Laporan Praktikum

Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Teori

Spektrofotometri adalah suatu metode analisis yang berdasarkan pada

pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada
panjang gelombang yang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau
kisi difraksi dan detector vacuum phototube atau tabung foton hampa. Alat yang
digunakan adalah spektrofotometer, yaitu sutu alat yang digunakan untuk menentukan
suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun kualitatif dengan mengukur transmitan
ataupun absorban dari suatu cuplikan sebagai fungsi dari konsentrasi. Spektrometer
menghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Harjadi,
1990).
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu
sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan
spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri
(Basset, 1994).
Spektrometri UV-Vis adalah salah satu metoda analisis yang berdasarkan pada
penurunan intensitas cahaya yang diserap oleh suatu media. Berdasarkan penurunan
intensitas cahaya yang diserap oleh suatu media tergantung pada tebal tipisnya media
dan konsentrasi warna spesies yang ada pada media tersebut. Spektrometri visible
umumnya disebut kalori, oleh karena itu pembentukan warna pada metoda ini sangat
menentukan ketelitian hasil yang diperoleh. Pembentukan warna dilakukan dengan
cara penambahan pengompleks yang selektif terhadap unsur yang ditentukan
(Fatimah, 2005).
Spektrofotometri menyiratkan pengukuran jauhnya penyerapan energi cahaya
oleh suatu sistem kimia itu sebagai suatu fungsi dari panjang gelombang radiasi,
demikian pula pengukuran penyerapan yang menyendiri pada suatu panjang
gelombang tertentu (Underwood, 1986).

Sonata Daniatiek
04112681620045

Laporan Praktikum
Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

Spektrofotometri ini hanya terjadi bila terjadi perpindahan elektron dari tingkat
energi yang rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi. Perpindahan elektron tidak
diikuti oleh perubahan arah spin, hal ini dikenal dengan sebutan tereksitasi singlet
(Khopkar, 1990).
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu
sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan
spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri.
Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan
studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel
diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu perkam untuk
menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda (Saputra,
2009).
Salah satu contoh instrumentasi analisis yang lebih kompleks adalah
spektrofotometer UV-Vis. Alat ini banyak bermanfaat untuk penentuan konsentrasi
senyawa-senyawa yang dapat menyerap radiasi pada daerah ultraviolet (200 400
nm) atau daerah sinar tampak (400 800 nm). Analisis ini dapat digunakan yakni
dengan penentuan absorbansi dari larutan sampel yang diukur.
Prinsip penentuan spektrofotometer UV-Vis adalah aplikasi dari Hukum LambertBeer, yaitu:
A = log T = log It / I0 = . b . C
Dimana:
A = Absorbansi dari sampel yang akan diukur
T = Transmitansi
I0 = Intensitas sinar masuk
It = Intensitas sinar yang diteruskan
= Serapan molar
b = Tebal kuvet yang digunakan

Sonata Daniatiek
04112681620045

Laporan Praktikum
Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

C = Konsentrasi dari sampel

(Tahir, 2009).
Dari persamaan di atas dapat diketahui bahwa serapan (A) tidak memiliki satuan
dan biasanya dinyatakan dengan unit absorbansi. Serapan molar pada persamaan di
atas adalah karakteristik suatu zat yang menginformasikan berapa banyak cahaya
yang diserap oleh molekul zat tersebut pada panjang gelombang tertentu. Semakin
besar nilai serapan molar suatu zat maka semakin banyak cahaya yang diabsorbsi
olehnya, atau dengan kata lain nilai serapan (A) akan semakin besar.
Hukum Lambert-Beer di atas berlaku pada larutan dengan konsentrasi kurang
dari sama dengan 0.01 M untuk sebagian besar zat. Namun, pada larutan dengan
konsentrasi pekat maka satu molekul terlarut dapat memengaruhi molekul terlarut lain
sebagai akibat dari kedekatan masing-masing molekul pada larutan dengan
konsentrasi yang pekat tersebut. Ketika satu molekul dekat dengan molekul yang lain
maka nilai serapan molar dari satu molekul itu akan berubah atau terpengaruh. Secara
keseluruhan, nilai absorbansi yang dihasilkan pun ikut terpengaruh, sehingga secara
kuantitatif nilai yang ditunjukkan tidak mencerminkan jumlah molekul yang diukur di
dalam larutan uji.
Adapun instrument dari spektrofotometri UV-vis yaitu:
1. Sumber radiasi
Sumber radiasi pada spektrofotometer harus memiliki panacaran radiasi yang
stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber radiasi pada spektrofotometer UV-Vis ada tiga
macam:
A. Sumber radiasi Tungsten (Wolfram), Lampu ini digunakan untuk mengukur sampel
pada daerah tampak. Bentuk lampu ini mirip dengna bola lampu pijar biasa. Memiliki
panjang gelombang antara 380-900 nm. Spektrum radiasianya berupa garis lengkung.
Umumnya memiliki waktu 1000 jam pemakaian.
B. Sumber radiasi Deuterium. Lampu ini dipakai pada panjang gelombang 190-380
nm. Spektrum energi radiasinya lurus, dan digunakan untuk mengukur sampel yang
terletak pada daerah uv. Memiliki waktu 500 jam pemakaian.
3

