BIOTEKNOLOGI INDUSTRI PANGAN – TPEP 74

4. Pemisahan dan Pemurnian Produk Fermentasi

4. Fermentation Product Recovery & Purification

FOOD TECHNOLOGY
FACULTY OF ENGINEERING
PASUNDAN UNIVERSITY
PRINCIPLES OF MICROBIOLOGY and FERMENTATION
TECHNOLOGY in BIOTECHNOLOGY
1. Introduction
2. Micro-organisms importance in biotechnology processes.
3. Strain improvement; mutation, recombination, protoplast fusion.
4. Microbial growth kinetics; principles of batch, fed-batch and
continuous fermentation processes; sterilisation of culture media;
stirring, mixing and aeration of fermentation cultures.
5. Principles of Laboratory scale production of an enzyme with
applications in the food industry.
6. Scale-up of fermentation processes.
7. Fermentation product recovery and purification
8. MIDTERM EXAM
Learning outcomes / Kemampuan yang dituju

1. Mahasiswa mengetahui dan mengenal metode pemisahan dan

pemurnian protein / enzim hasil fermentor industri
Pendahuluan
Tantangan pemisahan & pemurnian produk fermentasi:
• Pemisahan dan Pemurnian hasil fermentasi bisa sangat kompleks dan mahal – 15 hingga 70%
biaya produksi
• Komposisi kaldu fermentasi yang kompleks: mikroorganisme, fragmen sel, komponen
medium terlarut dan tidak terlarut, produk metabolit lain non-target.
• Tantangan Karakter dan sifat Produk terkadang: intracellular, tidak tahan panas, mudah rusak
oleh kontaminasi
• Faktor penentu utama adalah kecepatan operasi dikarenakan kondisi produk yang tidak
stabil
• Peralatan harus menggunakan jenis dan ukuran yang tepat, sehingga jus fermentasi yang
dipanen dapat diproses dengan cepat.
• Setiap tahap dalam downstream processing akan membuat kehilangan produk, - tidak akan
100% efisien, dapat terjadi degradasi produk.
• Tahapan pelaksanaan yang tidak panjang. Karena bahkan ketika efisiensi nya cukup tinggi –
90%, dalam 4 tahap akan terjadi kehilangan produk sebanyak 40%
Definisi:
Product Recovery / Pemisahan produk
Pemisahan produk fermentasi – misalnya protein, dari
molekul non-protein lain
Product Purification / Pemurnian produk
Pemisahan produk fermentasi – misalnya protein yang kita
inginkan dari protein jenis lain
Pemisahan dan Pemurnian hasil
fermentasi
• Proses ini melibatkan
a. proses pemisahan hasil fermentasi dengan mediumnya,
b. proses pemurnian dimana hasil pemisahan yang pertama
dipisahkan lebih lanjut dari hasil / produk yang sejenis sehingga
didapatkan produk yang murni.
• Contoh protein: enzim Selulase dibuat dalam fermentor yang bercampur
dengan medium dan sel bakteri, kemudian dipisahkan dari medium dan
dimurnikan dari jenis protein/ enzim lainnya.
• Contoh non-protein: asam sitrat dibuat dalam fermentor produksi yang
bercampur dengan medium, kemudian dipisahkan dari medium,
kemudian dimurnikan dari asam-asam organik lainnya.
Tahapan umum pemisahan dan
pemurnian produk fermentasi
1. Pemisahan fisik partikel solid ukuran besar dan juga sel-sel mikroba à
sentrifugasi & filtrasi
2. Produk intraselular membutuhkan tahap disrupsi sel mikroba, tapi
Produk ekstraselular langsung diisolasi dari kaldu fermentasi,
3. Isolasi produk. Kaldu fermentasi difraksionasi dan ekstraksi melalui
ultrafiltrasi, reverse osmosis, adsorption/ion-exchange/gel filtration
atau affinity chromatography, liquid–liquid extraction, two phase
aqueous extraction, supercritical fluid extraction, or precipitation.
4. Hasil fraksionasi yang masih mengandung beberapa produk sejenis
akan dimurnikan melalui Presipitasi fraksional, yang dilanjutkan oleh
kromatografi dan kristalisasi untuk mendapatkan produk target yang
terkonsentrasi dan bebas pengotor
5. Pengeringan produk
Kriteria Pemilihan proses pemisahan
1. Lokasi produk fermentasi (intraselular atau extraselular)
2. Konsentrasi produk dalam kaldu fermentasi
3. Sifat dan karakter fisika-kimia dari produk target
4. Tujuan Penggunaan produk
5. Standar kemurnian minimal yang dapat diterima
6. Ukuran bahaya biologis produk maupun jus fermentasi
7. Pengotor dalam kaldu fermentasi
8. Harga produk target di pasar
Tahapan pemisahan dan pemurnian
produk fermentasi
terdiri dari empat tahapan utama yaitu penghilangan kotoran,
ekstraksi, konsentrasi dan purifikasi. Secara sistematis,
tahapan tersebut dapat dilihat pada gambar berikut:

Disrupsi sel
fraksi
terlarut
Penghilangan produk
Kultur kotoran yang cair
tidak dapat Ekstraksi Konsentrasi
Fermentasi terlarut fraksi
terlarut
produk
berbentuk
konsentrat

Purifikasi
Pengotor
Sel dan
pengotor
lain Produk Murni
Metode pemisahan / pemurnian produk
fermentasi
Terdapat berbagai metode pemisahan & pemurnian produk
fermentasi:
1. Secara Gravitasional. Terdiri dari dua metode yaitu
sentrifugasi dan flokulasi.
2. Secara Mekanis. Metode secara mekanis, seperti filtrasi,
presipitasi dan dialisis.
3. Penggunaan sifat permukaan. Metode ini terdiri dari
adsorpsi, ion-exchange, dan flotasi.
4. Secara Elektrik. Metode secara elektrik ini menggunakan
elektrofresis, elektrodialisis dan elektro-osmosis.
Gravitasional - Sentrifugasi
• Sentrifugasi meliputi pemisahan cairan dan partikel berdasar densitas.
• Sentrifugasi dapat digunakan untuk pemisahan sel dari cairan kultur, sel
pecah dari cairan, dan kelompok endapan
Ada sejumlah tipe Centrifuge, beberapa diantaranya:
• Tubular Bowl Centrifuge
• Paling umum digunakan untuk pemisahan padat-cair, isolasi enzim.
• Dapat dicapai pemisahan yang baik untuk sel mikrobia dalam larutan.
• Disc Bowl Centrifuge
• Secara luas digunakan untuk memisahkan sel.
• Dapat untuk memisahkan sel mikrobia yang dipecah dan endapan protein
• Perforate Bowl Basket Centrifuge
• Pengecualian pada pemisahan adsorpbent, seperti selulosa dan agarosa.
• Zonal Ultracentrifuge
• Digunakan dalam industri vaksin karena dapat secara mudah memisahkan sel yang dipecah dari
virus.
• Dapat untukmengendapkan protein dengan baik.
• Secara eksperimental digunakan untuk pemurnian RNA polymerase dan berbagai enzim.
Tubular Bowl Centrifuge
Disc Bowl Centrifuge
Perforate Bowl Basket Centrifuge
Zonal Ultracentrifuge

