
porselin – 110 oC selama 30 menit
mengering

Pindahkan ke labu takar

Sampel yang telah
50 mL dan encerkan
Dipanaskan di atas menjadi abu, kemudian
dengan HNO3 0.1 M dan
hotplate sampai abu larut ditambahkan HCl 10 M
dianalisis menggunakan
sebanyak 2 mL
AAS
Bagian 2. Analisa Selenium
Acuan SNI 3554-2015

Analisis cemaran logam Se dengan SSA menggunakan lampu katoda Se berdasarkan penyerapan energi radiasi
oleh atom-atom Se pada tingkat energi dasar dengan atomisasi tungku karbon

Persiapan Contoh / Sample :

Saring larutan contoh 50 mL
sampai 100 mL dengan
menggunakan saringan
membrane 0.45 um
Bila terjadi endapan, pipet 100 mL
Asamkan contoh sampai pH < 2
contoh yang diasamkan ke dalam
dengan HNO3 p.a
gelas piala 140 mL

Pindahkan contoh ke dalam labu Tambahkan 5 mL HNO3 p.a dan

ukur 100 mL, dinginkan dan batu didih kemudian uapkan
Contoh siap uji tambahkan air bebeas logam yang diatas penangan listruk sampai
mengandung HNO3 1.5 mL/L larutan jernih dan volumenya kira-
sampai tanda batas kira 10 – 20 mL
Bagian 2. Microwave Digestion

• Digunakan untuk mendestruksi

sampel
• Otomatis
• Terdapat metode di instrument untuk
proses destruksi sesuai dengan jenis
sampel
• Proses destruksi lebih cepat
• Bisa beberapa sampel sekaligus,
sesuai dengan kapasitas alat
Bagian 3.

Pembacaan & Interpretasi Hasil

Bagian 3.

Spektrofotometer UV Vis
Pembacaan & Interpretasi Hasil
Bagian 3. Absorbansi/ %Transmitan

Absorbansi
Menunjukan jumlah foton yang diserap
electron untuk tereksitasi dari keadaan
dasar ke keadaan tereksitasi

%Transmitan
Perbandingan intensitas cahaya setelah
melewati sampel dengan intensitas Cahaya
awal

%T = I/Io
Bagian 3. Absorbansi/ %Transmitan
Bagian 3. Absorbansi/ %Transmitan
Bagian 3.

HPLC & GC
Pembacaan & Interpretasi Hasil
Bagian 3. Kromatogram

Baseline Baseline
Bagian 3. Kromatogram

MATCH
Bagian 3. Kromatogram

Area puncak
Bagian 3. Kromatogram
Bagian 3. Kromatogram

1 - Parabene_Summit_071002 #5 Parabene isocratic 70B Summit 5 UV_VIS_1

2 - Parabene_Summit_071002 #5 Parabene isocratic 70B Summit 5 Pump_Pressure
600 140,0
mAU bar
Retention time

2 - 6,573
1 - 5,363
500 Detector
signal 130,0

3 - 8,863
400
Peak Height
Pressure
120,0

4 - 12,930
signal and
300 ripple

200 110,0

Peak area
100
%D: 0,0 % 100,0
2 %C: 0,0 % Baseline
Methanol: 70,0 %
1
Flow: 0,50 ml/min
min
-50 90,0
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0
Bagian 3.

AAS
Pembacaan & Interpretasi Hasil
Bagian 3. Absorbansi/Sinyal

Absorban/Sinyal
•
Menunjukan jumlah foton yang diserap oleh electron untuk
eksitasi dari keadaan dasar ke keadaan tereksitasi
• Nilai absorbansi akan sebanding dengan konsentrasi
sampel
• Semakin tinggi konsentrasi sampel, nilai absorbansi juga
akan semakin tinggi
• Untuk penentuan konsentrasi/kuantitatif, digunakan kurva
kalibrasi antara y = absorban, x = konsentrasi
Bagian 4.