Sonata Daniatiek
04112681620045

Laporan Praktikum
Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

C. Sumber radiasi merkuri. Sumber radiasi ini memiliki panjang gelombang 365 nm.
2. Monokromator
Monokromator

adalah

alat

yang

akan

memecah

cahaya

polikromatis

menjadi cahaya tunggal (monokromatis) dengan komponen panjang gelombang

tertentu. Bagian-bagian monokromator, yaitu :
A. Prisma
Prisma akan mendispersikan radiasi elektromagnetik sebesar mungkin supaya di
dapatkan resolusi yang baik dari radiasi polikromatis.
B. Grating (kisi difraksi)
Kisi difraksi memberi keuntungan lebih bagi proses spektroskopi. Dispersi sinar akan
disebarkan merata, dengan pendispersi yang sama, hasil dispersi akan lebih baik.
Selain itu kisi difraksi dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spektrum.
C. Celah optis
Celah ini digunakan untuk mengarahkan sinar monokromatis yang diharapkan dari
sumber radiasi. Apabila celah berada pada posisi yang tepat, maka radiasi akan
dirotasikan melalui prisma, sehingga diperoleh panjang gelombang yang diharapkan.
D. Filter
Berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga cahaya yang diteruskan
merupakan cahaya berwarna yang sesuai dengan panjang gelombang yang dipilih.
3. Sel kuvet
Kebanyakan spektrofotometri melibatkan larutan dan karenanya kebanyakan
kuvet adalah sel untuk menaruh cairan ke dalam berkas cahaya spektrofotometer. Sel
itu haruslah meneruskan energi cahaya dalam daerah spektra yang diminati, jadi sel
kaca melayani daerah tampak, sel kuarsa atau kaca silica tinggi istimewa untuk daerah
ultraviolet. Dalam instrument, tabung reaksi silindris kadang-kadang digunakan
4

Sonata Daniatiek
04112681620045

Laporan Praktikum
Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

sebagai wadah sampel. Penting bahwa tabung-tabung semacam itu diletakkan secara
reprodusibel dengan membubuhkan tanda pada salah satu sisi tabung dan tanda itu
selalu tetap arahnya tiap kali ditaruh dalam instrument. Sel-sel lebih baik bila
permukaan optisnya datar. Sel-sel harus diisi sedemikian rupa sehingga berkas cahaya
menembus larutan. Umumnya sel-sel ditahan pada posisinya dengan desain kinematik
dari pemegangnya atau dengan jepitan berpegas yang memastikan bahwa posisi
tabung dalam ruang sel dari instrument itu reprodusibel.
4. Detektor
Detektor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan. Sinar kemudian
diubah menjadi sinyal listrik oleh amplifier dan dalam rekorder dan ditampilkan
dalam bentuk angka-angka pada reader (komputer). Detektor dapat memberikan
respon terhadap radiasi pada berbagai panjang gelombang Ada beberapa cara untuk
mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai
untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet. Banyak senyawa-senyawa
organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan
sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang
berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang
diserap. Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu
yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang
digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya, tetapi senyawasenyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari
specktrum UV. Misalnya metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205
nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran
metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang
lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.
5. Rekorder
Fungsi rekorder mengubah panjang gelombang hasil deteksi dari detektor yang
diperkuat oleh amplifier menjadi radiasi yang ditangkap detektor kemudian diubah
menjadi sinyal-sinyal listrik dalam bentuk spektrum. Spektrum tersebut selanjutnya
dibawa ke monitor sehingga dapat dibaca dalam bentuk transmitan maupun
absorbansi.
5

