Judul : Pemeriksaan WANTAI HBsAg ELISA

Hari/Tanggal : Sabtu, 18 Januari 2019

Tujuan :

Untuk mendeteksi antigen virus Hepatitis B (HBsAg) di dalam serum/plasma secara kualititatif

Prinsip :

Untuk dekteksi HBsAg, WANTAI HBsAg ELISA menggunakan metode antibodi “sandwich”
ELISA dimana, strip polystyranne microwell (sumuran) sudah dilapisi terlebih dahulu (pre-
coated) dengan antobodi monoclonal yang spesifik terhadapp HBsAg. Serum/plasma pasien
ditambahkan ke dalam microwell bersamaan dengan antibodi sekunder berkonjugasi dengan
enzim horse radish peroksidase (HRP – conjugate) yang akan menempel pada berbagai epitop
pada HBsAg. Selama inkubasi, kompleks imun yang terbentuk karena adanya HBsAg yang
spesifik di dalam serum/plasma pasien, akan ditangkap/menempel pada bagian dasar (solid-
phase) microwell (sumuran). Setelah dicuci untuk membuang non-spesifik serum protein dan
HRP – conjugate yang tidak berikatan, larutan komogen yang mengandung tetramethyl-
benzidine (TMB) dan urea peroksida ditambahkan ke dalam sumuran. Adanya kompleks imun
“sandwich” antibodi – antigen – antibodi (HRP), kromogen yang semula tidak berwarna akan
dihidrolisis oleh HRP-conjugate dan berubah menjadi produk berwarna biru. Warna biru akan
berubah menjadi kuning ketika ditambahkan stop solution (asam sulfat) untuk menghentikan
reaksi hidrolisis enzim. Intensitas warna kuning yang dihasilkan dapat diukur dan kadar antigen
(HBsAg) yang terdapat dalam sumuran dapat dihitung, sesuai dengan proporsi intensitas warna
yang dihasilkan pada akhir reaksi. Kadar antigen yang didapat mewakili kadar antigen di dalam
sampel serum/plasma pasien. Sumuran yang tidak mengandung HBsAg (negative) akan tetap
tidak berwarna.

Alat dan Bahan :

1. Mircowell plate (sumur mikrotiter) : Sumuran sudah dilapisi oleh antibodi

monoclonal yang spesifik terhadap HBsAg.
2. Negative control : Larutan berwarna kuning di dalam vial dengan tutup berwarna
hijau. Mengandung buffer dengan protein yang sudah distabilkan, teruji negatif
untuk HBsAg
3. Positive control : Larutan berwarna merah di dalam vial dengan tutup berwarna
merah. HBsAg dilarutkan dalam buffer protein yang sudah distabilkan.
4. HRP – Conjugate : Larutan berwarna merah di dalam vial berwarna putih dengan
tutup berwarna merah. Mengandung enzim Horse Radish Peroksidase yang
dikonjugasi dengan anti- HBs.
5. Wash – Buffer : larutan tak berwarna di dalam botol transparan dengan tutup
berwarna putih. Larutan buffer mengandung surfactant. Pengenceran harus
 dilakukan dengan rasio 1 : 20 dengan diionized water (air distilasi) sebelum
digunakan. Setelah diencerkan, stabilitas larutan sampai dengan 1 minggu pada
suhu ruang, dan 2 minggu pada suhu 2 – 8 oC.
6. Chromogen Solution A : Larutan tidak berwarna di dalam vial berwarna putih
dengan tutup berwana hijau. Larutan urea peroksidase.
7. Chromogen solution B : Larutan tidak berwarna di dalam vial berwarna hitam
dengan tutup berwarna hitam. Larutan TMB (Tetramethyl benzydine).
8. Stop Solution : Larutan tidak berwarna di dalam vial berwarna putih dengan tutup
berwana putih. Larutan asam sulfat yang sudah diencerkan (0,5 M H2SO4).
Semua reagen siap dipakai dengan penyimpanan pada suhu 2 – 8 oC dan stabilitas 4
minggu setelah reagen dibuka, terkecuali untuk Wash-Buffer saja. Di dalam kit
WANTAI HBsAG ELISA juga disediakan :
- Plastic Sealable Bag (kantung plastik) : untuk menyimpan microwell strips
- Cardboard Plate Cover (Penutup) : untuk menutup microwell saat reaksi
berlangsung

