IMUNOHISTOKIMIA

Imunohistokimia merupakan suatu cara pemeriksaan untuk mengukur kadar antibodi

atau antigen dalam sediaan jaringan. Nama imunohistokimia diambil dari nama immune yang
menunjukkan bahwa prinsip dasar dalam proses ini adalah penggunaan antibodi dan histo
menunjukkan jaringan secara mikroskopis. Dengan kata lain, imunohistokimia adalah metode
untuk

mendeteksi keberadaan antigen spesifik di

dalam

sel

suatu

jaringan

dengan

menggunakan prinsip pengikatan antara antibodi (Ab) dan antigen (Ag) pada jaringan hidup.
Pemeriksaan ini membutuhkan jaringan dengan jumlah dan ketebalan yang bervariasi
tergantung dari tujuan pemeriksaan.
Terdapat dua metode dasar imunohistokimia, yaitu:
1. Metode langsung (direct method) merupakan metode pengecatan satu langkah karena
hanya melibatkan satu jenis antibodi, yaitu antibodi yang terlabel, contohnya
antiserum terkonjugasi fluorescein isothiocyanate (FITC) atau rodhamin.
Kelebihan : Sederhana, hasil cepat
Kekurangan : Tidak tampak morfologi latar, perlu antibodi terkonjugasi setiap antigen
yang berbeda. Jarang digunakan di banding metode tidak langsung
Rekomendasi:
Identifikasi immunoglobulin, komplemen, komplek imun pada biopsy ginjal

dan kulit.
Melokalisasi antigen Viral, bakterial, protozoal, dalam smear atau cairan
tubuh.

2. Metode tidak langsung (indirect method) menggunakan dua macam antibodi, yaitu
antibodi primer (tidak berlabel) dan antibodi sekunder (berlabel). Antibodi primer
bertugas mengenali antigen yang diidentifikasi pada jaringan (first layer), sedangkan
antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer (second layer). Antibodi
kedua merupakan anti-antibodi primer. Pelabelan antibodi sekunder diikuti dengan
penambahan substrat berupa kromogen. Kromogen merupakan suatu gugus fungsi

senyawa kimiawi yang dapat membentuk senyawa berwarna bila bereaksi dengan
senyawa tertentu.
Kelebihan: Versatility, dan lebih sensitive dari pada metode langsung.
Kekurangan : Latar tidak tampak, dan harus dengan frozen section
Rekomendasi : Antibodi pada dalam serum (dipakai sebagai antibodi primer: penyakit
auto imun, infeksi bakteri dan parasit).
Interpretasi : Sampel yang telah di proses dengan metode langsung atau tidak
langsung di amati dibawak mikroskop. Jenis mikroskop tergantung perwanaan. Untuk
pewarnaan dengan fluoresen menggunakan mikroskop Fluoresensi

Metode lain dalam imunohistokimia adalah

Metode Peroxidase Anti Peroxidase (PAP) adalah analisis imunohistokimia
menggunakan tiga molekul peroksidase dan dua antibodi yang membentuk
seperti roti sandwich. Teknik ini memanfaatkan afinitas antibodi terhadap
antigen (enzim) untuk membentuk kompleks imun stabil sebagai perlawanan
terhadap proses kimia terkonjugasi. Fitur unik dari prosedur ini adalah larutan
enzim-antibodi dan kompleks imun PAP. Enzim Horseradish Peroksidase,
protein imunogenik, digunakan untuk menyuntik spesies tertentu dan

merespon imun poliklonal yang dihasilkan terhadap enzim.

Metode
Avidin-Biotin-Complex
(ABC)
adalah
metode

analisis

imunohistokimia menggunakan afinitas terhadap molekul avidin- biotin oleh

tiga enzim peroksidase. Situs pengikatan beberapa biotin dalam molekul
avidin tetravalen bertujuan untuk amplifikasi dan merespon sinyal yang
disampaikan oleh antigen target.
Penggunaan Antibodi

Antibodi Raising : penyuntikan Ag pada suatu hewan untuk menghasilkan Ab. Sel B
akan menghasilkan Ab spesifik yang bereaksi dengan Ag yang disuntikkan terus
menerus pada hewan tertentu.
Antibodi Polyclonal: antibodi yang sering digunakan untuk deteksi hingga
saat ini. Pada larutan antibodi ini terdapat bermacam-macam molekul antibodi.
Satu molekul antibodi biasanya mengenali satu macam epitope, sehingga
antibodi poliklonal dapat mengenali lebih dari satu macam epitope. Antibodi

poliklonal kurang spesifik apabila digunakan sebagai alat deteksi.