Teknik Analisa Kualtitatif & Kuantitatif

Bagian 4.

Spectrophotometer UV Vis
Teknik Analisa Kualitatif & Kuantitatif
Bagian 4. Qualitative Analysis

Analisis Kualitatif

• Analisa kualtitatif dilakukan untuk mengetahui

ada tidaknya senyawa target di dalam sampel
• Ditunjukan dengan panjang gelombang
maksimum (λ maks) yang dimiliki oleh sampel A
• Panjang gelombang maksimum bersifat spesifik
untuk senyawa tertentu, misal benzene memiliki
panjang gelombang maksimum di 254 nm

Prosedur analisa : max

• Penyiapan larutan blanko dan sampel
• Penetapan panjang gelombang maksimum
Bagian 4. Identifikasi Panjang Gelombang
Maksimum
Untuk menentukan identitas target analit, sehingga dapat digunakan untuk analisa kualtitatif dan
kuantitatif
Bagian 4. Parasetamol

Rumus molekul : C8H9NO2

Massa molekul : 151.2
Konsentrasi : 1 mg/100 mg
Bagian 4. Perhitungan

Hukum Lambert-Beer Parasetamol

Absorbansi yang baik =
A = e.b.c E1%1 cm NaOH 0.1 M = 710
0.2 – 0.8
Tebal kuvet = 1 cm

Keterangan 0.43 = 710.1.c

Kesalahan fotometrik
c = 0.43/710.1
A = absorbansi terkecil : 0.43
= 0.0006056 %
e = absorptivitas = 0.0006056 g/100 mL
b = tebal kuvet (cm) = 0.006056 g/L
c = konsentrasi (%) = 6.056 mg/L BPJ = mg/L
= 6.056 ug/mL = ug/mL
= 6.056 bpj
Bagian 4. Perhitungan Pengenceran

Pct = 50 mg 2.5 mL

0.6 mL
3 – 4 mL

1000 bpj
100 bpj
6 bpj

50 mL 25 mL 10 mL

50 mg/50 mL V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2

1 mg/mL V1 = 25.100/1000 V1 = 10.6/100
1000 ug/mL = 2.5 mL = 0.6 mL
Bagian 4. Hasil

Hasil yang baik

• Mendekati λ max 255 nm
• Rentang absorbansi 0.43

Hasil yang tidak baik

• Muncul > 1 puncak
• Puncak absorbansi berada dalam
rentang > 0.8 dan < 0.2

Solusi
• Baku tidak murni
• Pengenceran tidak tepat
Bagian 4. Quantitative Analysis

Analisis Kuantitatif

• Analisa kuantitative dilakukan untuk mengetahui

kadar senyawa target di dalam sampel A
• Dilakukan dengan pembuatan kurva kalibrasi
menggunakan larutan standar yang sudah
diketahui konsentrasinya max
• One point
• Multi point
Prosedur analisa :
• Penyiapan larutan blanko dan sampel
• Pembuatan larutan standar
• Penetapan panjang gelombang maksimum
• Pengukuran larutan sampel dan standar
Bagian 4. Multi Point

Penentuan konsentrasi sampel menggunakan satu larutan baku pembanding yang sudah diketahui
konsentrasinya

Baku
Absorbansi

Kadar
Sampel
Bagian 4. Multi Point

Penentuan konsentrasi sampel menggunakan kurva kalibrasi dari beberapa larutan baku pembanding
yang sudah diketahui konsentrasinya

Absorbansi

Baku

Sampel
Kadar
Bagian 4. Perhitungan Analisa Parasetamol

Hukum Lambert-Beer A = e.b.c Absorbansi yang baik =

0.2 – 0.8
Parasetamol

E1%1 cm NaOH 0.1 M = 710

Tebal kuvet = 1 cm

0.2 = 710.1.c 0.8 = 710.1.c

c = 0.2/710.1 c = 0.8/710.1 Rentang baku yang dibuat
= 0.0002 % = 0.0011 %
= 0.0002 g/100 mL = 0.0011 g/100 mL 5, 6, 7, 8, 9, 10 bpj
= 0.002 g/L = 0.011 g/L
= 2 mg/L = 11 mg/L
= 2 ug/mL = 11 ug/mL BPJ = mg/L
= 2 bpj = 11 bpj = ug/mL
 Bagian 4. Pengenceran Baku