 Distilled water (air distilasi)

 Timer (penghitung waktu)
 Mikropipet

Jenis Sampel dan Penyimpanannya :

Kriteria sampel yang dapat digunakan untuk deteksi HBsAg dengan metode WANTAI
adalah :

- Serum
- Plasma (EDTA/ heparin/ Natrium Citrate)
- Tidak lisis, lipemik, atau ikterik
- Sampel tidak berasal dari cairan tubuh (urin, cairan spinal, pleura, sputum)
- Penyimpanan sampel pada suhu 2-8oC, untuk sampel yang akan diperiksa dalam
kurun waktu 1 minggu setelah diterima, disimpan pada suhu -200C
- Hindari penggunaan sampel yang sudah dicairkan dan dibekukan ulang

Penyimpanan dan Stabilitas Reagen :

Komponen di dalam kit akan stabil sampai pada tanggal kadaluarsa (expiration date) yang tertera
pada kit dengan penyimpanan pada suhu 2 – 80C, jangan pada suhu freezer/beku. Untuk
memastikan kualitas dan akurasi pemeriksaan Wantai HBsAg, selama penyimpanan harus
meminimalkan adanya kontaminasi dari mikroorganisme atau cairan kimia lainnya.
Hal-hal yang harus diperhatikan :

Pemeriksaan dengan metode ELISA sangat sensitif terhadap suhu dan waktu/masa inkubasi.
Untuk menghindari hasil yang tidak valid, seluruh tahapan dalam cara kerja harus dilakukan
dengan baik dan benar, tidak boleh diubah.

