LAPORAN PRAKTIKUM

PERCOBAAN III
PENGUJIAN AKTIVITAS IMUNOGLOBIN M (IgM)
EKSTRAK BAHAN ALAM

Nama : Grace Akwila

NIM 2013016215
Kelas. : C2 Farmasi Umum 2020
Kelompok : 1 (Satu)
Dosen Pengampu : M. Arifuddin, S.Si., M.Si., Apt.
Erwin Samsul, M. Si., Apt.
Mata Kuliah : Praktikum Pengujian Bahan Farmasi II

LABORATORIUM FARMAKOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MULAWARMAN
SAMARINDA
2022
A. Pendahuluan

Antibodi berperan dalam mempertahankan sistem imun tubuh

dari berbagai mikroorganisme. Sistem pertahanan tubuh terdiri dari
sistem imun spesifik dan non spesifik. Sistem imun spesifik salah
satunya adalah sel limfosit T dan sel limfosit B. Sel limfosit B yang
tersensitasi oleh antigen dapat memproduksi antibodi (Kresno,
2010). Antibodi yang diproduksi pertama kali adalah IgM
(Imunoglobulin M).Antibodi IgM berperan sebagai respon awal
terhadap masuknya antigen ke dalam tubuh (Schroeder dan Cavacini,
2010). Kadar antibodi IgM akan lebih meningkat pada sensitasi
antigen yang kedua, hal ini disebabkan sel B yang memproduksi
antibodi membentuk sel memori sehingga mengenal langsung
antigen tersebut (Baratawidjaja dan Rengganis, 2014). Apabila
keseimbangan antibodi dalam mempertahankan sistem imun
terganggu maka dibutuhkan suatu agen imunostimulator untuk
mempertahankan keseimbangan sistem imun. (Sterberg kk., 2009).
B. Tinjauan Pustaka
Sistem imun merupakan sistem yang sangat komplek dengan berbagai peran
ganda dalam usaha menjaga keseimbangan tubuh. Seperti halnya sistem
indokrin, sistem imun yang bertugas mengatur keseimbangan, menggunakan
komponennya yang beredar diseluruh tubuh, supaya dapat mencapai sasaran
yang jauh dari pusat. Untuk melaksanakan fungsi imunitas, didalam tubuh
terdapat suatu sistem yang disebut dengan sistem limforetikuler. Sistem ini
merupakan jaringan atau kumpulan sel yang letaknya tersebar diseluruh tubuh,
misalnya didalam sumsum tulang, kelenjar limfe, limfa, timus, sistem saluran
napas, saluran cerna dan beberapa organ lainnya. Jaringan ini terdiri atas
bermacam-macam sel yang dapat menunjukkan respons terhadap suatu
rangsangan sesuai dengan sifat dan fungsinya masing-masing. Sistem imunitas
kita terbagi menjadi tiga jenis yaitu imunitas alami (innate), imunitas buatan
(adaptive) dan imunitas pasif (Effendi & Widiastuti, 2014)..
Imunoglobulin merupakan substansi molekul dalam serum yang
menetralkan dan menghancurkan antigen atau mikroorganisme penyebab
infeksi. Molekul ini dibentuk oleh sel B dalam dua bentuk yang berbeda yaitu
sebagai resptor permukaan untuk antigen dan sebagai antibodi yang
diekskresikan ke dalam bentuk cairan ekstraseluler. Ada lima macam
immunoglobulin, yaitu IgG, IgM, IgA, IgE, dan IgD. IgG terbentuk 2-3 bulan
setelah infeksi, kemudian kadarnya meninggi dalam satu bulan, menurun
perlahan-lahan, dan terdapat selama bertahun-tahun dengan kadar yang rendah.
IgG beredar dalam tubuh dan banyak terdapat pada darah, sistem getah bening,
dan usus. Immunoglobulin A atau IgA ditemukan pada bagian-bagian tubuh
yang dilapisi oleh selaput lendir, misalnya hidung, mata, paru-paru, dan usus.
IgA juga ditemukan di dalam darah dan cairan tubuh lainnya, seperti air mata,
air liur, ASI, getah lambung, dan sekresi usus. Immunoglobulin M (IgM)
merupakan antibodi pertama yang dihasilkan tubuh untuk melawan antigen
tersebut. IgM terbentuk segera setelah terjadi infeksi dan menetap selama 1-3
bulan, kemudian menghilang. Immunoglobulin D atau IgD juga terdapat dalam
darah, getah bening, dan pada permukaan sel-sel B, tetapi dalam jumlah yang
sangat sedikit. Immunglobulin E atau IgE merupakan antibodi yang beredar
dalam aliran darah. Antibodi ini kadang juga menimbulkan reaksi alergi akut
pada tubuh. Oleh karena itu, tubuh seorang yang sedang mengalami alergi
memiliki kadar IgE yang tinggi. Pembentukan imunoglobulin dihasilkan oleh
sel plasma akibat adanya rangsangan antigen tertentu. Sebuah sel plasma hanya
dapat mensintesis satu macam imunoglobulin saja pada satu saat (Effendi &
Widiastuti, 2014).
Imunomodulator adalah sekelompok senyawa yang memiliki kemampuan
modifikasi hingga memperbaiki respon biologis sistem imun, sehingga dapat
memberikan pengaruh terhadap respon imun melalui stimulasi atau disurpresi
yang disebut juga sebagai Biologic Respons Modifier (BRM). Tanaman sirih
hijau (Piper betle L.) merupakan salah satu jenis tumbuhan yang banyak
dimanfaatkan untuk pengobatan. Daun Sirih mengandung berbagai senyawa
kimia aktif yang dipengaruhi oleh area geografis dan lingkungan Bahan dari
sirih yang banyak digunakan yaitu bagian daunnya karena memiliki kandungan
minyak atsiri sebanyak 4,2% dan sebagian besar komponennya terdiri dari
betephenol yang berperan sebagai agen antibakteri. Daun sirih hijau memiliki
beberapa kandungan lainnya seperti steroid, tannin, flavonoid, saponin, fenol,
alkaloid, coumarin, dan emodins (Hilma dkk., 2022).
C. Alat dan Bahan
1. Alat
a. Batang pengaduk
b. Centrifuge
c. Centrifuge tube
d. Corong kaca
e. Eppendorf tube
f. Gelas kimia 50 mL
g. Gelas kimia 100 mL
h. Gelas ukur 10 m
i. Gunting
j. Hot plate
k. Jarum suntik
l. Keranjang
m. Mikropipet 1-100 μm
n. Panci
o. Pipet tetes
p. Pipet ukur 10 mL
q. Plat tetes
r. Pro pipet
s. Spuit 1 mL
t. Stopwatch
u. Timbangan analitik
v. Timbangan hewan
w. Yellow tip

