Pengenalan 

alat instrumen spektrofotometri uv-vis, spektrofotometri 
visible, HPLC dan KLT Densitometri

I. Tujuan
Untuk memaham prinsip kerja alat spektrofotometer UV-Visible, Spektrofotometri
Visible,HPLC dan KLT DENSITOMETRI
II. Dasar Teori

Spektrofotometri UV-Visile merupakan metode analisa yang didasarkan pada pengukuran

penyerapan sinar monokromatik oleh senyawa tak berwarna di jalur spectrum ultraviolet

(200-380 nm). Metode ini menggunakan sumber radiasi elektromagnetik dan sinar tampak

dengan menggunakan instrument yang di dasarkan pada hukum Bounger-Lambert-Beer, yang

menetapkan bahwa absorbansi larutan berbanding lurus dengan konsentrasi analit. Adapun

prinsip dasar kerja dari spektrofotometer yang meliputi daerah UV yang terdiri dari cahaya

interval panjang gelombang yang melewati dengan pelarut dan jatuh ke fotolistrik yang

mengubah energy radiasi menjadi energy listrik (Gandimathi, 2012).

Spektrofotometer Uv –Vis Merupakan Gabungan antara Spektrofotometer UV dan Visible,

instrument ini menggunakan dua buah sumber cahaya yang berbeda, yaitu sumber cahaya UV

dan sumber cahaya Visible. Adapun bagian – bagian dari instrument Spektrofotometer Uv –

Vis diantaranya adalah:

Sumber Radiasi

Sumber sinar atau sumber radiasi dari spektrofotometer Uv-Vis ini berasal dari

beberapa jenis lampu, seperti : lampu hidrogen, lampu deuterium (panjang gelombang 180-

350 nm), lampu xenon, dan lampu pijar tungsten (panjang gelombang 350-2500 nm)

Monokromator

Monokromator pada spektrofotometer Uv-Vis ini berfungsi untuk memecah sumber

radiasi yang memiliki pita energi lebar (polikromatis) menjadi radiasi dengan pita energi
yang lebih sempit (monokromatis). Monokromator mampu menghasilkan radiasi dengan

lebar pita efektif sebesar 35 – 0,1 nm.

Wadah Sampel (Cuvet)

Wadah sampel atau cuvet terbuat dari kuarsa atau silika untuk penggunaan radiasi Uv

dan terbuat dari gelas biasa atau kuarsa untuk radiasi sinar tampak. Cuvet memiliki ketebalan

yang bervariasi yaitu dari 1-10 cm. Posisi penempatan cuvet pada instrumen spektrofotometer

Uv-Vis adalah permukaan cuvet tegak lurus dengan datangnya radiasi sehingga kehilangan

radiasi akibat pantulan/refraksi dapat dikurangi.

Detektor

Detektor pada spektrofotometer Uv-Vis berfungsi untuk menangkap cahaya yang

diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat detektor

spektrofotometer Uv-Vis adalah memiliki sensitivitas tinggi sehingga daya radiasi yang kecil

dapat terdeteksi, memiliki waktu respon yang singkat, dan juga stabil

Prinsip kerja dari spektroskopi UV-Vis adalah Ketika ada sumber sinar berupa cahaya uv-vis

(monokromatik) diteruskan melalui suatu media (larutan bewarna) yang merupakan suatu

sampel, maka Sebagian cahaya tersebut ada yang diserap, dipantulkan dan ada

yangaaaamwmmmmmmmmwm diteruskan. Cahaya yang diserap tersebut akan menyebabkan

elektron terekstasi dari keadaan dasar ke keadaan yang memiliki energi yang lebih lw.

Wnwwmolmma. Tyyyyyyy

yyyyy
Spektrofotometri visible disebut juga spektrofotometri sinar tampak. Yang dimaksud sinar

tampak adalah sinar yang dapat dilihat oleh mata manusia. Cahaya yang dapat dilihat oleh

mata manusia adalah cahaya dengan panjang gelombang 400-800 nm dan memiliki energi

sebesar 299–149 kJ/mol.