Antibodi Monoclonal: jenis antibodi pengembangan dari antibodi poliklonal.
Larutan antibodi ini hanya mempunyai satu macam molekul antibodi sehingga
hanya dapat mengenali satu macam antigen. Antibodi monoklonal lebih
spesifik apabila digunakan sebagai alat deteksi. Namun terdapat beberapa
kendala teknis dalam penyiapan monoklonal antibodi ini. Laboratorium kultur
sel mamalia untuk pembuatan hibridoma penghasil monoklonal antibodi,
memerlukan peralatan yang rumit dan keterampilan tinggi. Namun masalah
utama pada penyiapan monoklonal antibodi adalah pada saat seleksi sel
hibridoma. Sel hibridoma disiapkan dengan melakukan fusi sel B dari bagian
limpa hewan yang diimunisasi dengan sel kanker. Sementara itu hewan yang
diimunisasi dengan satu macam antigen mampu menghasilkan 6x106 sel B
yang berbeda. Satu macam sel B akan menghasilkan satu macam antinodi.
Pada saat dilakukan fusi sel B, akan didapatkan 6x106 sel hibridoma yang
berbeda. Pada pembuatan monoklonal antibodi, harus diseleksi satu macam
hibridoma dari sejumlah hibridoma tersebut. Hal ini merupakan pekerjaan
yang sullit dan memakan waktu lama. Kesulitan pembuatan monoklonal
antibodi di atas, menimbulan usaha-usaha kembali untuk mendapatkan jenis
antibodi baru yang spesifik dengan cara yang lebih mudah. Harapan
didapatkanya antibodi seperti ini muncul ketika keseluruhan struktur antibodi
(khususnya IgG) telah selesai dipelajari dan ditemukanya teknik PCR.
Antibodi baru yang didapat seringkali sisebut antibodi rekombinan.

Labeling Antibodi dapat menggunakan:

Flourochromes
Enzime (peroxidase, alkaline phospat) + substrat
Electron scatering

Aplikasi teknik ini digunakan untuk deteksi:

Deteksi kanker
Diferensial diagnosa
Treatment kanker
Penelitian

Teknik Pembuatan Preparat Histopatologi:

-

Pengambilan sampel
Harus segar, jaringan diambil secepat mungkin dari hewan mati
Ukuran jaringan berkisar 1 cm3. Harus segera difiksasi dan harus terfiksasi
sempurna. Apabila jaringan terlalu tebal, jaringan bagian dalam membusuk

karena tidak terfiksasi.

Merendam jaringan dengan buffered neutral formalin (BNF) 10%
Perendaman ini bertujuan untuk mengawetkan jaringan agar terhindar dari pencernaan
jaringan oleh enzim/otolitis atau bakteri dan untuk melindungi struktur fisik sel.
Bahan yang digunakan adalah larutan buffered neutral formalin (BNF) 10% dengan
pH 6,5-7,5. pH ideal adalah 7,0. Agar terfiksasi sempurna, perbandingan antara

jaringan dan larutan adalah 1:10 dan lama fiksasinya yaitu 2 hari.
Proses pembuatan preparat:
Memotong jaringan organ: organ diambil dari larutan fiksatif kemudian
ditiriskan pada saringan. Kemudian dilakukan pemotongan dengan scapel
dengan ketebalan 0,3-0,5 mm dan disusun kedalam tissu cassette, kemudian

sejumlah tissu cassette dimasukkan kedalam keranjang khusus.

Proses dehidrasi: keranjang dimasukkan kedalam mesin processor otomatis.

Tahapan waktu dehidrasi adalah:

etanol 70% selama 2 jam
ethanol 80% selama 2 jam
ethanol 90% selama 2 jam
ethanol absolute selama 2 jam
ethanol absolute selama 2 jam
xylol selama 2 jam
xylol selama 2 jam
parafin cair selama 2 jam
parafin cair selama 2 jam
Vakum: penghilanagn udara dari jaringan dengan menggunakan mesin vakum
yang mempunyai tabung untuk menyimpan keranjang yang diisi parafin cair
dengan suhu 59-600C dan divakum selama 30 menit. Keranjang diangkat dan
kemudian tissue cassette dikeluarkan dan disimpan pada temperatur 600C
untuk sementara waktu.

Mencetak blok parafin: cetakan dari bahan stainles steel dipanaskan diatas
bunsen, lalu kedalam setiap cetakan dimasukkan jaringan sambil diatur dan
sedikit ditekan. Tuangkan parafin cair kedalam tempat yang berisi jaringan
sampai jaringan terendam semua. Parafin dibiarkan membeku diatas mesin
pendingin dan blok parafin dilepas dari cetakan dan disimpan di freezer

dengan suhu -200C.