1. Jangan mengganti reagen dengan reagen dari lot yang berbeda atau dari komersial kit
lainnya (berbeda merk). Komponen yang ada di dalam kit sudah distandarisasi untuk
memberikan hasil yang optimal untuk pemeriksaan HBsAg
2. Pastikan semua reagen belum melewati tanggal kadaluarsa (expiration date) dan memiliki
lot yang sama. Jangan gunakan reagen yang sudah kadaluarsa.
3. PERHATIAN KHUSUS. Adaptasikan seluruh reagen pada suhu ruang (18-300C) terlebih
dahulu sebelum memulai pemeriksaan. Lakukan homogenisasi untuk setiap reagen dan
kembalikan ke dalam kulkas (2-80C) segera setelah selesai digunakan.
4. Volume sampel yang digunakan harus sesuai dengan yang tertera pada cara kerja. Jika
volume sampel kurang/lebih dapat mengurangi tingkat sensitivitas dari pemeriksaan ini.
5. Bagian bawah dari sumuran tidak boleh dipegang , hindarkan dari sidik jari atau goresan
karena dapat mengganggu pembacaan. Ketika proses pembacaan sedang berlangsung,
pastikan bagian bawah dari sumuran tidak basah dan tidak ada gelembung udara di dalam
sumuran
6. Setelah tahap pencucian pastikan sumuran tidak dibiarkan kering, segera lanjutkan ke
tahap selanjutnya. Hindari terbentuknya gelembung udara saat memasukan reagen ke
dalam sumuran.
7. Pastikan prosedur kerja pada semua sumuran dilakukan secara bersamaan
8. Kalibrasi mikropipet secara berkala untuk memastikan akurasi volume sampel dan reagen
yang dimasukan ke dalam sumuran. Gunakan mikrotip yang berbeda untuk setiap sampel
dan reagen yang berbeda untuk menghindari terjadinya kontaminasi silang.
9. Pastikan suhu saat tahap inkubasi adalah 370C di dalam inkubator
10. Ketika menambahkan sampel/reagen ke dalam sumuran, pastikan mikrotip tidak
menyentuh bagian dasar sumuran
11. Ketika mengukur absorbansi dengan plate reader, tentukan panjang gelombangnya
450nm atau 450/630 nm
12. Aktivitas enzim HRP-conjugate dapat dipengaruhi oleh adanya debu atau bahan kimia
reaktif lainnya seperti natrium hipoklorit, asam, basa, dll. Jangan lakukan pemeriksaan
pada lingkungan yang mengandung bahan kimia tersebut.
13. Jika menggunakan alat otomatis, selama tahap inkubasi, jangan tutup sumuran dengan
penutup (plate cover). Setelah tahap pencucian, sisa-sisa cairan dari dalam sumuran dapat
dibersihkan dari penutup (plate cover)
14. Semua sampel yang berasal dari manusia harus dikategorikan sebagai sampel infeksius.
Perhatikan prosedur personal safety / laboratory safety pada Good Laboratory Practice.
 15. PERINGATAN : Bahan yang berasal dari manusia kemungkinan besar digunakan dalam
persiapan negative control yang ada pada kit. Bahan-bahan ini telah diuji dan
memberikan hasil negative terhadap antibody HCV, HIV1/2, TP, dan HBsAg. Namun,
tidak ada metode pemeriksaan yang dapat memastikan bahwa antigen infeksius tersebut
benar-benar tidak ditemukan dalam reagen pada kit. Maka dari itu, perlakukan seluruh
reagen dan sampel sebagai bahan infeksius. Bovine serum telah digunakan untuk
menstabilkan negatif dan positif kontrol. Bovine Serum albumin (BSA) dan Fetal calf
sera (FCS) berasal dari hewan dari area geografis yang bebas BSE/TSE
16. Jangan makan, minum, merokok, atau menggunakan kosmetik di dalam laboratorium.
Jangan menggunakan pipet dengan mulut.
17. Bahan-bahan kimia harus ditangani dan dibuang dengan teknik yang baik dan benar
sesuai dengan GLP
18. Mikrotips, vial, strip, dan wadah specimen harus dikumpulkan dan di autoklaf selama 2
jam pada suhu 1210C atau direndam dengan natrium hipoklorit 10% selama 30 menit
untuk dekontaminasi sebelum dilakukan proses pembuangan. Cairan yang mengandung
natrium hipoklorit tidak boleh di autoklaf. MSDS (Material Safety Data Sheets) tersedia
jika dibutuhkan
19. Beberapa reagen dapat menyebabkan keracunan, iritasi, luka bakar, atau bersifat
karsinogenik. Hindari kontak dengan kulit atau selaput mukosa.
20. Stop solution mengandung 0.5M H2SO4 yang merupakan asam kuat. Gunakan dengan
sangat hati-hati. Bersihkan segera jika ada tumpahan atau jika terkena kulit/selaput
mukosa, segera bersihkan dengan air
21. ProClin 300 1% digunakan sebagai pengawet/ preservatives yang dapat mengakibatkan
iritasi kulit. Bersihkan dengan air segera jika terkena kulit/mata.

Cara Kerja :

Persiapan Reagen

1. Adaptasikan seluruh reagen di dalam kit pada suhu ruang (18-300C)

2. Periksa reagen Wash-Buffer dari pembentukkan kristal garam, jika terbentuk kristal
hangatkan wash-buffer pada suhu 37oC sampai kristal terlarut kembali.

3. Pengenceran wash buffer dengan rasio 1 : 20 menggunakan deionized water (air

distilasi.