Baku = 50 mg 2.5 mL 5 bjp V1C1 = V2C2

Labu 10 mL
V1 = 10.5/100
= 0.5 mL
Labu 10 mL 6 bjp

Perhitungan sama
Labu 10 mL 7 bjp

1000 bpj
100 bpj 8 bjp
0.8 mL Labu 10 mL

Labu 10 mL 9 bjp Semua larutan dimasukan

50 mL 25 mL ke dalam kuvet
10
Labu 10 mL bjp

50 mg/50 mL V1.C1 = V2.C2

1 mg/mL V1 = 25.100/1000 Ukur absorbansi pada
1000 ug/mL = 2.5 mL panjang gelombang
maksimum
 Bagian 4. Pengenceran Sampel
Konsentrasi teoritis sampel harus masuk ke dalam rentang konsentrasi baku (5, 6, 7, 8, 9, 10 bpj)

Sampel = 100 mg 5 mL

3 – 4 mL

200 bpj
10 bpj

500 mL 100 mL Ukur bsorbansi pada

Contoh panjang gelombang
W tab = 500 mg maksimum
W label = 500 mg 100 mg/500 mL V1.C1 = V2.C2
0.2 mg/mL V1 = 10.100/200
200 ug/mL = 5 mL
 Bagian 4. Perhitungan Kadar Sampel
Metode One Point
Absorbansi Baku 10 bpj = 0.757 FI IV
Absorbansi Sampel = 0.702 Bobot sampel = 10 x cbaku (Abs sampel/Abs baku)

Bobot sampel = 10 x 10 (0.702/0.757)

= 100.0.9273 FI IV
= 92.73 mg Bobot sampel = fp x LU x cbaku (Abs sampel/Abs baku)

Bobot sampel = 20 x 500 x 10(0.702/0.757) Kadar sampel = Bobot sampel/ bobot sampel yang digunakan x 100 %
= 100000 (0.9273) = 92.73 / 100 x 100%
= 92730 ug = 92.73 % b/b
= 92.73 mg
𝑩𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍 𝒑𝒂𝒅𝒂 𝒕𝒂𝒃𝒍𝒆𝒕
Faktor pengenceran = Vol labu/Vol pipet Bobot sampel tablet = 𝑩𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍 𝒚𝒂𝒏𝒈 𝒅𝒊𝒕𝒊𝒎𝒃𝒂𝒏𝒈 x bobot sampel yang dipakai
= 100/5
= 500 / 550 X 100
= 20
= 90.9 mg

Kadar sampel sesungguhnya= Bobot sampel/ bobot sampel label x 100 %

Abs Baku/C baku = Abs Sampel/C sampel
= 92.73 / 90.9 x 100%
= 102.01 % b/b
Bagian 4. Perhitungan Kadar Sampel
Metode Multi Point
Konsentrasi Baku Absorbansi Kurva Kalibrasi
(bpj) 0.8
y = 0.0579x + 0.1808
5 0.469 0.7 R² = 0.9972

