Spektrofotometri adalah salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk

menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang berdasarkan pada
interaksi antara materi dengan cahaya. Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri disebut
spektrofotometer (Mukti, ____). Spektrofotometer terdiri atas dua bagian yaitu spectrometer dan
fotometer. Spektrometer adalah alat yang menghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang
gelombang tertentu, sementara fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang
ditransmisikan atau diabsorpsikan. Sehingga, pengukuran kuantitatif dari cahaya yang terserap
diukur dalam bentuk transmitansi dan absorbansi tersebut.

Spektrofotometer terdiri dari beberapa jenis berdasarkan sumber cahaya yang digunakan
(Permatasari, 2015):

1) Spektrofotometer VIS (Visible). Pada spektrofotometer ini yang digunakan sebagai

sumber sinar/energy adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spectrum
elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar
tampak adalah 380 – 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh mata manusia,
maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak.
2) Spektrofotometer UV (Ultra Violet). Berbeda dengan spektrofotometer VIS,
spektrofotometer ini berdasarkan interaksi sampel dengan sinar UV. Sinar UV memiliki
panjang gelombang 190 – 380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu
deuterium. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata manusia maka senyawa yang
dapat menyerap sinar ini merupakan senyawa yang tidak memiliki warna bening dan
transparan.
3) Spektrofotometer UV-Vis. Spektrofotometer ini merupakan gabungan antara
spektrofotometer UV dan Visible yang menggunakan dua buah sumber cahaya yang
berbeda, yaitu sumber cahaya UV dan sumber cahaya Visible. Untuk sistem
spektrofotometer, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling popular digunakan.
Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sampel berwarna juga untuk
sampel tak berwarna seperti senyawa organik.
4) Spektrofotometer IR. Spektrofotometer ini berdasarkan kepada penyerapan panjang
gelombang inframerah. Cahaya inframerah, terbagi menjadi inframerah dekat,
pertengahan dan jauh. Pada spektrofometri ini, inframerah jauh dan pertengahannya
mempunyai panjang gelombang 2.5 – 1000 mikrometer. Pada spektro IR meskipun bisa
digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif.
Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu
senyawa, terutama senyawa organik.

Proses absorbs cahaya pada spektrofotometri

Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis) mengenai
suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja yang akan diserap. Di dalam
suatu molekul yang memegang peranan penting adalah elektron valensi dari setiap atom yang
ada hingga terbentuk suatu materi (Mukti. ____).

Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi), berputar (rotasi)
dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energy. Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV, maka
akan terjadi perpindahan elektron dari keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan
elektron ini disebut transisi elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya inframerah
maka elektron yang ada di dalam atom atau elektron ikatan pada suatu molekul dapat hanya akan
bergetar (vibrasi). Sedangkan gerakan berputar elektron terjadi pada energy yang lebih rendah
lagi misalnya pada gelombang radio (Mukti, ____).

Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi suatu yang ada dalam
sampel, dimana zat yang ada di dalam sel sampel disinari dengan cahaya yang memiliki panjang
gelombang tertentu. Ketika cahaya mengenai sampel, sebagian akan diserap, sebagian akan
dihamburkan dan sebagian lagi akan diteruskan (Mukti, ____).

Pada spektrofotometri, cahaya yang mengenai permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat
tidak dapat diukur, yang dapat diukur adalah It/I0 atau I0/It (perbandingan cahaya datang dengan
cahay setelah melewati sampel). Proses penyerapan cahaya oleh suatu zat dapat digambarkan
sebagai berikut:

Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang dihamburkan diukur
sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan dengan Hukum Beer, yang berbunyi:

“Jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap atau
ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal
larutan”.
Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik yang memakai sumber
REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190 – 380 nm) dan sinar tampak (380 – 780
nm). Spektrofotometri UV-Vis melibatkan energy elektronik yang cukup besar pada molekl yang
dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif
dibandingkan kualitatif.

