1

Mengapa warna dapat dilihat?

2
Spektrofotometri
Spektrofotometri adalah sebuah metode analisis untuk mengukur konsentrasi
suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi
berkas sinar atau cahaya.
Spektrofotometri adalah alat yang terdiri dari spektrofotometer dan fotometer.
Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang
tertentu, sementara
fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau
diabsorpsi.

Istilah spektrofotometri berhubungan dengan pengukuran energi radiasi yang

diserap oleh suatu sistem sebagai fungsi panjang gelombang dari radiasi
maupun pengukuran panjang absorpsi terisolasi pada suatu panjang gelombang
tertentu (Underwood 1994). 3
Spektrofotometer UV-Vis
 Pengukuran panjang gelombang & intensitas
cahaya tampak yg diabsorbsi oleh sampel.
 Sinar UV & cahaya tampak memiliki energi yang
cukup untuk mempromosikan elektron pd kulit
terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi.
 Spektrum UV-Vis biasanya digunakan untuk
molekul dan ion anorganik/ kompleks dlm
larutan.
 Spektrum UV-vis tdk dapat meinformasikan
ttg struktur senyawa
 Guna: analisa kualitatif. Dan kuantitatif
4
Secara umum spektrofotometri dibedakan
menjadi empat macam, yaitu :

a) Spektrofotometer ultraviolet

b) Spektrofotometer sinar tampak

c) Spektrofotometer infra merah

d) Spektrofotometer serapan atom

5
 The SPECTROstar Nano represents a revolution in absorbance measurement instrumentation with the flexibility to perform
assays quickly and easily in both microplates or via the built-in cuvette port. Using a spectrometer, this new absorbance
microplate reader captures a full UV-Visible spectrum (220 to 1000 nm) in less than 1 sec/well and measures sample
volumes down to 2 µL. The speed of the spectrometer, simple push button operation, and the capacity to design and save
individual assay protocols give users an unmatched flexibility to optimize settings for all absorbance experiments.

The SPECTROstar Nano also includes the following outstanding features

Ultra-fast UV/Vis absorbance spectrometer
 Captures a spectrum from 220 to 1000 nm in less than 1 s/well

Selectable spectral resolution of 1 - 10 nm

6- to 1536-well microplate format compatibility

Low volume 2 µL measurements for DNA, RNA, protein, etc.

Standard cuvette port for individual samples

Incubation up to 45°C for microplate and cuvette

Gas vent for atmospheric sensitive samples

Well scanning, kinetic and endpoint measurements

Multimode plate shaking capabilities

6
 Tipe Dan Analisis Spektrofotometri
UV-Vis instrument
Single-beam
Single-beam instrument dapat digunakan untuk
kuantitatif dengan mengukur absorbansi pada panjang
gelombang tunggal. Single-beam instrument mempunyai
beberapa keuntungan yaitu sederhana, harganya murah,
dan mengurangi biaya yang ada merupakan keuntungan
yang nyata. Beberapa instrumen menghasilkan single-
beam instrument untuk pengukuran sinar ultra violet
dan sinar tampak. Panjang gelombang paling rendah
adalah 190 sampai 210 nm dan paling tinggi adalah 800
sampai 1000 nm (Skoog, DA, 1996).

7
Double-beam instrument
Double-beam dibuat untuk digunakan pada panjang
gelombang 190 sampai 750 nm. Double-beam
instrument dimana mempunyai dua sinar yang
dibentuk oleh potongan cermin yang berbentuk V
yang disebut pemecah sinar. Sinar pertama melewati
larutan blangko dan sinar kedua secara serentak
melewati sampel, mencocokkan fotodetektor yang
keluar menjelaskan perbandingan yang ditetapkan
secara elektronik dan ditunjukkan oleh alat pembaca
(Skoog, DA, 1996).

