SPEKTROFOTOMETRI

➢ Pengertian

Spektrofotometer adalah alat laboratorium yang digunakan untuk mengukur

intensitas cahaya yang diserap oleh suatu sampel. Alat ini banyak digunakan dalam
berbagai bidang, seperti kimia, biologi, dan ilmu material. Metode pengukuran
kuantitatif yang didasarkan pada pengukuran absorbsi (penyerapan) radiasi
gelombang elektromagnetik. Cahaya nya berupa UV, cahaya visible, dan infra merah
serta materi berupa atom dan molekul. Sederhananya, alat ini berfungsi untuk melihat
spektrum cahaya dari sebuah senyawa yang akan muncul jika dipanaskan dalam suhu
tinggi. Spektrofotometer akan membantu dalam mengukur konsentrasi molekul
seperti protein, DNA, dan juga kultur dari sebuah sel bakteri. Hasil dari alat ini juga
tergolong akurat yang dapat langsung dibaca dan dicatat dengan mudah.

➢ Komponen
▪ Sumber cahaya :
1. Lampu Tungsten (Wolfram) : Lampu ini digunakan untuk mengukur sampel
pada daerah tampak. Bentuk lampu ini mirip dengna bola lampu pijar biasa.
Memiliki panjang gelombang antara 350-2200 nm. Spektrum radiasianya
berupa garis lengkung. Umumnya memiliki waktu 1000 jam pemakaian.
2. Lampu Deuterium : Lampu ini dipakai pada panjang gelombang 190-380 nm.
Spektrum energi radiasinya lurus, dan digunakan untuk mengukur sampel
yang terletak pada daerah uv. Memiliki waktu 500 jam pemakaian.
▪ Monokromator
Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu
mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya
monaokromatis. Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalan
gratting atau lensa prisma dan filter optik. Jika digunakan grating maka cahaya
akan dirubah menjadi spektrum cahaya. Sedangkan filter optik berupa lensa
berwarna sehingga cahaya yang diteruskan sesuai dengan warnya lensa yang
dikenai cahaya. Ada banyak lensa warna dalam satu alat yang digunakan
sesuai dengan jenis pemeriksaan. Monokromator, terdiri atas :
1. Prisma, berfungsi mendispersikan radiasi elektromagnetik sebesar
mungkin supaya di dapatkan resolusi yang baik dari radiasi
polikromatis.
2. Kisi difraksi, berfungsi menghasilkan penyebaran dispersi sinar secara
merata, dengan pendispersi yang sama, hasil dispersi akan lebih baik.
Selain itu kisi difraksi dapat digunakan dalam seluruh jangkauan
spektrum.
3. Celah optis, berfungsi untuk mengarahkan sinar monokromatis yang
diharapkan dari sumber radiasi. Apabila celah berada pada posisi yang
tepat, maka radiasi akan dirotasikan melalui prisma, sehingga
diperoleh panjang gelombang yang diharapkan.
 4. Filter, berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga
cahaya yang diteruskan merupakan cahaya berwarna yang sesuai
dengan panjang gelombang yang dipilih.
▪ Tempat sampel

Spektrofotometer UV-VIS menggunakan kuvet sebagai wadah sampel yang akan

dianalisis. Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa
yang terbuat dari silika memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang
terbuat dari kaca dan plastik dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya
pada spektrofotometer sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk persegi
panjang dengan lebar 1 cm.Kuvet yang baik harus memenuhi beberapa syarat
sebagai berikut :

a. Permukaannya harus sejajar secara optis

b. Tidak berwarna sehingga semua cahaya dapat di transmisikan
c. Tidak ikut bereaksi terhadap bahan-bahan kimia
d. Tidak rapuh
e. Bentuknya sederhana
▪ Detektor
Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan
mengubahnya menjadi arus listrik. Macam-macam detektor yang biasa digunakan:
1. Phototube dengan jangkauan panjang gelombang ( λ) 150 – 1000 nm
2. Photomultiplier dengan jangkauan panjang gelombang ( λ) 150 – 1000 nm

Syarat-syarat sebuah detektor :

▪ Kepekaan yang tinggi

▪ Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
▪ Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
▪ Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
▪ Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.
▪ Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat
listrik yang berasal dari detektor.
➢ Prinsip
Prinsip kerjanya adalah berdasarkan dispersi cahaya dan memelukan cermin prisma.
Dispersi cahaya sendiri merupakan kondisi di mana sebuah cahaya putih terurai atau
menyebar menjadi beberapa spektrum warna.