2. Bahan
a. Alcohol Swab
b. Aquades
c. Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA)
d. Etiket
e. Infusa Daun Sirih Hijau (Piper betle L.)
f. KCl
g. KH2PO4
h. Mencit (Mus musculus)
i. NaCl
j. NaH2PO4
k. Phosphate Buffered Saline (PBS)
l. Plastic wrap
m. Sel Darah Merah Sapi (SDMS) 2%
n. Stimuno
D. Prosedur Kerja
1. Pembuatan sampel uji

Daun Sirih Hijau (Piper betle L)

a. Daun sirih hijau dicuci bersih

b. Daun sirih hijau dirajang halus
c. Daun sirih hijau ditimbang sebanyak 100 g
d. Daun sirih hijau dipanaskan d ngan air
sebanyak 100 mL selama 15 me t hingga
suhu mencapai 90o

Infusa Daun Sirih Hijau (Piper betle L)

Pengenceran dilakukan untuk membuat

konsentrasi 5%, 10% 15% dan 20%

2. Pembuatan kontrol positif

Stimuno

a. Sirup stimuno diambil sebanyak 2,6 mL

b. Sirup sti muno dilarutkan dlam aquadest
sebanyak1
00 mL

Larutan Stimuno
3. Penyiapan phospat buffered saline (PBS)