Berikut tabel penjelasan cara kerja pemeriksaan WANTAI HBsAg ELISA :

 - Beri label pada 3 sumuran sebagai Negative control (B1, C1,
D1) , 2 Positive control ( E1, F1) dan 1 Blank (A1 , tidak
Step 1 Persiapan ditambahkan sampel dan larutan HRP-conjugate)
- Jika pembacaan menggunakan dual wavelength plate reader,
Blanko tidak perlu digunakan.
Step 2 Penambahan - Tambahkan masing- masing 50 uL Positive control, Negative
Sampel control, dan sampel pada sumuran , lalu resuspensi.
- Ganti mikrotip untuk setiap specimen untuk menghindari hasil
positif/negatif palsu
Step 3 Penambahan - Tambahkan 50 uL HRP-conjugate ke dalam setiap sumuran
HRP – (kecuali Blanko), resuspensi, dan plate sumuran ditepuk
conjugate perlahan.
Step 4 Inkubasi - Tutup sumuran dengan penutup yang sudah disediakan dan
inkubasi selama 60 menit pada suhu 37oC
Step 5 Pencucian - Pada akhir inkubasi, buang penutup sumuran, dan cuci setiap
(Washing) sumuran sebanyak 5x dengan menggunakan wash-buffer yang
sudah dilarutkan
- Buang campuran yang ada pada sumuran, dan tambahkan
wash-buffer ke dalam setiap sumuran. Pada tiap kali
pencucian, biarkan wash-buffer di dalam sumuran selama 30 -
60 detik
- Pada akhir pencucian, sumuran di letakkan secara terbalik di
atas kertas tissue, dan ditepuk perlahan untuk memastikan
tidak ada larutan yang tertinggal di dalam sumuran.
Step 6 Pewarnaan - Tambahkan 50uL Chromogen A dan 50 uL Chromogen B ke
dalam setiap sumuran (termasuk Blanko)
- Inkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit. Hindari cahaya
langsung (keadaan gelap)
- Reaksi antara chromogen dan HRP-conjugate akan
menghasilkan warna biru pada Positive control dan serum
yang positif HBsAg
Step 7 Penghentian - Tambahkan 50 uL Stop Solution ke dalam setiap sumuran dan
Reaksi homogenkan
- Warna kuning akan dihasilkan ada Positive control dan serum
yang positif HBsAg
Step 8 Pengukuran - Kalibrasi plate reader dengan Blanko dan baca absorbansinya
Absorbansi pada panjang gelombang 450 nm.
- Jika menggunakan dual wavelength filter, gunakan panjang
gelombang 630 nm.
- Hitung nilai cut-off yang didapatkan dan evaluasi hasil
 - Pembacaan absorbansi harus dilakukan dalam waktu 10 menit
setelah menambahkan stop solution

Petunjuk untuk tahap pencucian

1. Teknik pencucian yang baik sangat penting untuk mendapatkan hasil yang benar dan
presisi.
2. Direkomendasikan untuk menggunakan ELISA microplate washer yang berkualitas baik.
Pada umumnya, tidak kurang dari 5 siklus pencucian otomatis (350-400 uL/well) cukup
untuk menghindari reaksi positif palsu
3. Untuk menghindari kontaminasi silang pada sampel atau HRP conjugat,setelah inkubasi,
jangan buang cairan di dalam sumuran tetapi biarkan plate washer mengaspirasi secara
otomatis.
4. Pastikan bahwa selang yang mengeluarkan microplate washer liquid (cairan pencuci
sumuran) tidak terkontaminasi dan terhambat, dan volume washer liquid yang
dikeluarkan cukup ke dalam setiap sumuran.
5. Jika melakukan tahap pencucian secara manual, lakukan 5 siklus pencucian, dengan 350-
400uL/sumuran dan aspirasi cairan tersebut sebanyak 5 kali. Jika didapatkan hasil yang
kurang baik, tambahkan siklus pencucian dan waktu perendaman per sumuran
6. Cairan yang diaspirasi dalam mikrotip harus dilarutkan dengan larutan natrium hipoklorit
2.5% selama 24 jam sebelum dibuang
7. Cairan wash buffer harus diencerkan dengan rasio 1 : 20 sebelum digunakan. Jika tidak
menggunakan seluruh sumuran dalam 1 plate, hitung volume larutan wash buffer yang
dibutuhkan saja.