Cermin prisma berfungsi untuk memunculkan dispersi cahaya tersebut yang akan
dilingkupi sebuah wadah khusus agar cahaya tidak bocor. Namun, seiring
perkembangannya, cermin prisma biasanya digantikan dengan grating. Grating adalah
cermin yang memiliki ribuan alur yang sejajar di bagian permukaannya.

Selanjutnya, sumber cahaya akan menembakkan cahaya putih menuju lensa kolimator
yang berfungsi untuk menjajarkan cahaya. Setelah itu, cermin prisma akan menerima
 cahaya yang selanjutnya akan terurai. Hanya akan ada satu cahaya yang akhirnya
akan keluar.
Dari tahap inilah, kecepatan dan panjang gelombang dapat diukur. Umumnya dispersi
pada prisma akan menghasilkan kecepatan dan panjang gelombang cahaya yang
berbeda-beda. Karena panjang gelombang pada masing-masing warna juga sudah
berbeda.

Prinsip kerja spektrofotometer juga mengikuti hukum Lambert Beer. Hukum Lambert
Beer adalah sebuah hukum yang berhubungan erat dengan intensitas cahaya serta
absorbsi. Umumnya intensitas cahaya bergantung pada konsentrasi sampel yang
digunakan.
Hukum Lambert Beer merupakan dasar dari fotometri ketika menganalisa sebuah
sampel. Bila cahaya monokromatik melalui larutan, maka cahaya akan diserap,
sebagian dipantulkan, dan bagian lainnya akan dipancarkan. Berikut adalah ketentuan
agar hukum Lambert Beer dapat berjalan:
• Sebuah cahaya yang masuk atau mengenai sampel adalah cahaya dengan
panjang gelombang monokromatik.
• Cahaya yang terabsorbsi tidak dipengaruhi oleh hal yang lain di dalam larutan
tersebut.
• Absorbsi dapat terjadi dalam volume yang memiliki penampang yang sama.
• Tidak terjadi fosforesensi dan fluoresensi.
• Indeks bias umumnya tidak bergantung pada konsentrasi di dalam larutan.
Jadi, larutan seharusnya tidak pekat dan harus encer.
➢ Jenis – Jenis
• Spektrofotometri UV Vis
Jenis spektrofotometer UV-VIS umumnya berfungsi untuk mengukur
absorbansi bahan dan analisis kuantitatif pada sinar tampak (visible), UV, atau
ultraviolet. Rentang panjang gelombang terukur dari spektrofotometer tampak
ultraviolet adalah 200 ~ 1100 nm di wilayah ultraviolet.

Sekarang ini, spektrofotometer UV Vis merupakan salah satu instrumen

analisis yang paling banyak digunakan dengan cakupan bidang ilmu terluas.
Mulai dari ilmu kehidupan, ilmu material, ilmu lingkungan, ilmu pertanian,
kimia, dan teknik kimia.

Kinerjanya dipengaruhi oleh komposisi sampel yang memungkinkan untuk

mengetahui informasi tentang sampel dan konsentrasinya. Karena teknik
spektroskopi ini bergantung pada penggunaan cahaya, perlu
mempertimbangkan sifat-sifat cahaya dalam menganalisis sampel.

Pertama, cahaya memiliki sejumlah energi yang berbanding terbalik dengan

panjang gelombangnya. Jadi, panjang gelombang cahaya yang lebih pendek
 membawa lebih banyak energi dan panjang gelombang yang lebih panjang
membawa lebih sedikit energi.

Manusia dapat melihat spektrum cahaya tampak (visible), dari kira-kira 380
nm (yang Anda lihat sebagai warna ungu), hingga 780 nm (yang Anda lihat
sebagai merah). Satu sinar UV memiliki panjang gelombang lebih pendek dari
cahaya tampak hingga sekitar 100 nm.