Sonata Daniatiek
04112681620045

Laporan Praktikum
Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

Mekanisme kerja alat spektrofotometer UV-Vis adalah sinar dari sumber sinar
dilewatkan melalui celah masuk, kemudian sinar dikumpulkankan agar sampai ke
prisma untuk didifraksikan menjadi sinar-sinar dengan panjang gelombang tertentu.
Selanjutnya sinar dilewatkan ke monokromator untuk menyeleksi panjang gelombang
yang diinginkan. Sinar monokromatis melewati sampel dan akan ada sinar yang
diserap dan diteruskan. Sinar yang diteruskan akan dideteksi oleh detektor. Radiasi
yang diterima oleh detektor diubah menjadi sinar listrik yang kemudian terbaca dalam
bentuk transmitansi.

BAB II
METODE
2.1 Pelaksanaan
Praktikum Isolasi DNA ini dilakukan pada :
Hari/Tanggal: Rabu/ 21 Oktober 2016
Tempat

: Laboratorium Biomolekular Fakultas Kedokteran

Jam

: 15.00 s/d selesai

6

Sonata Daniatiek
04112681620045

Laporan Praktikum
Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

2.2

Alat dan Bahan

2.2.1 Alat
Alat yang diperlukan untuk praktikum spektrofotometer adalah :

Spektrofotometer UV-vis 1 set

Gelas kimia 100 ml1 buah

Kuvet spektrofotpmeter

4 buah

Spatula

1 buah

Batang pengaduk

1 buah

Pipet tetes

4 buah

Gelas ukur

1 buah

Corong

1 buah

Tissue

Sonata Daniatiek
04112681620045

Laporan Praktikum
Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

Alat Spektrofotometer UV - Vis

2.2.2 Bahan
Bahan yang diperlukan :
a. Standar dengan konsentrasi 2%, 5%, 8% dan x %
b. Larutan standar
c. Aquadest
2.3 Cara Kerja

1. Masing-masing larutan standar dimasukkan dalam kuvet sebanyak 10 ml.

2. Masukkan larutan sample 2%, 5%, 8% dan x % masing-masing ke dalam
kuvet

Sonata Daniatiek
04112681620045

Laporan Praktikum
Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

Stand
ar

2%

5%

8%

X%

3. 100% kan transmitan dengan menggunakan blanko, bentuk spektrum lurus.

4. Tentukan absorbansi masing-masing larutan standar serta absorbansi sampel
pada panjang gelombang 450 nm, 500 nm dan 550 nm
5. Tentukan panjang gelombang maximum masing-masing larutan sample dengan
mengamati absorbansi pada panjang gelombang 450 nm, 500 nm dan 550 nm
6. Dari panjang gelombang maximum yang didapatkan, tentukan absorbansi
masing-masing larutan standar dan sampel pada panjang gelombang tersebut.
7. Hitung konsentrasi sample x % dengan kurva standar dan absorbansi yang telah
di ketahui dengan pengukuran sample pada panjang gelombang yang telah
ditentukan.

BAB III
HASIL DAN DISKUSI
3. 1 Hasil
Dari Praktikum yang telah dilakukan didapatkan hasil sebagai berikut :
9

Sonata Daniatiek
04112681620045

Laporan Praktikum
Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

A. Penentuan Panjang gelombang maksimum

Panjang Gelombang Maks

= 500 nm

Absorban Sample pada 500

nm = 0, 201

10

Sonata Daniatiek
04112681620045

Laporan Praktikum
Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

B. Kurva standar konsentrasi 2%, 5% dan 8%

C.
Y = 1,9 X + 0,08
R = 0, 75

Perhitungan Sample yang tidak diketahui kadarnya :