NaH2Po4 & NaCl

a. Larutan A dibuat dengan KH2Po4 1,42 g/L

& KCl 8,3 g/L
b. Larutan B dibuat dengan Na H2Po4 1,38
g/L dan NaCl 8,5 g/L

Larutan A dan B

a. Larutan A sebanyak 280 m L dicampurkan

dengan larutan B sebanyak 72 mL
b. Ph dicek dengan nilai Ph = 7,2

PBS
4. Penyiapan suspensi sel darah merah sapi 2% (SDMS) 2% v/v

Darah Sapi

a. Darah sapditampung dalam tabung eppendorf

bersih dankering yang berisi 1 mg serbuk
EDTA seba gai antikoagulan
b. Gumpalan darah dipisahkan dari plasmanya
dengan car a disentrifugasi 1500 rpm
c. Gumpalan darah dicuci dengan PBS
(Phosphat Buffered Saline) dengan cara
membolak-balikkan tabung
d. Pencucian dilakukan paling sedikit 3 kali, lalu
dibuang PB S

SDMS 100%

PBS ditambahkan dengan volume sama

banyak, hingg diperoleh SDMS 50%

SDMS 50%

SDMS 50% sebanyak 0,4 mL statis

diencerkan de ngan 9,6 mL PBS

SDMS 2%
 5. Pemilihan hewan uji dan penyiapan hewan uji

Mencit (Mus
musculus)
a. Mencit sehat dan
aktivitas normal dipilih
dengan bobot sekitar
25-30 g
disiapk masing- 2
b. an
Hewan masing
uji setiap
kelompok
ekor

Kelomp Kelomp Kelomp Kelomp Kelomp Kelomp

ok1 ok2 ok3 ok4 ok5 ok6
Diberi Diberi Diberi Diberi Diberi Diberi
perlakuan perlakuan perlakuan perlakuan perlakuan perlakuan
infusa infusa infusa infusa stimuno aquadest
5% 10% 15% 20% sebanyak sebanyak
sebanyak sebanyak sebanyak sebanyak 1 mL 1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

a. Perlakuan diberikan sesuai dengan

kelompk selama 6 hari secara oral
b. Hewan uji diimunisasi pada hari ke-7
dengan 0,1ml SDMS 2% secara i.p.
c. Pengambilan darah dilakukan pada hari
ke-5 setelah imunisasi, darah diambil
secara i.c., kemudian darah dibiarkan
membeku/menggumpal pada suhu kamar
1-2 jam
d. Darah disentrifugasi dengan kecepatan
3000 rpm selama 10 menit
e. Serum (Supernatan) diambil

Serum
 Serum

a. Hemaglutinasi dilakukan,
serum diencerkan secara double
dilution dengan PBS sebanyak
50µ untuk setiap sumur
mikrotitrasi
b. SDMS 2% sebanyak 50µ
statisti v/v ditambahkan, diaduk
rata (digoyang-goyangkan)
selama 5 menit
c. SDMS 2% diinkubasi pada
suhu 37o selama 60 menit dan
didiamkan semalam pada suhu
kamar
Pengamatan

Pengamatan dilakukan dilihat dari

pengenceran tertinggi dilakukan dari
serum darah mencit yang masih
dapat mengaglutinasi sel darah
merah sapi (SDMS)

Hasil Pengamatan
E. Perhitungan
1. Pengenceran Konsentrasi
Diketahui : Larutan stok = 100 mL
Ditanya : Volume pengenceran setiap konsentrasi?
Jawab :
a. Konsentrasi infusa 20% dalam 5 mL
M1 x V1 = M2 x V2
20% x 5 mL = 50% x V2
100 = 50% x V2
100%
V2 =
50%
= 2 mL
Ad air = 5 ml -2 mL
= 3 mL

b. Konsentrasi infusa 15% dalam 5 mL

M1 x V1 = M2 x V2
15% x 5 mL = 50% x V2
75 = 50% x V2
75%
V2 =
50%
= 1,5 mL
Ad air = 5 mL – 1,5 mL
= 3,5 mL

c. Konsentrasi infusa 10% dalam 5 mL

M1 x V1 = M2 x V2
10% x 5 mL = 50% x V2
50 = 50% x V2
50%
V2 =
50%
= 1 mL
 Ad air = 5 mL -1 mL
= 4 mL

d. Konsentrasi infusa 5% dalam 5 mL

M1 x V1 = M2 x V2
5% x 5 mL = 50% x V2
25 = 50% x V2
25%
V2 =
50%
= 0,5 mL
Ad air = 5 mL – 0,5 mL
= 4,5 mL