Oleh karena itu, cahaya dapat terurai dengan panjang gelombangnya. Inilah
yang digunakan dalam spektrofotometer UV Vis untuk menganalisis atau
mengidentifikasi zat yang berbeda dengan menempatkan panjang gelombang
spesifik yang sesuai dengan absorbansi maksimum.
• Atomic emission spectroscopy Spektrofotometer AAS
AAS merupakan instrumen laboratorium yang berfungsi untuk menganalisis
konsentrasi unsur dalam sampel cair. Analisisnya dilakukan berdasarkan
energi yang diserap dari panjang gelombang cahaya tertentu (biasanya 190
hingga 900 nm).

Spektrofotometer ini biasanya mencakup pembakar api untuk atomisasi

sampel (paling sering lampu katoda berongga), monokromator, dan detektor
foton. Tergantung pada modelnya, beberapa spektrometer serapan atom
umumnya memiliki turret atau soket lampu tetap.

Bagian tersebut mampu menampung hingga delapan sumber cahaya untuk

mengurangi waktu henti antara sampel atau memungkinkan analisis berurutan.
Spektrofotometer serapan atom digunakan di banyak industri, misalnya
pengujian lingkungan, analisis logam, produksi minyak dan kimia, farmasi,
dan lain sebagainya.

Jika Anda menggunakan instrumen ini, pertama-tama Anda harus

mengatomisasi sampel terlebih dahulu, sehingga panjang gelombang
karakteristiknya dipancarkan dan terekam. Kemudian, selama eksitasi,
elektron naik satu tingkat energi di atom masing-masing, ketika atom tersebut
menyerap energi tertentu.

Energi ini sesuai dengan panjang gelombang tertentu yang merupakan

karakteristik elemen. Tergantung pada panjang gelombang cahaya dan
intensitasnya, elemen tertentu dapat Anda deteksi dan konsentrasinya bisa
Anda ukur. Biasanya, alat ini ampuh untuk menganalisis material maupun
unsur logam jejak (semimetal).
• Mass spectroscopy MS
Spektrometri massa adalah alat analisis yang berguna untuk mengukur rasio
massa terhadap muatan ( m/z ) dari satu atau lebih molekul yang ada dalam
 sampel. Pengukuran ini seringkali juga dapat digunakan untuk menghitung
berat molekul yang tepat dari komponen sampel. Biasanya, spektrometer
massa dapat digunakan untuk mengidentifikasi senyawa yang tidak diketahui
melalui penentuan berat molekul, untuk mengukur senyawa yang diketahui,
dan untuk menentukan struktur dan sifat kimia suatu molekul.
Spektrometer massa setidaknya terdiri dari tiga komponen berikut:
1. Sumber Ionisasi

Molekul diubah menjadi ion fase gas sehingga dapat dipindahkan dan
dimanipulasi oleh medan listrik dan magnet eksternal. Di laboratorium kami,
kami menggunakan teknik yang disebut ionisasi nanoelectrospray, yang agak
mirip dengan cara pengecatan mobil secara industri. Metode ini
memungkinkan terciptanya ion bermuatan positif atau negatif, bergantung
pada persyaratan eksperimen. Ionisasi nanoelectrospray dapat secara langsung
memasangkan saluran keluar kolom kromatografi skala kecil langsung ke
saluran masuk spektrometer massa. Aliran dari kolom dilewatkan melalui
jarum yang ujungnya 10-15 um.

2. Penganalisis Massa

Setelah terionisasi, ion-ion tersebut diurutkan dan dipisahkan menurut rasio

massa terhadap muatan ( m/z ). Ada sejumlah alat analisa massa yang tersedia
saat ini, masing-masing memiliki trade-off yang berkaitan dengan kecepatan
operasi, resolusi pemisahan, dan persyaratan operasional lainnya. Jenis
spesifik yang digunakan di Broad Institute dibahas di bagian selanjutnya.
Penganalisis massa sering kali bekerja bersama dengan sistem deteksi ion.