8
9
Sinar Uv : panjang gelombang() 200-400 nm
Sinar tampak (visible): 400-800 nm
Pjg gelombang adalah: jarak antara satu lembah dan
satu puncak
Frekwensi: kecepatan cahaya dibagi pjg gelombang.
Bilangan gelombang : disturban maksimum dari garis
horizontal

10
 Violet: 400 - 420 nm

 Indigo: 420 - 440 nm

 Blue: 440 - 490 nm

 Green: 490 - 570 nm

 Yellow: 570 - 585 nm

 Orange: 585 - 620 nm

 Red: 620 - 780 nm

11
 Spektrum elektromagnetik terdiri dari urutan gelombang dengan sifat-sifat yang berbeda.
Kawasan gelombang penting di dalam penelitian biokimia adalah ultra lembayung (UV, 180-
350 nm) dan tampak (VIS, 350-800 nm). Cahaya di dalam kawasan ini mempunyai energi
yang cukup untuk mengeluarkan elektron valensi di dalam molekul tersebut (Keenan 1992).

Penyerapan sinar UV-Vis dibatasi pada sejumlah gugus fungsional atau gugus kromofor
yang mengandung elektron valensi dengan tingkat eksutasi rendah. Tiga jenis elektron yang
terlibat adalah sigma, phi, dan elektron bebas. Kromofor-kromofor organik seperto karbonil,
alkena, azo, nitrat, dan karboksil mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak
 Panjang gelombang maksimumnya dapat berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan.
Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elektron bebas nseperti hidroksil,
metoksi, dan amina. Terkaitnya gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita
absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar dan disertai dengan peningkatan
intensitas (Hart 2003).

12
 Ketika cahaya melewati suatu larutan biomolekul, terjadi dua kemungkinan.

Kemungkinan pertama adalah cahaya ditangkap dan kemungkinan kedua adalah

cahaya discattering. Bila energi dari cahaya (foton) harus sesuai dengan perbedaan
energi dasar dan energi eksitasi dari molekul tersebut. Proses inilah yang menjadi
dasar pengukuran absorbansi dalam spektrofotometer (Aisyah 2009).
Cara kerja spektrofotometer dimulai dengan dihasilkannya cahaya monokromatik
dari sumber sinar. Cahaya tersebut kemudian menuju ke kuvet (tempat sampel/sel).
Banyaknya cahaya yang diteruskan maupun yang diserap oleh larutan akan dibaca
oleh detektor yang kemudian menyampaikan ke layar pembaca (Hadi 2009)

13
Instrumentasi UV-vis
Sumber cahaya : lampu hidrogen/deuterium dan
lampu tungsten
Monokromator( prisma)
Kuvet, tempat sampel
Detektor
Sumber cahaya tunggal
Sumber cahaya ganda

14
 Fungsi masing-masing bagian:

1.Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan
berbagai macam rentang panjang gelombang. Untuk sepktrofotometer
•UV menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen
•VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram
•UV-VIS menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator.
•Infra merah, lampu pada panjang gelombang IR.

2.Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah
cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis.
Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalan gratting atau lensa
prisma dan filter optik.
Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi spektrum cahaya.
Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya yang diteruskan
sesuai dengan warnya lensa yang dikenai cahaya. Ada banyak lensa warna dalam
satu alat yang digunakan sesuai dengan jenis pemeriksaan.

15
 3.Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel

oUV, VIS dan UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat
dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika memiliki kualitas
yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca dan plastik dapat menyerap UV
sehingga penggunaannya hanya pada spektrofotometer sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya
berbentuk persegi panjang dengan lebar 1 cm.
oIR, untuk sampel cair dan padat (dalam bentuk pasta) biasanya dioleskan pada dua
lempeng natrium klorida. Untuk sampel dalam bentuk larutan dimasukan ke dalam sel natrium
klorida. Sel ini akan dipecahkan untuk mengambil kembali larutan yang dianalisis, jika sampel
yang dimiliki sangat sedikit dan harganya mahal.

16
 4.Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan
mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :
•Kepekaan yang tinggi
•Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
•Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
•Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
•Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.

Macam-macam detektor :
•Detektor foto (Photo detector)
•Photocell, misalnya CdS.
•Phototube
•Hantaran foto
•Dioda foto
•Detektor panas

5.Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik
yang berasal dari detektor.

17
Rotates, to achieve scan
Matched quartz cuvettes
Sample in solution at ca. 10-5 M.
System protects PM tube from
stray light
D2 lamp-UV
Tungsten lamp-Vis
Double Beam makes it a
Two photomultiplier difference technique
inputs, differential
voltage drives amplifier.