6 0.523 0.6

Absorbansi
0.5
7 0.597
0.4
8 0.642 0.3
9 0.704 0.2
0.1
10 0.757
0
0 2 4 6 8 10 12
Konsentrasi Baku Absorbansi Konsentrasi
(bpj)
? 0.630 Jika R = < 0.9 → Pengenceran tidak tepat
Bagian 4. Perhitungan Kadar Sampel
Metode Multi Point
Persamaan regresi → y = bx +a Kadar sampel = Bobot sampel / bobot sampel yang digunakan x 100%
y = 0.0579x + 0.1808 = 90.017 / 100 x 100 %
= 97.1 % b/b
Kadar sampel (x) = (y-a)/b
= (0.702 – 0.1808)/ 0.0579 𝑩𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍 𝒑𝒂𝒅𝒂 𝒕𝒂𝒃𝒍𝒆𝒕
Bobot sampel label = 𝑩𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍 𝒚𝒂𝒏𝒈 𝒅𝒊𝒕𝒊𝒎𝒃𝒂𝒏𝒈 x bobot sampel yang
= 0.5212/0.079
= 9.0017 bpj dipakai
= 500 / 550 x 100
Faktor Pengenceran = Vol labu/ Vol yang di = 90.9 mg
pipet
= 100/5 Kadar sampel yang sesungguhnya = Bobot sampel / bobot sampel
= 20 label x 100 %
= 90.017 / 90.9 x 100 %
Bobot sampel = Kadar sampel/ fp x LU = 99.02 % b/b
= 9.0017 x 20 x 500
= 90017 ug
= 90.017 mg
Bagian 4.

HPLC & GC
Teknik Analisa Kualitatif & Kuantitatif
Bagian 4. Qualitative Analysis

• A chromatogram of the sample retention time (tR) is compared with the retention time of a
standard
• If the sample does not produce a peak at the same retention time (tR) as the standard, which is
run under certain identical conditions, then it can be assumed that this compound is not present
in the sample or the level is below the detection limit of the procedure.

The aim of qualitative analysis is to answer the

question ‘What’ is in the sample?
Bagian 4. Qualitative Analysis
Bagian 4. Quantitative Analysis

• Quantitative analysis of the solute concentration in a sample is compared by measuring

the height or peak area of the solute with the peak of a reference standard at a known
concentration.
✓ Analysis Based on Peak Height
✓ Analysis Based on Peak Area

1. Internal standard method

2. External standard method

Bagian 4. Quantitative Analysis
External Standard Method

• The external standard method is a method

used to determine the concentration of an
unknown compound in a sample by using an
external standard curve calibration plot

• Solutions of the external standard curve were

prepared and analyzed separately from the
chromatograms of the particular compounds
present in the samples

250 ppm 500 ppm 1000 ppm 2000 ppm

Bagian 4. Quantitative Analysis
Internal Standard Method

• Internal standard is a chemical substance that is

added in a fixed amount to samples, blanks and
calibration standards in a chemical analysis.

• Internal standards are different compounds from

analytes, however these compounds must be well
separated during the separation process

• An internal standard is used when a sample requires

very significant sample treatment, such as steps
including derivatization, extraction, filtration, etc.

• Internal standard can be a factor of loss of sample

correction
Bagian 4. Qualitative & Quantitative
Standar C1 – 50 mg/L
Standar C2 – 100 mg/L
Standar C3 – 150 mg/L
Standar C4 – 200 mg/L
Caffeine Standar C5 – 250 mg/L
Bagian 4. Quantitative

Kurva Kalibrasi
300000
y = 1000x
250000 R² = 1

200000

Peak Area
150000

100000

50000

0
0 50 100 150 200 250 300
Konsentrasi (ppm)

Konsentrasi sampel :
X = y/1000
= 207757/1000
=207.757 ppm
Bagian 4.

AAS
Teknik Analisa Kualitatif & Kuantitatif
Bagian 4. Qualitative Analysis

Analisis Kualitatif

• Analisa kualtitatif dilakukan untuk mengetahui ada

tidaknya senyawa target di dalam sampel
• Ditunjukan dengan nilai absorbansi yang dimiliki oleh
sampel pada pengukuran target tertentu
• Jika nilai absorbansi diatas baseline (bernilai positif)
maka hasilnya positif, jika 0/ negative maka dapat
disimpulkan bahwa sampel tidak mengandung senyawa
target tersebut