Instrumen Spektrofotometri UV-Vis

Gambar 2 – Diagram skematik dari spektrofotometer UV-Vis (

Instrumen untuk mengukur absobsi dari cahaya ultraviolet, tampak dan radiasi dibentuk dari
beberapa bagian yaitu:

1) Sumber
Sumber cahaya pada spektrofotometer harus memiliki pancaran radiasi yang stabil dan
intensitas yang tinggi. Sumber cahaya yang biasa dipakai yaitu:
1.1) Lampu deuterium dan hidrogen (320 – 2500 nm).
1.2) Lampu Tungsten/Wolfram (lampu pijar) menghasilkan spectrum kontinyu pada
gelombang 320 – 2500 nm.
1.3) LED
1.4) Lampu Xenon Arc (250 – 600 nm).
 2) Alat pemilih panjang gelombang
Atau disebut juga sebagai monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang
gelombang yaitu dengan mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar poliktromatis
menjadi cahaya monoaktromatis. Jenis monoktromator yang saat ini banyak digunakan
adalah gratting/kisi difraksi dan prisma
3) Wadah sampel
Pada umumnya, sama dengan elemen optic lain dari instrument absorpsi, sel atau disebut
cuvette yang menyimpan sampel dan pelarut harus terbuat dari bahan yang melewati
radiasi di daerah tertentu. Kuvet biasa terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari
kuarsa yang terbuat dari silica memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang
terbuat dari kaca dan plastik hanya dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya
pada spektrofotometer sinar tampak (VIS). Pada pengukuran di daerah UV dipakai kuvet
kwarsa atau plexiglass, dan semua macam kuvet dapat dipakai untuk pengukuran di
daerah sinar tampak (visible). Kuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan ukuran
1 cm x 1 cm dan ketinggian 5 cm. Kuvet harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut:
- Tidak berwarna sehingga dapat mentransmisikan semua cahaya
- Permukaannya secara optis harus benar-benar sejajar
- Harus tahan (tidak bereaksi) terhadap bahan-bahan kimia
- Tidak boleh rapuh
- Mempunyai bentuk yang sederhana
4) Detektor
Detektor berfungsi untuk menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan
mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor adalah:
- Kepekaan yang tinggi
- Perbandingan sinyal dengan bising tinggi
- Respon konstan pada berbagai panjang gelombang
- Waktu respon cepat
- Sinyal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi

Macam-macam detektor:

- Detektor foto
- Photocell
- Phototube
- Hantaran foto
- Dioda foto
- Detektor panas
5) Sistem pembacaan sinyal
Disebut juga sebagai read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya
isyarat listrik yang berasal dari detektor.

Kegunaan Spektrofotometri UV-VIS

 1) Analisis Kualitatif
Penggunaan alat ini dalam analisis kualitatif sedikit terbatas sebab spectrum sinar tampak
atau sinar UV menghasilkan puncak-puncak serapan yang lebar sehingga dapat
disimpulkan bahwa spectrum yang dihasilkan kurang menunjukan puncak-puncak
serapan. Namun, walaupun puncak yang dihasilkan berbentuk lebar, puncak tersebut
masih dapat digunakan untuk memperoleh keterangan ada atau tidaknya gugus fungsional
tertentu dalam suatu molekul organik.
2) Analisis Kuantitatif
Penggunakan sinar UV dalam analisis kuantitatif memberikan beberapa keuntungan,
diantaranya:
- Dapat digunakan secara luas
- Memiliki kepekaan yang tinggi
- Keselektifannya cukup baik dan terkadang tinggi
- Ketelitian tinggi
- Tidak rumit dan cepat

Kelebihan dan kekurangan

Kelebihan spektrofotometer UV/VIS:

- Panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi

- Sederhana
- Dapat menganalisa larutan dengan konsentrasi yang sangat kecil

Kekurangan spektrofotometer UV/VIS:

- Absorbsi dipengaruhi oleh pH larutan, suhu dan adanya zat pengganggu dan
kebersihan dari kuvet
- Hanya dapat dipakai pada daerah UV dengan panjang gelombang >185 nm
- Pemakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung elektron valensi dengan
energy eksitasi rendah
- Sinar yang dipakai harus monokromatis

Parameter

Spektrofotometer UV-VIS memiliki beberapa parameter dalam pengukurannya, antara lain:

1) Resolusi spectral
 Resolusi spektral merupakan kemampuan instrument untuk membedakan dua atau lebih
panjang gelombang yang berdekatan (hamper sama panjang gelombangnya).
2) Akurasi panjang dan presisi
Akurasi panjang gelombang dan presisi merupakan hal yang sangat penting untuk
membandingkan hasil pengukuran antara instrument yang satu dengan yang lainnya.
3) Akurasi fotometri dan presisi
Akurasi fotometri dan presisi meliputi penyimpangan cahaya (stray light), gangguan
(noise) dan penyimpangan (drift)
3.1) Stray Light
Stray light dapat didefinisikan sebagai cahaya yang terdeteksi karena adanya panjang
gelombang yang terletak di luar lebar pita dari panjang gelombang yang dipilih. Stray
light menyebabkan bias negative dalam menanggapi instrument dan akhirnya adalah
faktor pembatas untuk absorbansi.
3.2) Noise
Gangguan ini mempengaruhi ketepatan pengukuran untuk satu pengukuran, mugkin
termasuk kesalahan dalam akurasi juga. Kesalahan total pada setiap absorbansi adalah
jumlah dari kesalahan karena penyimpangan cahaya dan gangguan (gangguan foto dan
gangguan elektronik).
3.3) Drift
Penyimpangan (drift) pada umumnya merupakan hasil dari variasi intensitas lampu antara
pengukuran. Perubahan elektronik instrument juga dapat menyebabkan penyimpangan.

Spektrum UV-VIS

Data-data yang dikeluarkan oleh UV atau VSI dapat berupa absorbansi atau transmitansi yang
langsung dibaca pada spektrofotometer. Namun untuk UV, VIS, UV-VIS dan IR, data yang
dikeluarkan dapat berupa spectrum jika telah dihubungkan dengan computer. Spektrum yang
dikeluarkan oleh UV, VIS, dan UV-VIS berupa pita yang lebar sedangkan pada pita yang
dikeluarkan oleh IR berupa garis atau puncak tajam. Pita melebar dari UV-VIS disebabkan
karena energy yang dimiliki selain menyebabkan transisi elektronik terjadi pula rotasi dan vibrasi
elektron dalam molekul.
Bagian molekul yang mengabsorbsi dalam daerah UV-VIS dinyatakan sebagai kromotor. Suatu
molekul dapat mempunyai beberapa kromofor. Suatu senyawa dapat dianalisis dengan
spektrofotometer UV-VIS jika mempunyai kromofor pada strukturnya, seperti:

1) Ikatan rangkap terkonjugasi: dua ikatan rangkap terkonjugasi memberikan suatu

kromofor seperti dalam butadiene akan mengabsorbsi pada 217 nm. Panjang gelombang
serapan maksimum dan koefisien ekstingsi molar akan bertambah dengan bertambahnya
jumlah ikatan rangkap terkonjugasi.
2) Senyawa aromatic: cincin aromatic mengabsorbsi dalam daerah radiasi UV. Misalnya:
benzene menunjukkan serapan pada panjang gelombang sekitar 255 nm, begitu pun
dengan asam asetil salisilat.
3) Aksokrom: gugus ini mempunyai pasangan elektron bebas, yang disebabkan oleh
terjadinya mesomeri kromofor. Yang termasuk dalam gugus aksokrom ini adalah
substituent seperti –OH, -NH2, -NHR dan –NR2. Gugus ini akan memperlebar sistem
kromofor dan menggeser absorbs maksimum (Imax) ke arah I yang lebih panjang.
4) Gugus aromatic: mempunyai transisi elektron seperti nitrat (313 nm), karbonat (217 nm),
nitrit (360 dan 280 nm), azida (230 nm) dan tritiokarbonat (500 nm).

Penyerapan sinar UV-VIS dibatasi pada sejumlah gugus fungsional atau gugus kromofor
yang mengandung elektron valensi dengan tingkata eksitasi rendah. Tiga jenis elektron yang
terlibat adalah sigma, phi dan elektron bebas. Menurut teori orbital molekul, ketika molekul
tereksitasi oleh energy yang terserap (sinar uv-vis) maka elektron akan mengalami promosi
dari orbital bonding ke antibonding.