Memotong blok jaringan: Blok parafn yang mengandung jaringan, kemudian
dipotong dengan menggunakan mesin mikrotom (Gambar 3) dengan ketebalan
berkisar 3 4 mikrometer. Potongan tersebut diletakkan secara hati-hati di atas
permukaan air dalam waterbath bersuhu 46 C . Pada kesempatan ini bentuk
irisan dirapikan, kemudian diletakkan di atas kaca obyek yang telah diolesi
ewith, yang berfungsi sebagai bahan perekat . Kaca obyek dengan jaringan di
atasnya disusun di dalam rak khusus dan dimasukkan ke dalam inkubator

bersuhu 60C sampai preparat siap untuk diwamai .

Pewarnaan preparat: dilakukan dengan metode H & E staining. Pewarnaan metode
ini adalah sebagai berikut.
Hematocilin: Timbang serbuk hematoksilin I gram, potasium aluminium
sulfat sebanyak 50 gram dan sodium iodate ( Na 103 ) sebanyak 0,2 gram
dilarutkan dalam 1 liter akuades menggunakan alat pengaduk (stirer) dengan
sedikit dipanaskan, kemudian disimpan satu malam dalam temperatur ruangan.
Keesokkan harinya larutan tersebut ditambahkan asam sitrat (C6H807)
sebanyak 50 gram dan chloral hydrate (CZH3CL30Z) sebanyak 50 gram.
Larutan dipanaskan dan diaduk selama 5 menit, kemudian didinginkan dan
disaring. Larutan akan stabil selama 1- 2 tahun dalam botol berwama gelap

pada temperatur ruangan.

Eosin: Timbang serbuk eosin Y sebanyak 7,5 gram, erythrosin sebanyak 7,5
gram dan calcium chlorida sebanyak 2,5 gram dilarutkan dalam akuades 1 liter
kemudian disaring . Larutan akan stabil selama 6 - 12 bulan dalam botol gelap
pada temperatur ruangan.

PROSES PEWARNAAN HEMATOKSILIN DAN EOSIN

Preparat yang akan diwarnai diletakkan pada rak khusus dan dicelupkan secara
berurutan ke dalam larutan dengan waktu sebagai berikut
Xylol 3 menit
Xylol 3 menit
Ethanol absolute 3 menit
Ethanol absolute 3 menit
Ethanol 90% 3 menit

Ethanol 80% 3 menit

Bilas dengan air keran 1 menit
Larutan hematoksilin 6-7 menit
Bilas dengan air keran 1 menit
Larutan pembiru 1 menit
Air keran 1 menit
Larutan eosin 1 - 5 menit
Bilas dengan air keran 1 menit
Ethanol 80 % 10 celupan
Ethanol 90 % 10 celupan
Ethanol absolute 10 celupan
Ethanol absolute 1 menit
Xylol 3 menit
Xylol 3 menit
Xylol 3 menit

Preparat diangkat satu persatu dari larutan xylol dalam keadaan basah, diberi satu
tetes cairan perekat ( DPX ) dan selanjutnya ditutup dengan kaca penutup. Hasil
pewarnaan dapat dilihat di bawah mikroskop.

PROSES PREPARAT HISTOPATOLOGI (referensi lain)

Pengambilan sampel
Pembuatan sediaan dari suatu jaringan dimulai dengan operasi, biopsi, atau autopsi.
Selain itu, Jaringan juga dapat diperoleh dengan jalan usapan atau smear. Jaringan

yang diambil kemudian diproses.

Fiksasi
Merupakan suatu usaha untuk mempertahankan elemen-elemen sel / jaringan agar
tetap pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk dan ukuran. Zat yang

digunakan : fiksatif.
Dehidrasi
Adalah penarikan molekul air dari dalam jaringan. Dilakukan setelah proses fiksasi,
kegagalan / ketidaksempurnaan pada proses ini menyebabkan kegagalan pada langkah
selanjutnya. Sel pada jaringan hidup mengandung air 85% , air tidak tercampur
dengan paraffin / seloidin sehingga perlu dehidrasi. Kemikalia yang digunakan:
ethanol, Dioxane, Acetone dsb. Dehidrasi menggunakan alkohol bertingkat mulai
konsentrasi rendah sampai absolut. Proses Dehidrasi digunakan untuk memudahkan

proses infiltrasi parafin ke dalam jaringan menggunakan alkohol dari konsentrasi

rendah-tinggi.
Penjernihan / clearing
Penjernihan / Kemikalia berfungsi membuat jaringan menjadi jernih dan
transparan.
Merupakan perantara antara proses dehidrasi dengan proses penanaman.
Bila memakai alkohol pada dehidrasi perlu dilakukan dealkoholisasi.
Waktu yang dipergunakan tergantung dari: tebal jaringan/besar kecilnya
jaringan, konsentrasi jaringan, macam zat fiksasi yang dipakai, sifat clearing

agent yang dipakai

Embedding
Embedding adalah Proses memasukkan jaringan ke dalam parafin cair untuk dibuat

blok yang padat.