Y

= 1,9 X + 0,08

0,201

= 1,9 X + 0,08

= 0,063

=6%

3.2 Diskusi

Praktikum kali ini tentang penentuan konsentrasi dalam sampel dengan

menggunakan metode spektrofotometri UV-vis dan menentukan panjang gelombang
maksimum. Pada awal percobaan, terlebih dahulu dibuat larutan standar sebagai
blanko. Blanko yang digunakan pada percobaan ini adalah sirup marjan. Untuk
menentukan konsentrasi sample, praktikan harus menentukan panjang gelombang
maximum terlebih dahulu, dengan mengamati nilai absorbansi yang didapatkan pada
panjang gelombang tertentu. Pengukuran sample dilakukan pada panjang gelombang
450 nm, 500 nm dan 550 nm. Pada panjang gelombang maximum, nilai absorbansi
merupakan yang paling besar, yang berarti kapasitas sinar radiasi yang diserap paling
banyak pada panjang gelombang tersebut. Namun sebelum itu, nilai transmitan
di100%kan terlebih dahulu dengan menggunakan blanko aquades. Spektrum dari
blanko tersebut berbentuk garis lurus horizontal, yang menandakan blanko tersebut
tidak mengandung sampel, namun nyatanya spektrum dari blanko tidak berbentuk
garis lurus horizontal, ini disebabkan karena blanko telah terkontaminasi oleh zat lain
karena praktikum kami ini menggunakan sample praktikum sesi pertama, sehingga
11

Sonata Daniatiek
04112681620045

Laporan Praktikum
Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

kami tidak mendapatkan kurva dengan garis lurus dimana seharusnya kurva yang
bagus itu dengan R = 0,999 sedangkan kami mendapatkan dengan R = 0, 75
Masing-masing larutan standar diukur absorbansinya pada panjang gelombang
tertentu, untuk menentukan panjang gelombang maximum dari masing-masing larutan
standar tersebut. Larutan standar menunjukkan penjang gelombang maximum 500 nm
dengan absorbansi 0,251. Pada masing-masing panjang gelombang maximum ini
ditentukan absorbansi larutan standar dan absorbansi larutan sampel. Dimana pada
panjang gelombang maximum 500 nm, absorbansi larutan sampel 0,201. Nilai
absobansi pada masing-masing panjang gelombang maximum ini digunakan untuk
menentukan konsentrasi sample melalui perhitungan. Pada hasil percobaan ini,
konsentrasi sampel yang didapatkan adalah 6% pada panjang gelombang 500 nm.
percobaan ini kurang akurat, yang disebabkan karena terjadinya kesalahan pada
percobaan. Kesalahan yang mungkin terjadi pada percobaan ini yaitu kekurangtelitian
dalam pembuatan larutan serta pengenceran yang kurang sempurna, terjadinya
serapan radiasi oleh sidik jari pada kuvet, sensitivitas alat, kuvet yang kurang bersih,
adanya serapan oleh pelarut, kuvet tergores, adanya gelembung udara atau gas dalam
lintasan radiasi panjang gelombang, ataupun kekurangtelitian praktikan dalam
pengamatan karena terlihat dari kurva standar yang dihasilkan dengan R = 0,75
(Seharusnya R = 0,999).

12

Sonata Daniatiek
04112681620045

Laporan Praktikum
Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Dari Praktikum Spektrofotometer ini dapat disimpulkan bahwa :
1. Spektrofotometri

UV-vis

adalah

teknik

analisis

spektroskopi

yang

menggunakan sumber radiasi elektromegnetik ultraviolet dan sinar tampak

dengan menggunakan instrumen spektrofotometer.
2. Prinsip kerja spektrofotometer UV-vis adalah interaksi yang terjadi antara
energi yang berupa sinar monokromatis dari sumber sinar dengan materi yang
berupa molekul
3. Pada percobaan, didapatkan panjang gelombang maksimum sebesar 500 nm
dengan absorban 0,251 dimana absorban bekisar 0,2 - 0,8
4. Konsentrasi sampel yang didapatkan pada adalah 6 %

5.2 Saran
Pada praktikum ini disarankan agar praktikan selanjutnya berhati-hati dalam
memipet agar meminimalisir kesalahan karena absorban yang terukur akan
mempengaruhi kadar yang akan di hitung dan akan mempengaruhi kurva standar yang
didapatkan.

