DELLA SRI RESKY

1610319001
Protokol Elisa Insulin menggunakan Morinaga Kit
 MORINAGA
U L T R A
SENSITIVE
I N S U L I N
E L I S A K I T

96 wells

Digunakan untuk menentukan jumlah insulin

dalam serum / plasma / cairan pada tikus/rat
secara kuntitatif.
 Outline

1.1 1.2 1.3 1.4

Prinsip Assay Alat dan Bahan Persiapan serum dan ELISA Assay
plasma tikus/rat
 1.1 Prinsip Assay
1 3 5 7
Reaksi Pertama Reaksi Kedua Reaksi Enzim Evaluasi Hasil
Insulin dalam sampel Horse radish peroxidase (POD) POD yang terikat Konsentrasi insulin ditentukan
tikus / rat terikat adalah anti-insulin antibodi dalam microplate well dengan cara interpolasi
dengan anti-insulin yang terkonjugasi, akan akan terdeteksi dengan menggunakan kurva standar
antibodi hewan coba berikatan pada kompleks anti- yang didapatkan dari memplot
penambahan solusio
yang dilapisi pada insulin antibodi hewan coba
substrat 3, 3 ', 5, 5- absorbansi yang dibandingkan
microplate well. dan insulin tikus / rat yang
tetramethylbenzidine dengan standar konsentrasi
diimobilisasi pada microplate
(TMB). insulin tikus / rat.
well.

2 4 6
Pencucian Pertama Pencucian Kedua Pengukuran Absorbansi
Bahan yang tidak Sisa POD dapat
terikat dihilangkan dihilangkan
dengan mencuci. dengan mencuci.
1.2 Alat dan Bahan
1.3 Persiapan Serum dan Plasma Tikus / Rat
Plasma:

Kumpulkan darah ke dalam tabung yang mengandung antikoagulan seperti

heparin (konsentrasi akhir: 1 unit / mL), EDTA (konsentrasi akhir: 0,1%), atau
natrium sitrat (konsentrasi akhir: 0,76%), dan centrifuge pada 4 °C untuk 20
menit pada 2.000 x g.

Serum:

Kumpulkan darah, biarkan menggumpal, dan centrifuge pada suhu 4 °C

selama 20 menit 2.000x g.
 1.4 ELISA Assay
Persiapan Reagen

Sebelum digunakan, semua reagen harus dibawa ke suhu kamar (18-25 ° C), dan harus disimpan pada suhu
2-8 °C segera setelah digunakan. Sebelum digunakan, campur reagen secara menyeluruh dengan agitasi
lembut atau berputar-putar.

1. Microplate berlapis antibodi

Lepaskan “microplate berlapis Antibodi" (bertanda "A") dari kantong foil yang tersegel setelah kantong
disetimbangkan ke suhu kamar.
Catatan: Lempeng mikro harus digunakan pada hari yang sama dengan kantong dibuka.

2. Solusio stok insulin tikus / rat

Rekonstitusi “Standar Insulin tikus / rat, yang di liofilisasi” (bertanda “B”) dengan menambahkan 100 μL air
suling atau air deionisasi dengan hati-hati ke dalam botol. Balik botol dengan lembut sampai isinya benar-
benar larut. Solusio stok mengandung 25,6 ng / mL insulin tikus / rat. Rekonstitusi solusio stok insulin tikus
/ rat stabil selama satu minggu pada 2-8 ° C.
3. Enzim anti-insulin terkonjugasi
Untuk enam modul, siapkan volume larutan enzim anti-insulin terkonjugasi yang dibutuhkan dengan
mencampurkan 3,6 mL “Solusio stok Enzim Anti Insulin terkonjugasi” (bertanda“ C ”) dengan 1,8 mL
“Enzyme Conjugate Diluent” (bertanda "D"), dan aduk hingga larutan benar-benar homogen dan jernih.
Hindari berbusa saat pencampuran.
Catatan: Enzim anti-insulin terkonjugasi harus disiapkan sebelum reaksi kedua dan harus segera
digunakan.

4. Larutan substrat enzim

"larutan substrat enzim" (bertanda "E") disediakan sebagai preparat siap pakai. Setelah botol dibuka,
larutan substrat enzim stabil selama satu minggu pada 2-8 ° C.
Catatan: Hindari paparan larutan substrat enzim terhadap cahaya.
5. Larutan penghenti reaksi enzim (1 N asam sulfat)
"Solusi Penghenti Reaksi Enzim" (bertanda "F") disediakan sebagai preparat siap pakai.