2. Pembuatan Kontrol Positif

Dik : Dosis lazim stimuno sirup = 50 mg Phyllanthus niruri dalam 10 mL
a. Konversi dosis = 50 mL x 0,0026 x 20g/20g = 0,13 mg

b. Volume yang digunakan

=
10 =
50 0,13
10 0,13
x =
50

x = 0,026 mL

c. Larutan stok
0,026 =
1 100

= 0,026 100 1
x

x = 2,6 mL
3. Pembuatan Phosphat Buffered Saline (PBS)
a. Larutan A
KH2PO4
1,42
= 1000
280
1,42 280
x =
1000

x = 0,3976 gram

KCl
8,3 1000
=
280
8,3 280
x =
1000

x = 2,324 gram

b. Larutan B
NaH2PO4
1,38
= 1000
720
1,38 720
x =
1000

x = 0,9936 gram

NaCl
8,5
= 1000
720
8,5 280
x =
1000

x = 6,12 gram
4. Penyiapan Suspensi Sel Darah Merah Sapi (SDMS) 2% v/v
SDMD 100% → ditambahkan PBS sama banyak 1 : 1
1 × 100% = 50% → diperoleh SDMD 50%
2

Pengenceran SDMD 2%
M1 x V1 = M2 xV2
50% × x = 2% × 10 mL
x = 0,4 mL
Jadi, diambil 0,4 mL SDMD 50% dan ditambahkan 9,6 mL larutan
PBS didapatkan SDMD 2% dalam 10 mL.
F. Pretest
1. Jelaskan tujuan dan prinsip percobaan yang akan dilakukan?
Jawab :
Tujuan dari percobaan yang akan dilakukan adalah untuk memperoleh data
aktivitas immunoglobulin M (IgM) sampel uji dan prinsip dari percobaan
yang akan dilakukan adalah mengamati pengenceran tertinggi dari serum
darah mencit yang masih dapat mengaglutinasi sel darah merah domba.

2. Uraikan prosedur kerja praktikum dengan menggunakan skema kerja?

Jawab :
a. Pembuatan sampel uji

Daun Sirih Hijau (Piper betle L)

a. Daun sirih hijau dicuci bersih

b. Daun sirih hijau dirajang halus
c. Daun sirih hijau ditimbang sebanyak 100 g
d. Daun sirih hijau dipanaskan de ngan air
sebanyak 100 mL selama 15 men t hingga
suhu mencapai 90o

Infusa Daun Sirih Hijau (Piper betle L)

Pengenceran dilakukan untuk membuat

konsentrasi 5%, 10% 15% dan 20%
 b. Pembuatan kontrol positif

Stimuno

a. Sirup stimuno diambil sebanyak 2,6 mL

b. Sirup sti muno dilarutkan dlam aquadest
sebanyak1
00 mL

Larutan Stimuno

c. Penyiapan phospat buffered saline (PBS)

NaH2Po4 & NaCl

a. Larutan A dibuat dengan KH2Po4 1,42 g/L

& KCl 8,3 g/L
b. Larutan B dibuat dengan Na H2Po4 1,38
g/L dan NaCl 8,5 g/L

Larutan A dan B

a. Larutan A sebanyak 280 m L dicampurkan

dengan larutan B sebanyak 72 mL
b. Ph dicek dengan nilai Ph = 7,2

PBS
d. Penyiapan suspensi sel darah merah sapi 2% (SDMS) 2% v/v

Darah Sapi

a. Darah sapditampung dalam tabung eppendorf

bersih dankering yang berisi 1 mg serbuk
EDTA sebagai antikoagulan
b. Gumpalan darah dipisahkan dari plasmanya
dengan car a disentrifugasi 1500 rpm
c. Gumpalan darah dicuci dengan PBS
(Phosphat Buffered Saline) dengan cara
membolak-balikkan tabung
d. Pencucian dilakukan paling sedikit 3 kali, lalu
dibuang PB S