3 jenis protein memisahkan diri

berdasarkan ukuran dan bentuk
Tampilan potongan berbagai tipe
centrifuge:
(a) decanter type centrifuge,
(b) disc stacked centrifuge,
(c) imperforated basket centrifuge,
(d) perforated basket centrifuge and
(e) hydrocyclone
Metode Gravitasional – Koagulasi &
Flokulasi
• Koagulasi ditetapkan untuk proses-proses biologikal jika partikel
kecil secara langsung melekat satu dengan lainnya.
• Flokulan adalah agensia yang bekerja untuk menggabungkan
partikel
• Teknik koagulasi dan flokulasi biasanya digunakan untuk sel utuh,
sel pecah atau protein terlarut.
• Sel Utuh
• Banyak flokulan digunakan untuk pemisahan produk, seperti : polielektrolit
anionik dan kationik, alumina, dan polimer sintetik.
• Sedikit informasi yang dikethui tentang koagula, tetapi beberapa koagulan
anorganik aluminium, garam besi dan garam kalsium telah banyak dipelajari
• Sel hancur dan protein
• Koagulasi dan flokulasi banyak digunakan dengan dilakukan agitasi
• Koagulasi dan flokulasi dapat digunakan sebagai alternatif metode presipitasi
pada pemisahan enzim
• Agensia yang digunakan untuk sel utuh adalah sama dengan untuk sel hancur
maupun protein
 Metode Mekanis - Filtrasi
• Filter menggunakan kain saring atau beberapa bahan porus dengan menggunakan
tekanan untuk mendorong partikel melewati filter
• Elemen-elemen dipisahkan berdasarkan ukuran.
• Filtrasi untuk meterial biologi umumnya menggunakan batch filtration, rotary drum
filtration, atau ultrafiltration methods.
• Batch Filtration
• Biasanya dengan tekanan konstan dari pompa mendorong cairan melewati filter
• Filter cake akan terbentuk sebagai akibat proses filtrasi dan menahan laju filtrasi
• Filter press adalah yang umum digunakan dalam industri
• Dapat digunakan untuk memisahkan sel tetapi tidakdapat bekerja dengan baik untuk sel hewan
dan tumbuhan
• Rotary Drum Filtration
• Larutan di vacuum dan ditarik ke atas hingga melewati filter septum, oleh positive displacement
pump
• Cake hasil filtrasi dipisahkan setiap sehabis satu rotasi supaya permukaannya tetap bersih selama
filtrasi
• Rotary vacuum filters dapat efektif digunakan untuk memisahkan mycelia, sel-sel, protein, enzim,
melalui bantuan filter dan precoat of the septum
• Ultrafiltration
• Menggunakan membrane untuk memisahkan partikel yang jauh lebih besar daripada pelarut
• Pemisahan akan efektif pada ukuran partikel 10 μm dan diameter molekul pelarut 0.5 μm
Batch Filtration (plate & frame)