13

Sonata Daniatiek
04112681620045

Laporan Praktikum
Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

DAFTAR PUSTAKA

Fatimah, S, Yanlinastuti dan Yoskasih. 2005. Kualifikasi Alat Spektrometer UVvis Untuk Penentuan Uranium dan Besi dalam-U30. Hasil Penelitian
Harjadi. 1990. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: PT. Gramedia.
Khopkar, S. M. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Universitas Indonesia.
Saputra, Y.E. 2009. Spektrofotometri. http://www.chem-is-try.org. diakses tanggal 13
Desember 2009.
Basset, J. 1994. Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Jakarta: EGC.
Underwood, A. L. 1990. Analisis Kimia Kiantitatif Edisi ke Enam. Jakarta:
Erlangga.

14

Sonata Daniatiek
04112681620045

Laporan Praktikum
Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

TUGAS PRAKTIKUM SPEKTROFOTOMETER

1. Jelaskan prinsip dan cara kerja spektrofotometer?
2. Apa tujuan pemanasan spektrofotometer sebelum digunakan?
Jawaban :
1. A.

Prinsip kerja spektrofotometer adalah bila cahaya (monokromatik maupun

campuran) jatuh pada suatu medium homogen, sebagian dari sinar masuk akan
dipantulkan, sebagian diserap dalam medium itu, dan sisanya diteruskan. Nilai yang
keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam nilai absorbansi karena memiliki
hubungan dengan konsentrasi sampel.
Spektrofotometri uv-vis mengacu pada hukum Lambert-Beer. Apabila cahaya
monokromatik melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut akan
diserap, sebagian dipantulkan dan sebagian lagi akan dipancarkan.
B. Cara kerja Spektrofotometer UV/VIS :

Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang bersifat
polikromatis

di

teruskan

melalui

lensa

menuju

ke

monokromator

pada

spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer. Monokromator kemudian akan

mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya monokromatis (tunggal). Berkasberkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian akan dilewatkan pada sampel yang
mengandung suatu zat dalam konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, terdapat cahaya
yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan ini
kemudian di terima oleh detector. Detector kemudian akan menghitung cahaya yang
diterima dan mengetahui cahaya yang diserap oleh sampel. Cahaya yang diserap
sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung dalam sampel sehingga akan
diketahui konsentrasi zat dalam sampel secara kuantitatif.
Atau dengan cara :
15

Sonata Daniatiek
04112681620045

Laporan Praktikum
Teknik Dasar Laboratorium Biomedik

Tempatkan larutan pembanding, misalnya blangko dalam sel pertama

sedangkan larutan yang akan dianalisis pada sel kedua. Kemudian pilih foto sel yang
cocok 200nm-650nm (650nm-1100nm) agar daerah yang diperlukan dapat terliputi.
Dengan ruang foto sel dalam keadaan tertutup nol galvanometer didapat dengan
menggunakan tombol dark-current. Pilih h yang diinginkan, buka fotosel dan
lewatkan berkas cahaya pada blangko dan nol galvanometer didapat dengan
memutar tombol sensitivitas. Dengan menggunakan tombol transmitansi, kemudian
atur besarnya pada 100%. Lewatkan berkas cahaya pada larutan sampel yang akan
dianalisis. Skala absorbansi menunjukkan absorbansi larutan sampel.
Yang harus dihindari adanya cahaya yang masuk ke dalam alat, biasanya pada
saat menutup tenpat kuvet, karena bila ada cahaya lain otomatis jumlah cahaya yang
diukur menjadi bertambah.

1. Sumber cahaya polikromatis masuk ke dalam monokromator (disini terjadi

penyebaran cahaya)
2. Dari monokromator kemudian keluar menuju ke sel sampel, pada sel sampel ini
terjadi proses penyerapan cahaya oleh zat yang ada dalam sel sampel (dimana cahaya
yang masuk lebih terang dibandingkan cahaya setelah keluar)
3. Selanjutnya cahaya ditangkap oleh detektor dan mengubahnya menjadi arus listrik
2. Tujuan pemanasan alat spektrofotometer sebelum digunakan adalah agar intensitas
cahaya stabil dan maksimal, pada prinsipnya mekanisme kerja alat spektrofotometer
adalah pengukuran serapan cahaya yang berinteraksi antara larutan sample dan cahaya
sehingga pemanasan spektro sebelum digunakan bertujuan untuk menyempurnakan
pendispersian cahaya oleh sumber cahaya polikromatis, dalam hal ini adalah lampu
deutrium yang merupakan sumber cahaya UV - Vis dalam spektrofotometer.
16

Sonata Daniatiek
04112681620045