Hasil :

Pembahasan :

Quality Control
 Quality control harus dilakukan sebagai langkah validasi, memastikan bahwa
pemeriksaan telah dilakukan dengan teknik yang baik dan benar. Pada teknik WANTAI
HBsAg ELISA, digunakan 2 jenis control yaitu positive control dan negative control,
quality control dinyatakan valid jika :

- Nilai absorbansi Blanko (kromogen dan stop solution), < 0.080 pada panjang
gelombang 450 nm
- Nilai absorbansi Negative control ≤ 0.100 pada panjang gelombang 450-630 nm atau
450 nm dengan blanko
- Nilai absorbansi Positive control ≥0.800 pada panjang gelombang 450-630 nm atau
450 nm dengan blanko

Nilai cut off (value of C.O/NC) pada teknik ini adalah 2.1. NC adalah rata-rata nilai
absorbansi dari ketiga negative control. Jika nilai NC kurang dari 0.05 maka dianggap
nilainya sama dengan 0.05. Jika lebih dari satu nilai absorbansi pada negative control
tidak sesuai pada kriteria di atas, maka harus dilakukan pengulangan dan hasil
pemeriksaan tidak dapat diinterpretasikan karena belum valid.

a. Interpretasi Hasil

Setelah ditentukan nilai cut off (C.O) dan dibaca absorbansi pada setiap sampel,
hasilnya dapat diinterpretasikan sebagai berikut :

Hasil Nilai Interpretasi

Negative A/C.O < 1 Sampel memiliki nilai absorbansi kurang dari nilai
cut off, yang berarti tidak terdeteksi adanya
HBsAg di dalam sampel
- Pasien tidak terinfeksi HBV
- Kantong darah dapat ditransfusikan ke
pasien
Positive A/C.O ≥ 1 Sampel memiliki nilai absorbansi lebih dari nilai
cut off, yang berarti sampel terdeteksi HBsAg
- Sampel yang terdeteksi HBsAg harus
dilakukan pengulangan sebagai tindakan
konfirmasi sebelum interpretasi hasil
- Sampel yang positif HBsAg pada kedua
test (awal dan konfrimasi) dapat
diinterpretasikan bahwa pasien tersebut
positif HBsAg (terinfeksi HBV)
- Kantong darah yang positif HBsAg tidak
boleh ditransfusikan ke pasien.
 Borderline A/C.O 0.9 – Sampel memiliki nilai absorbansi diantara nilai
1.1 cut off (0.9 – 1.1) disebut borderline dan sampel
harus dilakukan pengulangan sebagai tindakan
konfirmasi sebelum interpretasi hasil.

Skema Interpretasi Hasil (Kualitatif)

Pengulangan (DUPLO) Pos(+) , Pos (+) Pos(+) , Neg (-) Neg (-) , Neg (-)

Pos(+) A/C.O ≥0.9 A/C.O < 0.9

Interpretasi

Follow up Borderline -Tidak Neg (-)

dapat diintepretasikan

Penjelasan Skema Interpretasi Hasil (Kualitatif)

- Setelah dilakukan pengulangan (duplo), keduanya didapatkan hasil negative A/C.o < 0.9
maka sampel dapat dinyatakan tidak ada positif palsu dan dapat diinterpretasikan sebagai
NEGATIF
- Setelah dilakukan pengulangan (duplo), salah satu atau keduanya didapatkan hasil positif
maka dapat diinterpretasikan bahwa sampel POSITIF terhadap HBsAg dan pasien dapat
didiagnosa terinfeksi HBV
- Setelah dilakukan pengulangan (duplo), didapatkan nilai absorbansi yang mendekati nilai
cut off,maka hasil pemeriksaan tidak dapat diinterpretasikan dan dinyatakan masuk dalam
kategori borderline. Pasien dengan sampel dengan borderline harus dilakukan
pengulangan pemeriksaan pada kurun waktu tertentu.