3. Sistem Deteksi Ion

Ion-ion yang terpisah kemudian diukur dan dikirim ke sistem data di mana
rasio m/z disimpan bersama dengan kelimpahan relatifnya. Spektrum massa
hanyalah rasio m/z dari ion-ion yang ada dalam sampel yang diplot terhadap
intensitasnya. Setiap puncak dalam spektrum massa menunjukkan komponen
m/z unik dalam sampel, dan ketinggian puncak menunjukkan kelimpahan
relatif berbagai komponen dalam sampel.
• Nuclear magnetic resonance (NMR)
Spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR) adalah studi tentang molekul
dengan merekam interaksi radiasi elektromagnetik frekuensi radio (Rf) dengan
inti molekul yang ditempatkan dalam medan magnet yang kuat.
Banyak inti atom yang berputar, dan semua inti bermuatan listrik, sesuai
dengan prinsip NMR. Perpindahan energi dari energi dasar ke tingkat energi
yang lebih tinggi dapat dicapai jika diberikan medan magnet luar semua inti
bermuatan listrik dan banyak yang berputar. Perpindahan energi
 dimungkinkan dari energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi ketika
medan magnet luar diterapkan. Perpindahan energi terjadi pada panjang
gelombang yang bertepatan dengan frekuensi radio.
Selain itu, energi dipancarkan pada frekuensi yang sama ketika putaran
kembali ke tingkat dasarnya. Oleh karena itu, dengan mengukur sinyal yang
cocok dengan transfer ini, pemrosesan spektrum NMR untuk inti yang
bersangkutan akan menghasilkan hasil.
Fungsi dari NMR
1) Tempatkan sampel di medan magnet.
2) Rangsang sampel inti menjadi resonansi magnetik nuklir dengan
bantuan gelombang radio untuk menghasilkan sinyal NMR
3) Sinyal NMR ini dideteksi dengan penerima radio yang sensitif.
4) Frekuensi resonansi atom dalam suatu molekul diubah oleh medan
magnet intramolekul yang mengelilinginya.
5) ini memberikan rincian gugus fungsi individu suatu molekul dan
struktur elektroniknya.
6) Spektroskopi resonansi magnetik nuklir adalah metode konklusif untuk
.engidentifikasi senyawa organik monomolekul.
7) Metode ini memberikan rincian keadaan reaksi, struktur, lingkungan
kimia dan dinamika suatu molekul.
• Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy
Spektrofotometer Fourier Transform Infra-Red atau FTIR merupakan alat
laboratorium yang digunakan untuk mengetahui spektrum vibrasi molekul
yang digunakan untuk memprediksi suatu struktur dari senyawa kimia. Dalam
bahasa Indonesia FTIR disebut Spektroskopi Inframerah Transformasi Fourier,
merupakan metode pengukuran sederhana yang digunakan untuk mendeteksi
struktur molekul senyawa melalui gugus fungsi penyusun senyawa. Infra-Red
merupakan sinar yang dihasilkan oleh proses di dalam molekul dan benda
panas. Keberadaan inframerah juga tidak dapat dilihat oleh manusia. Selain
itu, Inframerah juga tidak dapat menembus materi yang tidak tembus pandang.
FTIR berfungsi untuk mengidentifikasi senyawa dan menganalisis campuran
sampel tanpa merusak sampelnya. FTIR memiliki daerah inframerah pada
spektrum gelombang elektromagnetik dengan panjang gelombang 14000 cm-1
hingga 10-1 atau berkisar antara 2,50-50 µm.
FTIR menggunakan metode bebas reagen, yaitu tanpa penggunaan radioaktif
dan dapat mengukur kadar hormon secara kuantitatif dan kualitatif. Analisis
gugus fungsi dilakukan dengan cara membandingkan pita serapan yang
terbentuk pada spektrum inframerah menggunakan spektrum pembanding
yang telah diketahui sebelumnya.

Prinsip kerja FTIR dimulai saat berkas inframerah dari sumber diteruskan ke
interferometer. Kemudian, inframerah akan dipecah oleh beam splitter menjadi
dua bagian sinar yang saling tegak lurus. Sinar inframerah ini kemudian
dipantulkan oleh dua cermin (cermin statistik dan cermin bergerak).
Selanjutnya, hasil pantulan dari kedua cermin dipantulkan kembali menuju
beam splitter untuk saling berinteraksi. Sebagian inframerah akan diserap oleh
sampel dan sebagian lagi dibiarkan ke detektor.Gerakan cermin yang maju
mundur akan menyebabkan sinar inframerah pada detektor berfluktuasi dan
saling menguatkan ketika kedua cermin memiliki jarak yang berbeda.
Fluktuasi inframerah yang sampai pada detektor akan memberikan sinyal pada
detektor di interferometer. Sinyal tersebut kemudian akan diproses menjadi
angka, dapat berupa persen ataupun bilangan gelombang.