UltraFiltration Rotary Drum Filtration

Metode Mekanis - presipitasi
• Presipitasi adalah prosedur penambahan larutan ionik untuk membuat
larutan fermentasi menjadi bentuk partikel yang tidak larut.
• Presipitasi biasanya untuk memisahkan enzim atau protein
• Cara yang sederhana biasanya dengan mengubah pH dan suhu
• Presipitasi dapat dilakukan secara batch atau kontinyu.
• Variasi suhu dan pH
• Umumnya kebanyakan protein dan enzim meningkat kelarutannya dengan meningkatnya suhu
• Dengan mengatur pH, polaritas enzim dapat diturunkan sehingga tidak bermuatan, poliratas yang
paling rendah menjadikan enzim sedikit larut dan cairan.
• Presipitasi oleh Solven Organik
• Dengan penambahan solven organik ke cairan fermentasi, konstanta dielektrik akan turun
menyebabkan kelaturan berkurang.
• Sering digunakan secara industri karena murah dan sederhana
• Presipitasi oleh Ion Logam
• Garam metal dengan solubilitas lebih rendah dapat dibentuk oleh enzim dan protein.
• Garam Mangan dapat digunakan untuk pengendapan asam nukleat.
Contoh: Pemisahan dan Pemurnian Asam Sitrat
Pemisahan
Metode yang digunakan dalam pemurnian asam sitrat dari cairan fermentasi terdiri
dari dua teknik yaitu presipitasi dan filtrasi.
Cairan asam sitrat dari fermentor produksi sangat terkontaminasi oleh biomass,
garam, sukrosa, dan air.
1. Pertama, asam sitrat harus direaksikan dengan kalsium karbonat untuk
menatralisasi larutan dan membentuk presipitat tidak larut kalsium sitrat.
Kalsium sitrat mengandung asam sitrat 74%.
2. Reaksi Kimianya adalah: CaCO3 + Citric Acid → CO2+ Calcium Citrate
3. Kalsium sitrat kemudian dicuci, dipanaskan dan disaring untuk menghilangkan
kontaminan
4. Tergantung rancangan skema pemurnian, filter dapat ditempatkan sebelum
reaksi pertama dengan kalsium karbonat. Secara sederhana filter dapat
memisahkan sebagian besar kontaminan tergantunng ukurannya dilanjutkan
untuk kontaminan yang lebih kecil pada filter berikutnya
5. Kalsium sitrat kemudian ditambah asam sulfat. Suhu reaksi ini di bawah 60ºC.
6. Reaksi akan menghasilkan asam sitrat bebas dan presipitat baru kalsiumsulfat,
yang akan dibutuhkan nantinya.
7. Dalam filter ini,kalsium sulfat dicuci dari asam sitrat dan meninggalkan
biomass Kontaminan dapat dipisahkandengan filter yang lebih baik seperti
mikrofiltrasi dan ultrafiltrasi
Pemisahan dan Pemurnian Asam Sitrat
(Lanjutan)
Pemurnian
• Asam sitrat dapat dihasilkan dalam dua bentuk: - monohidrat dan anhidrat
• Bentuk-bentuk ini membutuhkan tambahan tahap pemurnian untuk
mencapai kemurnian yang diinginkan
1. Monohydrate
• Mengandung satu molekul air unt tiap asam sitrat
• Membutuhkan kristalisasi berulang sampai kandungan air sekitar
7.5-8.8%
2. Anhydrous
• Memisahkan semua air dari produk akhir
• Dibuat dengan dehidrasi produk asam sitrat monohidrat pada suhu
di atas 36.6ºC
Contoh: Pemisahan dan Pemurnian Enzim
Selulase
Pemisahan & Pemurnian
1. Panen kaldu fermentasi
2. Dinginkan ke 5 – 10 ºC
3. Filter Aspergillur niger dengan menggunakan rotary vacuum filter
4. Ekstrak enzim selulase dari filtrate cair dengan menggunakan Ammonium
Sulfate (NH4)2SO4 di dalam ekstraktor sentrifugal counter-current
(pisahkan fase liquidnya)
5. Ekstrak enzim selulase dari pelarut ammonium sulfat dan larutkan ke
buffer cair sodium fosfat pH 7, dalam ekstraktor sentrifugal counter-
current.
6. Lanjutkan pemurnian dengan kromatografi ion exchange (kolom Q-
sepharosa)
7. Lanjutkan pemurnian dengan gel filtration chromatography
8. Kristalisasi filtrate (enzim) dengan penambahan garam potasium asetat
9. Enzim Selulase bubuk dibuat dengan dehidrasi produk enzim selulase pada
suhu di atas 36.6ºC
Reference

• Chapter 10. 2017. The Recovery and Purification of

Fermentation Products. Principles of Fermentation
Technology. Elsevier. Page 619 - 685
• Suharto, Ign. 1995. Bioteknologi dalam Dunia
Industri. Andi offset, Yogyakarta.
The End.. (for now)
Persiapan UTS
1. Micro-organisms importance in biotechnology processes.
2. Strain improvement; mutation, recombination, protoplast fusion.
3. Microbial growth kinetics; principles of batch, fed-batch and
continuous fermentation processes;
4. Sterilisation of culture media;
5. Stirring, mixing and aeration of fermentation cultures.
6. Principles of Laboratory scale production of an enzyme with
applications in the food industry.
7. Scale-up of fermentation processes.
8. Fermentation Product recovery and purification