18
Ketika suatu atom /molekul menyerap cahaya
maka energi tersebut akan menyebabkan tereksitasinya elektron
Ke panjang gelombang yang lebih tinggi
Tipe ekstasi tergantung pd panjang gelombang cahaya yang diserap
Sinar UV dan cahaya tampak akan menyebabkan elektron
tereksitasi ke orbital yang lebih tinggi
Sistem yang bertanggung jawab terhadap absorbsi cahaya disebut
kromofor

19
 π* π* π* Example
π* π* π* for a
π* π* π* simple
enone
n n n
π π π
π π π
-*; max=218 n-*; max=320
=11,000 =100

Example:   * transitions responsible for ethylene UV absorption at ~170 nm

calculated with ZINDO semi-empirical excited-states methods (Gaussian 03W):

h 170nm photon

LUMO g antibonding molecular20

orbital
HOMO u bonding molecular orbital
21
 One thing is clear
Uvs can be very non-specific
Its hard to interpret except at a cursory
level, and to say that the spectrum is
consistent with the structure
Each band can be a superposition of many
transitions
Generally we don’t assign the particular
transitions.

From Skoog and West et al. Ch 14 22

Frequently
plotted as log
of molar

extinction 
So at 240 nm,
pulegone has O

a molar
extinction of
7.24 x 103
Antilog of 3.86

23
 O O
 


202 227 239
 215
Base Values, add these increments…
X=H 207    
x Extnd C=C +30
X=R 215 Add exocyclic C=C +5
X=OH 193 Homoannular diene +39
X=OR 193
alkyl +10 +12 +18 +18
With solvent correction
of….. OH +35 +30 +50
Water +8 OAcyl +6 +6 +6 +6
EtOH 0 O-alkyl +35 +30 +17 +31
CHCl3 -1 NR2
Dioxane -5 S-alkyl
Et2O -7 Cl/Br +15/+25 +12/+30
24
Hydrcrbn -11
 Base value 217
2 x alkyl subst. 10
exo DB 5
total 232
Obs. 237

Base value 214

3 x alkyl subst. 30
exo DB 5
total 234
Obs. 235

O Base value 215

2 ß alkyl subst. 24
total 239
Obs. 237
25
 Base value 214
4 x alkyl subst. 20
exo DB 5
total 239
Obs. 238
HO2C

Base value 253

4 x alkyl subst. 20
total 273
Obs. 273

HO2C
26
max 253 239 256 248

27
Spektrofotometri UV Visible adalah pengukuran dan interpretasi radiasi
elektromagnetik (cahaya) yang diabsorpsi atau diemisikan oleh molekul pada
panjang gelombang 200-800 nanometer.
Dimana sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, sementara
sinar tampak mempunyai panjang gelombang 400-800 nm.
Sinar ultraviolet dan sinar tampak memberikan energi yang cukup untuk
terjadinya transisi elektronik. Dengan demikian, spektra uv-visible disebut spektra
elektronik. Keadaan energi yang paling rendah disebut dengan keadaan dasar
(ground state). Transisi-transisi elektronik akan meningkatkan energi molekuler
dari keadaan dasar ke satu atau lebih tingkat energi tereksitasi.
Jika suatu molekul sederhana dikenakan radiasi elektromagnetik maka
molekul tersebut akan menyerap radiasi elektromagnetik yang energinya sesuai.
Interaksi antara molekul dengan radiasi elektromagnetik ini akan meningkatkan
energi potensial elektron pada tingkat keadaan tereksitasi.
Jika suatu radiasi elektromagnetik menembus suatu larutan yang berada
dalam suatu bejana gelas, maka sebagian cahaya akan diserap oleh larutan dan
selebihnya akan dilewatkan.
Bagian yang diserap akan diukur dengan besaran absorban (A) atau ekstingsi yang diberi
lambang ε, dan yang diteruskan disebut
tranmisi, hubungan antara A dan T dapat dirumuskan sebagai berikut:
A = -Log T

Senyawa yang dapat menyerap cahaya tersebut adalah senyawa yang memiliki
pasangan elektron yang tidak berpasangan atau gugus kromoform .