6. Pengencer sampel
"Pengencer Sampel" (bertanda "G") disediakan sebagai preparat siap guna. Setelah botol dibuka,
pengencer sampel stabil untuk satu minggu pada 2-8 ° C.

7. Buffer pencuci
"Wash Buffer Stock Solution" (bertanda "H") dimasukkan sebanyak 1 L dengan air suling atau air
deionisasi dalam labu volumetrik. Campur larutannya dengan baik sebelum digunakan. Buffer pencuci
stabil selama satu minggu pada suhu 2-8 ° C
Persiapan standar insulin tikus / rat

1. Pipet 150 μL pengencer sampel (bertanda “G”) dan 50 μL solusio stok insulin tikus / rat (25,6 ng / mL)
ke dalam mikrotube polipropilen berlabel 6,4 ng / mL dan aduk hingga rata.
2. Keluarkan pengencer sampel dan dimasukkan ke dalam enam mikrotube masing-masing 50 μL
polipropilen diberi label 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, dan 3,2 ng / mL.
3. Keluarkan 50 μL dari standar 6,4 ng / mL ke dalam mikrotube 3,2 ng / mL, dan aduk hingga rata.
4. Keluarkan 50 μL dari standar 3,2 ng / mL ke dalam mikrotube 1,6 ng / mL, dan aduk hingga rata.
5. Ulangi skema pengenceran ini menggunakan microtubes yang tersisa.
6. Keluarkan 50 μL pengencer sampel ke dalam satu mikrotube polipropilen berlabel 0 ng / mL.

Catatan: Standar insulin harus disiapkan sesaat sebelum digunakan dan dibuang setelah digunakan.
Siapkan standar insulin yang berfungsi dengan menggunakan polypropylene mikrotub karena
polypropylene menunjukkan minimal adsorpsi insulin.
 Assay Procedure
Reaksi pertama:

1. Lepaskan modul microplate yang dilapisi antibodi (bertanda "A") dari kantong penutup foil setelah
kantong diseimbangkan dalam suhu ruangan. Pasang microplate ke bingkai pendukung.

2. Di setiap well, keluarkan 95 μL pengencer sampel (bertanda “G”).

3. Pipet 5 μL sampel (atau 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, dan 6,4 ng / mL standar insulin tikus / tikus) ke
dalam well
Catatan: Setiap standar dan sampel harus diuji dalam rangkap dua. Itu juga direkomendasikan agar
pipet presisi 10 μL atau lebih, baik digunakan saat mengeluarkan volume kecil (5 μL).

4. Tutupi microplate dengan penutup plastik dan inkubasi selama 2 jam pada suhu 4 ° C.
Reaksi kedua:

5. Aspirasi isi well dan cuci lima kali menggunakan 300 μL buffer pencuci per well. Setelah masing-
masing dicuci, hapus sisa larutan dengan membalik dan mengetuk microplate dengan kuat di atas
handuk kertas bersih.

6. Ambil 100 μL per well konjugat enzim anti-insulin.

7. Tutup microplate dengan penutup plastik dan inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar
Reaksi ketiga:

8. Aspirasi isi well dan cuci tujuh kali menggunakan 300 μL buffer pencuci per well. Setelah
masing-masing dicuci, hapus sisa larutan dengan membalik dan mengetuk microplate
dengan kuat di atas handuk kertas bersih.

9. Segera ambil dan masukkan 100 μL per well larutan substrat enzim (ditandai "E") dan
bereaksi selama 40 menit pada suhu kamar. Selama Reaksi enzim, hindari mengekspos
microplate dengan cahaya. Catatan: Jangan menutupi microplate dengan aluminium foil.

10. Hentikan reaksi enzim dengan menambahkan 100 μL per well larutan penghenti reaksi
enzim (bertanda “F”).

11. Ukur absorbansi dalam 30 menit menggunakan pembaca plat. (Ukur nilai A450 dan kurangi
nilai A630).
Summary of ELISA assay
 You can simply impress your audience and
add a unique zing and appeal to your
Presentations. Easy to change colors,
photos and Text. Get a modern
PowerPoint Presentation that is beautifully
designed. You can simply impress your
audience and add a unique zing and
appeal to your Presentations. Easy to
change colors, photos and Text. Get a
modern PowerPoint Presentation that is

THANKYOU
beautifully designed.