SDMS 100%

PBS ditambahkan dengan volume sama

banyak, hingg diperoleh SDMS 50%

SDMS 50%

SDMS 50% sebanyak 0,4 mL statis

diencerkan de ngan 9,6 mL PBS

SDMS 2%
 e. Pemilihan hewan uji dan penyiapan hewan uji

Mencit (Mus
musculus)
a. Mencit sehat dan
aktivitas normal dipilih
dengan bobot sekitar
25-30 g
disiapk masing- 2
b. an
Hewan masing
uji setiap
kelompok
ekor

Kelomp Kelomp Kelomp Kelomp Kelomp Kelomp

ok1 ok2 ok3 ok4 ok5 ok6
Diberi Diberi Diberi Diberi Diberi Diberi
perlakuan perlakuan perlakuan perlakuan perlakuan perlakuan
infusa infusa infusa infusa stimuno aquadest
5% 10% 15% 20% sebanyak sebanyak
sebanyak sebanyak sebanyak sebanyak 1 mL 1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

a. Perlakuan diberikan sesuai dengan

kelompk selama 6 hari secara oral
b. Hewan uji diimunisasi pada hari ke-7
dengan 0,1ml SDMS 2% secara i.p.
c. Pengambilan darah dilakukan pada
hari ke-5 setelah imunisasi, darah
diambil secara i.c., kemudian darah
dibiarkan membeku/menggumpal
pada suhu kamar 1-2 jam
d. Darah disentrifugasi dengan
kecepatan 3000 rpm selama 10 menit
e. Serum (Supernatan) diambil

Serum
 Serum

a. Hemaglutinasi dilakukan,
serum diencerkan secara double
dilution dengan PBS sebanyak
50µ untuk setiap sumur
mikrotitrasi
b. SDMS 2% sebanyak 50µ
statisti v/v ditambahkan, diaduk
rata (digoyang-goyangkan)
selama 5 menit
c. SDMS 2% diinkubasi pada
suhu 37o selama 60 menit dan
didiamkan semalam pada suhu
kamar
Pengamatan

Pengamatan dilakukan dilihat dari

pengenceran tertinggi dilakukan dari
serum darah mencit yang masih
dapat mengaglutinasi sel darah
merah sapi (SDMS)

Hasil Pengamatan
3. Buatlah perhitungan pembuatan konsentrasi yang digunakan dalam
praktikum?
Jawab:
1. Pengenceran Konsentrasi
Diketahui : Larutan stok = 100 mL
Ditanya : Volume pengenceran setiap konsentrasi?
Jawab :
a. Konsentrasi infusa 20% dalam 5 mL
M1 x V1 = M2 x V2
20% x 5 mL = 50% x V2
100 = 50% x V2
100%
V2 =
50%
= 2 mL
Ad air = 5 mL -2 mL
= 3 mL

b. Konsentrasi infusa 15% dalam 5 mL

M1 x V1 = M2 x V 2
15% x 5 mL = 50% x V2
75 = 50% x V2
75%
V2 =
50%
= 1,5 mL
Ad air = 5 mL – 1,5 mL
= 3,5 mL

c. Konsentrasi infusa 10% dalam 5 mL

M1 x V1 = M2 x V 2
10% x 5 mL = 50% x V2
50 = 50% x V2
 50%
V2 =
50%
= 1 mL
Ad air = 5 mL -1 mL
= 4 mL

d. Konsentrasi infusa 5% dalam 5 mL

M1 x V1 = M2 x V2
5% x 5 mL = 50% x V2
25 = 50% x V2
25%
V2 =
50%
= 0,5 mL
Ad air = 5 mL – 0,5 mL
= 4,5 mL