Prosedur analisa :
• Penyiapan larutan blanko dan sampel
• Pengukuran menggunakan AAS
Bagian 4. Penetapan Absorbansi

Untuk menentukan identitas target analit, sehingga dapat digunakan untuk analisa kualtitatif dan
kuantitatif

Absorbansi
Bagian 4. Quantitative Analysis

Analisis Kuantitatif

• Analisa kuantitative dilakukan untuk mengetahui

kadar senyawa target di dalam sampel
• Dilakukan dengan pembuatan kurva kalibrasi
menggunakan larutan standar yang sudah
diketahui konsentrasinya
• One point
• Multi point
Prosedur analisa :
• Penyiapan larutan blanko dan sampel
• Pembuatan larutan standar dan sampel
• Pengukuran larutan sampel dan standar
Bagian 4. One Point

Penentuan konsentrasi sampel menggunakan satu larutan baku pembanding yang sudah diketahui
konsentrasinya

Baku
Absorbansi

Kadar
Sampel
Bagian 4. Multi Point

Penentuan konsentrasi sampel menggunakan kurva kalibrasi dari beberapa larutan baku pembanding
yang sudah diketahui konsentrasinya

Absorbansi

Baku

Kadar
Sampel
Bagian 4. Fe Analysis

Bahan
1. Aquadest
2. Asam Nitrat (HNO3) 0.05 N
3. Senyawa NH4Fe(SO4)2
Bagian 4. Fe Analysis

Pembuatan larutan induk Fe dari senyawa

NH4Fe(SO4)2 100 ppm dalam 100 mL

Timbang 0.0861 gram senyawa NH4Fe(SO4)2 dan

masukkan ke dalam labu ukur 100 mL

Tambahkan 5-10 tetes HNO3 63%

Tambahkan aquadest sampai tanda batas

 Bagian 4. Pengenceran Baku

V1C1 = V2C2
Labu 50 mL 0 ppm
V1 = 50.2.5/100
= 1.25 mL

Baku = 0.0861 gram Labu 50 mL 2.5 ppm

Perhitungan sama

Labu 50 mL 5 ppm

100 ppm

Labu 50 mL 7.5 ppm

Semua larutan dianalisa
100 mL dengan AAS

Labu 50 mL 10 ppm

Ukur absorbansi pada

panjang gelombang
maksimum
Bagian 4. Preparasi Sampel

Pipet 25 mL sampel air Tambahkan pereaksi

sumur dan masukkan HNO3 0.05 N sampai
Analisis Sampel Fe
ke dalam labu ukur 100 tanda batas. Lalu
mL dihomogenkan

Ukur absorbansi sampel Fe

Ditentukan konsentrasi
dengan lampu katoda Fe pada
Fe dalam sampel
panjang gelombang 248.3 nm
Bagian 4. Penentuan Kadar Fe

Kurva Kalibrasi Fe
Konsentrasi Baku Absorbansi
0.3
(ppm) y = 0.0161x + 0.0794
0.25
R² = 0.9987
0 0.0768

Absorbansi
0.2
2.5 0.1213 0.15

5 0.1619 0.1
0.05
7.5 0.2019
0
10 0.2381 0 2 4 6 8 10 12
Konsentrasi (ppm)

Konsentrasi sampel
Konsentrasi Sampel Absorbansi Konsentrasi Fe dalam air sumur
(ppm) y = 0.0161x + 0.0794
Kadar Fe = C x FP
25.4904 0.1820 X = (y-0.0794)/0.0161
= 6.3726 ppm x 4
= (0.1820-0.0794)/0.0161
17.6644 0.1505 = 25.4904 ppm
= 6.3726 ppm
Bagian 5.

Contoh Pembacaan Hasil

 Bagian 5. Spektrofotometer UV Vis
Analisa Fe

Gambar 1 menunjukkan hasil scanning

panjang gelombang maksimum berada
pada panjang gelombang 481 nm
TERIMAKASIH