28
PENENTUAN KADAR PARASETAMOL
DENGAN SPEKTROMETRI UV- VIS
PROSEDUR PRAKTIKUM
A. Pembuatan larutan NaOH 0,1 N
1.Ambil 50 ml NaOH 1 N
2.Letakkan di labu takar 500 ml
3.Lalu adkan sampai batas yang tertera, lalu dikocok-
kocok hingga merata

29
 B. Pembuatan Larutan Baku

1.Timbang kertas perkamen terlebih dahulu
2.Timbang dengan seksama 75 mg atau 0,075 g parasetamol baku
3.Masukan ke dalam labu terukur 100 ml
4.Tambahkan larutan NaOH 0,1 N yang telah dibakukan hingga batas
100 ml, kocok sampai larut
5.Saring dengan menggunakan kertas saring lalu letakkan pada beker
glass
6.Pipet 1 ml masukan pada labu terukur lainnya 100 ml.
7.Tambahkan larutan NaOH 0,1 N yang telah dibakukan hingga batas
100 ml, kocok sampai larut
8.Beri label parasetamol baku

30
 C. Pembuatan Larutan Sampel
•Timbang satu per satu tablet parasetamol sebanyak 20 tablet, lalu
cari bobot rata-ratanya
•Timbang dengan seksama parasetamol sampel yang hasil
penimbangannya tersebut
•Masukan ke dalam labu terukur 100 ml
•Tambahkan larutan NaOH 0,1 N yang telah dibakukan hingga batas
100 ml, kocok sampai larut
•Saring dengan menggunakan kertas saring lalu letakkan pada beker
glass
•Pipet 1 ml masukan pada labu terukur lainnya 100 ml.
•Tambahkan larutan NaOH 0,1 N yang telah dibakukan hingga batas
100 ml, kocok sampai larut
•Beri label parasetamol sampel

31
V.PERHITUNGAN BAHAN
Perhitungan untuk NaOH 0,1 N
Yang tersedia di laboratorium 1 N
Yang dicari adalah 0,1 N maka dilakukan pengenceran
terlebih dahulu.
V1.N1 = V2.N2
V1.N1 = 500 x 0,01
V1 = 5/1
V1 = 5 N → ad. kan dengan 500 ml aqua dest
Perhitungan Penimbangan Bahan
Untuk Larutan Baku :
Kertas perkamen I : 0,3601 g

32
 Paracetamol : 0,0750 g +
0,4351 g
Kertas perkamen II : 0,3583 g
Untuk Larutan Sampel :
Kertas perkamen I : 0,3550 g
Paracetamol : 0,0900 g +
0,4450 g
Kertas perkamen II : 0,3522 g

Perhitungan Pembuatan Sample

Timbang satu per satu tablet dan gerus untuk mencari bobot rata-rata
Kadar etiket = 500 mg
Bobot rata-rata 20 tablet = 0,6043 g
Penimbangan sample = Bobot rata-rata x Kesetaraan
Kadar etiket
= 0,6043 g x 0,075 g
0,500
= 0,0906584 g
= 0,090 g

33
 .HASIL PRAKTIKUM
Tabel Pengukuran Transmitan ( T ) larutan sampel dan larutan pembanding
pada max
Zat : Paracetamol
Pelarut : NaOH 0,01 N
max : 257 nm
No Larutan Bobot Zat Absorbansi
1 Pembanding/baku 0,075 g 0,5356
2 Sampel 0,090 g 0,6313

Cara Penetapan
Ukur serapan larutan sampel dan larutan baku dengan menggunakan
spektrofotometer UV pada panjang gelombang baku lebih kurang 257 nm dan
digunakan NaOH 0,01 N sebagai blanko. Hitung kadar zat aktif sampel dengan
menggunakan rumus :

34
 Perhitungan Kadar Zat Aktif
Kadar zat aktif sampel
= Bobot rata-rata x Absorben sampel x Faktor Pengenceran Sampel x
Bobot Baku Pembanding
Bobot Sampel Absorben baku Faktor Pengenceran Baku
= 0,6043 g x 0,6313 g x 10.000 x 0,075
0,0928 g 0,5356 g 10.000
= 6,511 g x 1,179 g x 1 x 0,075 g
= 0,575 g
= 575 mg
Persentase kadar
= Kadar zat aktif sampel x 100 %
Kadar pada kemasan
= 594 mg x 100 %
500 mg
= 115 %

35