Sectioning / cutting
Sectioning adalah proses pemotongan jaringan dengan mikrotom-ukuran sangat tipis

4-10 -tembus cahaya saat diperiksa dengan mikroskop

Mounting : Menempelkan potongan jaringan yg baik ke obyek glass
Staining
Staining merupakan proses Pewarnaan preparat. Macam pewarnaan berdasarkan asal
zat warna :
Natural Dyes.
Acid Carmine : ekstrak serangga betina yang hidup di pohon kaktus di daerah
tropis.
Hematoxyline : getah pohon Haematoxylinecampechianum
Syntetic Dyes
Benzene, Quinone, Anilline.
Prinsip Kerja Pewarnaan adalah secara umum zat warna yang bersifat asam akan
mewarnai bagian sel yang bersifat basa dan sebaliknya cat netral (gugus asam dan
gugus basa keduanya berwarna) Misal :Romanowsky, (Camp methylen Blue & Eosin)
Berdasarkan waktu, proses pewarnaan dibagi menjadi:
Direct Staining, molekul zat warna langsung ditangkap oleh jaringan,
misalnya Eosin
Indirect Staining, molekul zat warna baru bisa ditangkap oleh jaringan jika
menggunakan zat perantara yang disebut Mordant, misalnya Haematoxyline

menggunakan Potasium Alum sebagai mordantnya.

Pemeriksaan mikroskopik
Preparat yang telah melalui serangkaian proses kemudian diamati di bawah
mikroskop dengan pembesaran objektif kecil.

CONTOH ANALISIS SEL DENGAN IHK

Adapun marker untuk diagnosa IHK adalah sebagai berikut:

Carcinoembryonic antigen (CEA): digunakan untuk identifikasi adenocarcinoma.

Cytokeratins: digunakan untuk identifikasi carcinoma tetapi juga dapat terekspresi

dalam beberapa sarkoma.

CD15 and CD30 : digunakan untuk identifikasi Hodgkin's disease
Alpha fetoprotein: untuk tumor yolk sac dan karsinoma hepatoselluler
CD117 (KIT): untuk gastrointestinal stromal tumors (GIST)
CD10 (CALLA): untuk renal cell carcinoma dan acute lymphoblastic leukemia
Prostate specific antigen (PSA): untuk prostate cancer estrogens dan progesterone

staining untuk identifikasi tumor

Identifikasi sel B limfa menggunakan CD20
Identifikasi sel T limfa menggunakan CD 3

Langkah-langkah dalam melakukan imunohistokimia dibagi menjadi dua, yaitu preparasi

sampel dan sampe labelling.

Preparasi sampel adalah persiapan untuk membentuk preparat jaringan dari jaringan
yang masih segar.
Preparasi sample terdiri dari :
pengambilan jaringan yang masih segar,
fiksasi jaringan biasanya menggunakan formaldehid,
embedding jaringan dengan parafin atau dibekukan pada nitrogen cair,
pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom,
deparafinisasi dan antigen retrieval untuk membebaskan epitop jaringan,
bloking dari protein tidak spesifik lain.
Sampel labeling adalah pemberian bahan-bahan untuk dapat mewarnai preparat.
Sampel labeling terdiri dari :
imunodeteksi menggunakan antibodi primer dan sekunder,
pemberian substrat,
counterstaining untuk mewarnai jaringan lain di sekitarnya.

Pewarnaan IHK dapat memakai:

Fluorucent 488 dan Fluorucent 594. Biasa dipakai dalam pewarnaan IHK indirect &
direct method.
Multiple inflourocent, dengan menggunakan flourocent untuk menghasilkan

warna yang berbeda pada 2 kutub yang berbeda.

Enzime (Streptavidin Horse Radish Peroksidase/SAHRP) + Fluorucent 488 sebagai
substrat untuk menghasilkan warna.

 PAP (Peroksidase Anti-Peroksidase) method menggunakan pewarna dengan

enzim. Prosesnya adalah Ag+Ab1+Ab2+enzim SAHRP.
ABC (Add Avidin/Biotinilated Enzim Complex) method. Prosesnya adalah

Ag+Ab1+Ab2 biotinilasi+avidin.
Rodamin, untuk memberikan waena merah, hijau, dsb.
Pewarna DAB (Di Amino Benzen) untuk mewarna IL-2, IL-6 dsb. Menghasilkan
warna merah.