4. Apa solusi yang dilakukan bilamana ekstrak yang akan diuji tidak larut
aquadest?
Jawab:
Jika terdapat ekstrak uji yang tidak dapat larut dalam aquades maka cara
yang harus dilakukan adalah menggunakan pelarut lain yang bisa
melarutkan ekstrak uji yang digunakan. Pelraut aquades sendiri merupakan
pelarut polar jika ekstra uji yang digunakan tidak dapat larut dalam
aquades maka sampel uji yang digunakan memiliki sifat non polar
sehingga pelarut yang dapat digunakan adalah pelarut non polar seperti
eter, kloroform, dan n-heksana. Jika dibuat dalam suspensi, maka harus
menggunakan pelarut dengan kepolaran yang sama dan harus
menggunakan pelarut aquadest agar larutan yang dibuat tidak
terkontaminasi dengan matriks lain yang dapat bereaksi dengan larutan
sampel sehingga bisa menyebabkan konsentrasi larutan berubah (Leksono
dkk., 2018).
5. Berapa yang harus ditimbang bila akan dibuat larutan stimuno 10% dalam
50 mL dengan berat isi kapsul stimuno 500 mg?
Jawab:
Dik : Larutan stimuno 10%
Volume 50 mL
Berat isi kapsul 500 mg
Dit : Jumlah kapsul yang digunakan ?
Jawab :
10
Larutan stimuno 10% = x 50 ml
100

= 5 g → 5000 mg
1 Kapsul = 500 mg

5000
Jumlah kapsul yang digunakan =
500

= 10 kapsul

Jadi, kapsul yang harus ditimbang untuk membuat larutan stimuno 10%
dalam 50 ml dengan berat isi kapsul stimuno 500 mg adalah 10 kapsul.
G. Hasil Pengamatan
1. Tabel Hasil Pengamatan
No. Kelompok Gambar Pengamatan

1.

Kontrol positif
(Stimuno)

2.
Kontrol negatif
(Aquadest)

3.
Kontrol Negatif
(Aquadest)

4.

Kontrol Uji Infusa 10%

5.

