Purifikasi Protein

 Purifikasi protein adalah serangkaian proses yang dimaksudkan untuk mengisolasi

satu jenis protein dari campuran kompleks
 Pemurnian protein sangat penting untuk karakteristik struktur,fungsi dan
interaksi dari suatu protein
 Proses pemurnian dari kultur sel merupakan tahapan yang sangat penting dalam
produksi protein rekombinan.
 Prosedur pemurnian protein dapat dilakukan karena adanya variasi:
1. Kelarutan
2. Ukuran
3. Muatan
4. Binding specificity
5. Sifat Hidrofobik/hidrofilik
Tahapan yang Harus dilakukan pada proses
Pufirikasi produk hasil rekayasa genetika adalah:

1. Memekatkan larutan kultur sel agar lebih pekat,sehingga dengan volume

yang lebih kecil proses purifikasi dapat dilakukan dengan baik.
2. Menghilangkan sebagian besar kontaminan utama termasuk DNA yang
berasal dari kultur sel.
3. Setelah proses purifikasi,senyawa yang diperoleh harus dikarakterisasi
sesuai dengan sifat-sifat fisikokimia senyawa,uji bioaktivitasi dan kemuadian
dilanjutkan dengan proses formulasi dan sterilisasi untuk menghasilkan
produk yang stabil untuk digunkan sebagai obat.
Stategi Purifukasi

Muatan : Kromatografi penukar ion

Kepolaran : Kromatografi interaksi hidrofobik
Ukuran : Dialisis,ultrafiltrasi,gel elektroforesis,kromatografi
filktrasi gel,ultrasentrifugasi
Spesifikasi : Kromatografi Afinitas
Metode Purifikasi

 Beberapa metode purifikasi antara lain :

@. Filtrasi
@. Sentrifugasi
@. Prespitasi
@ Berbagai cara kromatografi yaitu :
1. Kromatografi adsorbs
2. Kromatografi penukar ion
3. Kromatografi afinitas
4. Kromatografi interaksi hidrofobik
5. kromatografi permiasi gel
Metode purifikasi yang digunakan untuk memurnikan produk hasil rekayasa genetic tergantung
pada jenis dan sifat fisikokimia senyawa yang diproduksi
Filtrasi

Salah satu cara yang efektif untuk memisahkan produk hasil rekayasa genetic
dengan senyawa kontaminan tersebut dengan cara filtrasi.
Filtrasi dapat juga digunakan untuk memekatkan biomassa sebelum dilakukan
purufikasi selanjutnya
Berbagai teknik filtrasi telah dikembangkan untuk memisahkan sel dari medium
perbenihan
Sistem ultrafiltrasi dikembangkan untuk memisahkan kontaminasi bakteri dan
virus yang terdapat didalam larutan
Sentrifugasi

 Partikel subseluler dan organel sel umumnya tersuspensi dalam larutan yang
kental sehingga seringkali sulit dipisahkan melalui penyaringan. Namun dapat
dipisahkan secara efisien dengan cara sentrifugasi pada kecepatan yang
berbeda-beda.
 Contoh : inti sel dapat dipisahkan pada kecepatan sentrifugasi 400 rpm
selama 20 menit,sedangkan untuk membrane plasma memerlukan kecepatan
sentrifugasi uang lebih tinggi dan waktu yang lama
Presipitasi

 Presipitasi adalah pengendapan yang terjadi karena penggumpalan ri yang

parsial
 Presipitasi merupakan cara yang ekonomis dan banyak digunakan untuk
mengisolasi protein dari dalam larutan supranatan kultur sel. Namum metode
preipitasi biasanya dilakukan pada produksi skala kecil dan kurang digunakan
untuk purifikasi protein rekombinan skala industri
Kromatografi

 Pemisahan molekul dari materi biologis seringkali melibatkan isolasi jenis

molekul tertentu dari campuran molekul lain yang memiliki sifat yang hamper
sama.
 Metode kromatografi merupakan metode purifikasi yang efektif untuk
memisahkan molekul-molekul tersebut
 Dalam system kromatografi,komponen sampel dipisahkan berdasarkan
perbedaan distribusi molekul diantara dua fase diam dan fase bergerak.Fase
diam biasanya terdiri dari zat padat,sedangkan fase gerak terdiri dari cairan
atau gas
Kromatografi Adsorbsi
Dalam system kromatografi adsorbs atau disebut juga kromatografi fase
normal,digunakan fase diam yang lebih polar dibandingkan dengan fase
gerak.Protein yang akan dipisahkan secara selektif terikat pada kondisi berbeda.
Kromatografi Penukar ion
Merupakan kromatografi yang sangat potensial untuk digunakan dalam proses
purifikasi dan mudah digunakan dalam peningkatan skala produksi
Kromatografi penukar ion dapat digunakan dalam suatu kondisi tertentu,dimana
kontaminan produk yang dapat dialirkan melalui kolom, dan dapat terikat dan
diabsorbsi oleh matrik,sedangakn protein yang dikehendaki dapat terikat
Jenis kolom yang digunakan tergantung pada sifat protein yang dipurifikasi antara
lain titik isolektrik protein
Kromatografi afinitas
Prinsip kromatografi afinitas adalah pengikatan molekul yang diteliti secara
kovalen pada matriks immobile seperti kolom agarose
Pada prinsip metode kromatografi afinitas dapat digunakan untuk memurnikan
hamper semua makromolekul termasuk enzim,antibody,asam – asam
nukleat,protein-protein pengikat vitamin,immunoglobulin reseptor-reseptor
membrane ,sel utu dan fragmen sel.
Kromatografi Interaksi Hidrofobik
 Porein mempunyai daerah fidrofobik dipermukaan yang dapat berinteraksi
dengan resin
 Resin mengandung gugus fenil atau alifatik mengikat protein:protein yang
paling hidrofobik akan terikat paling kuat.
 Elusi dilakukan dengan pelarut yang kurang polar atau dengan menurunkan
(garam)
 Kromatografi Permeasi Gel
 Kromatografi sel sangat berguna untuk pemisahan spesies dengan berat
molekul tinggi (BM>2000)terutama yang tak terionkan
 Selain dari resolusi dari setiap makromolekuler seperti protein dan asam
nukleat,kromatografi gel dapat digunakan untuk mendapatkan distribusi berat
molekul dari polimer sintesis.
 Prinsip dari teknik filtrasi gel adalah pemisahan molekul berdasarkn
perbedaan ukurannya sehingga teknik ini bekerja sebagai suatu penyaring
molekul.