WANTAI HBsAg ELISA mendeteksi HBsAg secara kualitatif, hasil yang dapat
diinterpretasikan hanya sebatas Positif atau Negatif saja, teknik ini tidak mampu memberikan
informasi titer/kadar antigen yang diperiksa di dalam sampel. (kuantitatif)

b. Karakteristik teknik WANTAI HBsAg ELISA

Kelebihan teknik WANTAI HBsAg ELISA

- Nilai clinical specificity 99.88 % pada pasien dan 99.64% pada donor, cukup spesifik
untuk mendeteksi HBsAg
 - Nilai clinical sensitivity didapatkan dari pemeriksaan sampel pasien positif HBsAg
dari beberapa fase penyakit hepatitis (akut, kronik, dan pemulihan). Fase akut
memiliki nilai sensitivitas 100 %, fase kronik 99,75% dan fase pemulihan 100%
- Tidak ditemukan reaksi silang pada sampel dari pasien yang terinfeksi dengan HAV,
HCV, HIV, CMV, dan TP
- Tidak ada pengaruhi dari nilai rheumatoid factor hingga 2000 I/mL
- Sampel yang dibekukan telah diuji untuk menilai pengaruh dari penyimpanan dan
pengambilan sampel.

Keterbatasan teknik WANTAI HBsAg ELISA

- Hasil positif harus dikonfirmasi dengan menggunakan teknik lain dan interpretasi
harus berdasarkan informasi kondisi klinis pasien
- Antigen HBsAg terkadang tidak dapat dideteksi pada awal infeksi HBV, karena titer
antigen yang sangat kecil. Teknik WANTAI hanya dapat mendeteksi secara
kualitatif, tidak mampu mengukur kadar antigen di dalam sampel.

- Kesalahan dalam melakukan prosedur yang paling sering adalah :

 Menggunakan reagen kit yang sudah kadaluarsa
 Reagen terkontaminasi (penyimpanan tidak benar)
 Teknik pencucian yang tidak benar mengakibatkan hasil positif palsu
 Tidak menambahkan reagen sesuai dengan prosedur yang ada
 Menggunakan sampel yang lisis, lipemik , ikterik dan masih mengandung fibrin
(clotted serum)
Kesalahan teknik tersebut dapat mengakibatkan hasil positif atau negatif palsu yang
akan menyebabkan kesalahan diagnosa jika interpretasi hasil tersebut dilaporkan kepada
klinisi/dokter.

Kesimpulan :

Pada praktikum ini praktikan dapat melakukan pemeriksaan untuk mendeteksi HBsAg di dalam
serum pasien dengan metode WANTAI HBsAg ELISA.

Metode sandwich ELISA digunakan sebagai prinsip dasar teknik pemeriksaan WANTAI HBsAg
ELISA, meskipun teknik ini memiliki sensivitas dan spesifitas yang cukup tinggi untuk deteksi
HBsAg namun teknik ini hanya memberikan hasil secara kualitatif, titer antigen tidak dapat
diukur dengan teknik ini. Berbagai macam faktor dapat mempengaruhi hasil pemeriksaan seperti
faktor teknik pemeriksaan, penyimpanan reagen, dan jenis sampel yang dipakai. Oleh karena itu,
dalam melakukan pemeriksaan ini harus selalu disertai dengan quality control baik positif
maupun negatif kontrol agar hasil yang dinterpretasikan valid dan dapat digunakan untuk
diagnosis dan prognosis pasien.