Elektron pada keadaan normal atau berada pada kulit atom dengan energi terendah disebut

keadaan dasar (ground-state). Energi yang dimiliki sinar tampak mampu membuat elektron

tereksitasi dari keadaan dasar menuju kulit atom yang memiliki energi lebih tinggi atau

menuju keadaan tereksitasi.

Cahaya atau sinar tampak adalah radiasi elektromagnetik yang terdiri dari gelombang. Seperti

semua gelombang, kecepatan cahaya, panjang gelombang dan frekuensi dapat didefinisikan

sebagai:

C= V.λ

Dimana :

C = Kecepatan cahaya

V = Frekuensi dalam gelombang per detik (Hertz) λ = Panjang gelombang dalam meter
Bagian bangian dari instrumental Spektrofotometri Visible

Monokromator.

Sampel.

Detektor.

Sinyal processor.

Kromatografi merupakan sebuah teknik atau metode pemisahan molekul yang didasarkan

pada perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam.

HPLC adalah kepanjangan High-performance liquid chromatography atau kadang disebut

High-pressure liquid chromatography (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi/KCKT) adalah

sebuah teknik analisis untuk identifikasi zat/senyawa dan memisahkan serta mengukur

jumlahnya dalam suatu larutan campuran. Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen

analit berdasarkan kepolarannya, setiap campuran yang keluar akan terdeteksi dengan

detektor dan direkam dalam bentuk kromatogram. Dimana jumlah peak menyatakan jumlah

komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran

KLT-densitometri merupakan metode analisis instrumental yang didasarkan pada interaksi

radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak pada kromatografi lapis tipis

(Rohman, 2009). Dibandingkan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), kuantitasi

dengan KLT-densitometri mempunyai beberapa keuntungan, di antaranya KLT-densitometri

memberikan fleksibilitas yang lebih besar dalam memilih fase gerak, proses kromatografi

dapat diikuti dengan mudah dan dapat dihentikan kapan saja, semua komponen dalam sampel

dapat dideteksi (Rohman, 2009). Prinsip kerja dari densitometri itu sendiri mengetahui luas

area dan kromatogram pada plat KLT. KLT yang sudah berisi bercak noda sampel

dimasukkan kedalam alat TLC Scanner untuk dilihat peak kromatogram dan luar area (AUC)

kromatogram yang terdapat dalam plat KLT tersebut. Plat KLT yang sudah mengandung

kafein didalam suplemen pembakar lemak selanjutnya dihitung kadarnya menggunakan

densitometri. Plat KLT tersebut dimasukkan kedalam densitometer dan dideteksi

menggunakan sinar UV 254 nm.

III ALAT DAN BAHAN

1. Alat-alat Praktikum

a. Kuvet

b. Pipet tetes

c. Spektrofotometer UV-Vis

2. Bahan-bahan Praktikum

a. Aquadest (H2O)(l)

b. Methanol

IV. PROSEDUR PERCOBAAN

1. Kalibrasi Alat Spektrofotometer UV-Vis

Alat Spektrofotometer

- Dinyalakan selama 15 menit.

Hasil

Larutan Blangko

- Dimasukkan ke dalam kuvet.

Hasil

Alat Spektrofotometer

- Dipilih menu aplikasi wavelength scan.

- Dilakukan kalibrasi dengan larutan blangko dengan autozero.

- Disetting nilai absorbansi = 0

- Disetting nilai transmitansi = 100%

REFERENSI

https://kimia.fmipa.unej.ac.id/?p=472

Day, R. A dan A. L. Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta : Erlangga.

Huda, N. 2001. Pemeriksaan Kinerja Spektrofotometer UV-Vis GBC 911A Menggunakan

Pewarna Tartazine CL-19140. Batan : Sigma Epsilon.

Gandhimathi, R. dkk. 2012. Analytical Process of Drugs by Ultraviolet (UV) Spectroscopy –

A Review. India : Deparment of Pharmaceutical Analysis, Sree Vidyanikethan College of

Pharmacy.

Gandjar, I. G dan Rohman, A. 2012. Analisis Obat secara Spektroskopi dan Kromatografi.

Yogyakarta : Pustaka Pelajar.

Petruci, R. 1987. Kimia Dasar Edisi 4 Jilid 2. Jakarta : Erlangga.