1) Transisi σ  σ*
Ikatan sigma merupakan ikatan yang sangat kuat sehingga membutuhkan energy yang
tinggi untuk dapat melakukan transisi ini. Senyawa organic yang terbentuk dari ikatan
sigma (ikatan tunggal) tidak menunjukkan absorpsi di daerah normal ultraviolet sekitar
125 nm. Senyawa hidrokarbon seperti metana, propane mengalami transisi ini.
2) Transisi n  σ*
Transisi jenis ini terjadi pada senyawa heteroatom berikatan tunggal yang terikat dengan
atom yang memiliki pasangan elektron bebas seperti atom oksigen, atom-atom halogen,
atom nitrogen dan sebagainya. Senyawa-senyawa organic yang mengalami transisi ini
diantaranya eter, alcohol, alkil halide, amina dan sebagainya. Transisi ini terjadi pada
kisaran panjang gelombang 150 – 250 nm.
3) Transisi π  π*
Transisi jenis ini terjadi pada molekul hidrokarbon tak jenuh atau molekul yang memiliki
ikatan rangkap. Energi yang dibutuhkan untuk melakukan eksitasi lebih kecil
dibandingkan transisi sebelumnya, sehingga transisi ini terjadi pada panjang gelombang
yang lebih besar. Senyawa-senyawa organic yang mengalami transisi ini diantaranya
adalah senyawa alkena dan alkuna.
4) Transisi n  π*
Transisi ini terjadi pada senyawa tak jenuh yang berikatan dengan atom yang memiliki
pasangan elektron bebas. Senyawa organic yang mengalami transisi ini diantaranya
adalah senyawa karbonil (C=O), nitril (C=N)
Pada umumnya senyawa yang mempunyai transisi σ  σ* mengabsorpsi cahaya pada
panjang gelombang sekitar 150 nm. Senyawa yang mempunyai transisi σ  σ*
(kromofor tak terkonjugasi) mengabsorpsi cahaya pada panjang gelombang sekitar 200
nm. Senyawa yang mempunyai transisi π  π* dan n  π* mengabsorpsi cahaya pada
panjang gelombang daerah ultraviolet kuarsa (200 – 400 nm). Oleh karena, panjang
gelombang sinar ultraviolet-visible berkisar antara 200 – 400 nm. Maka senyawa yang
dapat dideteksi oleh spektrofotometer UV-VIS adalah senyawa yang mempunyai transisi
π  π* dan n  π* serta beberapa transisi n  σ*. Dengan bertambahnya kepolaran
pelarut pada transisi π  π*, bentuk puncak bergeser ke panjang gelombang yang lebih
pendek (pergeseran biru atau hipsokromik), sedangkan jika bergeser ke panjang
gelombang yang lebih panjang (pergeseran merah atau batokromik). Pergeseran biru
disebabkan bertambahnya solvasi pasangan elektron hingga berakibat energinya turun.
Pergeseran merah terjadi akibat bertambahnya kepolaran pelarut, disebabkan gaya
polarisasi antara pelarut dan spesies, sehingga berakibat menurunnya selisih tingkat
energy eksitasi dan tingkat tidak tereksitasi.

Berikut adalah contoh penginterpretasian spectra uv-vis suatu senyawa organic yang
dikutip dari Gafur, Maryati dan Abd. Gafur mengenai Isolasi dan Identifikasi Senyawa
Flavonoid dari Daun Jamblang. Dari spectrum yang tampak, terdapat dua pita yang
dihasilkan oleh isolate murni dalam pelarut methanol. Pita pertama mempunyai panjang
gelombang 290 nm dan pita kedua mempunyai panjang gelombang 216 nm. Serapan
pada panjang gelombang 290 nm diduga adanya transisi elektron-elektron yang tidak
berikatan ke orbital anti ikatan n  π* oleh suatu gugus C=O. Serapan ini terjadi pada
panjang gelombang yang panjang intensitasnya rendah (Sastrohamidjojo, 2001). Menurut
Mulja (1995), gugus karbonil C=O akan menyebabkan eksitasi elektron n  π* yaitu
eksitasi elektron yang berasal dari elektron bebas oksigen karbonil ke orbital inti ikatan
rangkap gugus karbonil sendiri. Sedangkan serapan pada panjang gelombang 216 nm
diduga adanya transisi elektron-elektron π  π* yang dapat diperkirakan adanya ikatan
C=C terkonjugasi yang terjadi pada panjang gelombang 210 – 285 nm (Satrohamidjojo,
1991). Transisi ini dapat terjadi jika suatu molekul organic mempunyai gugus fungsional
yang tidak jenuh sehingga ikatan rangkap dalam gugus tersebut memberikan orbital π
yang diperlukan (Gandjar dan Rohman, 2008).
Berikut contoh lain dari interpretasi spectrum spektroskopi UV-VIS dalam identifikasi
struktur suatu senyawa organic yang dikutip dari Muhammad Titis B.M dkk mengenai
Isolasi, Identifikasi dan Uji Aktifitas Senyawa Alkaloid Daun Binahong