Kontrol Uji Infusa 20%

2. Tabel Data Pengamatan
Kelompok Angka Titer Data Titer ∑μ
Pengenceran
Positif 1⁄ 4,612 4,612
64

Negatif 1⁄ 4,612 4,612

64

Negatif 1⁄ 4,612 4,612

64
Infusa 10% 1⁄ 2,806 2,806
8
Infusa 20% 1⁄ 2,806 2,806
8
H. Pembahasan
Percobaan praktikum kali ini membahas tentang Pengujian Aktivitas
Imunoglobulin M (IgM) Ekstrak Bahan Alam dengan tujuan untuk
memperoleh data aktivitas imunoglobulin M (IgM) sampel uji dengan
mengamati pengenceran tertinggi dari serum darah mencit yang masih dapat
mengaglutinasi sel darah merah domba. Alat yang digunakan ada batang
pengaduk, centrifuge, centrifuge tube, corong kaca, eppendorf tube, gelas
kimia 50 mL, gelas kimia 100 mL, gelas ukur 10 m, gunting, hot plate, jarum
suntik, keranjang, mikropipet 1-100 μm, panci, pipet tetes, pipet ukur 10 mL,
plat tetes, pro pipet, spuit 1 mL, stopwatch, timbangan analitik, timbangan
hewan dan yellow tip. Bahan yang akan digunakan ada alcohol Swab, aquades,
Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA), etiket, infusa Daun Sirih Hijau
(Piper betle L.), mencit (Mus musculus), Phosphate Buffered Saline (PBS),
plastic wrap, sel Darah Merah Sapi (SDMS) 2% dan stimuno.
Prosedur kerja yang dilakukan pada percobaan ini yang pertama adalah
pembuatan infusa. Pertama, simplisia daun sirih yang telah dikumpulkan dicuci
bersih, dipotong-potong menjadi kecil, lalu dikeringkan. Dihaluskan
menggunakan blender dan diayak hingga diperoleh serbuk halus lalu dibuat
infusa daun sirih dengan pengenceran konsentrasi 5%, 10%, 15%. Kedua,
pembuatan kontrol positif. Tujuan menggunakan kontrol positif adalah untuk
mengetahui eksperimen yang dilakukan sudah tepat dan menghasilkan efek
positif pada variabel tergantung. Kontrol positif yang digunakan dalam
percobaan ini adalah larutan stimuno. Diambil sirup stimuno sebanyak 2,6 mL
lalu dilarutkan dalam aquades sebanyak 100 mL lalu aduk hingga homogen.
Ketiga, pembuatan Larutan PBS (Phosphate Buffered Saline). Tujuan
ditambahkan PBS adalah untuk mengatur pH dan kesimbangan osmolaritas sel
dengan menyediakan air dan ion organik penting. Ditimbang terlebih dahulu
bahan yang diperlukan, untuk larutan A dibuat dengan KH 2PO4 1,42 g/L dan
KCl 8,3 g/L sedangkan larutan B dibuat dengan NaH2PO4 1,38 g/L dan NaCl
8,5 g/L. Setelah ditimbang, diambil larutan A sebanyak 280 mL lalu
dicampurkan dengan larutan B sebanyak 720 mL kemudian dicek nilai pH nya.
Keempat, pembuatan SDMS dan pengujian Hemaglutinasi. Disiapkan tabung
eppendorf bersih dan kering yang sudah berisi EDTA, dimana EDTA disini
berfungsi sebagai antikoagulan, setelah itu tabung yang berisi SDMS
disentrifugasi dengan kecepatan 15000 rpm. Tujuan dilakukan sentrifugasi
adalah untuk memisahkan gumpalan darah dari plasmanya untuk memperoleh
serum. Serum yang diperoleh dicuci dengan PBS, pencucian dilakukan paling
sedikit 3 kali. Tujuan dicuci sebanyak 3 kali adalah untuk menghilangkan
partikel yang tidak difagosit. Penambahan PBS ditambahkan dengan volume
sama banyak hingga diperoleh SDMS 50%, kemudian setelah didapatkan
SDMS 50% diambil sebanyak 0,4 mL dan diencerkan lagi dengan 9,6 mL PBS.
Pemilihan hewan uji, dipilih mencit jantan sehat dan aktivitas normal dengan
bobot badan statisti 25-30 gram alasan digunakan mencit jantan yaitu karena
mencit jantan tidak mengalami siklus estrus sehingga sampel menjadihomogen,
mudah dikendalikan dan hasilnya diharapkan akan lebih akurat(Thahir, 2019).
Penyiapan hewan uji, masing-masing setiap kelompokperlakuan disiapkan 2
ekor mencit, lalu diberi perlakuan pada masing-masingkelompok. Kelompok
1 diberi perlakuan dengan infusa 5%, kelompok 2dengan infusa 10%,
kelompok 3 dengan infusa 15%, kelompok 4 denganinfusa 20%, kelompok 5
diberi perlakuan dengan larutan stimuno sebanyak 1mL dan kelompok 6
diberi perlakuan aquades sebanyak 1 mL untuk melihatada atau tidaknya
aktivitas pada pelarut. Masing-masing kelompok diberiperlakuan selama 6
hari berturut-turut secara oral, di hari ke 7 semua kelompokperlakuan
diimunisasidengan SDMS 2% sebanyak 0,1 mL secara
intraperitoneal. Selesai di imunisasi, darah diambil secara intrakardial,
kemudian dibiarkan menggumpal pada suhu kamar selama1-2 jam.
Disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm dan diambil
serumnya. Serum didapatkan, dilakukan uji hemaglutinasi yaitu serum
diencerkan secara double dilution dengan PBS sebanyak 50 μL pada setiap
sumur mikrotitrasi kemudian ditambahkan SDMS 2% sebanyak 50 μL, lalu
dihomogenkan selama 5 menit. Setelah itu diinkubasi pada suhu 37OC selama
60 menit dan didiamkan semalam pada suhu kamar. Tujuan diinkubasi pada
suhu 37OC adalah karena suhu tersebut merupakan suhu normal pada manusia.
Setelah proses inkubasi selesai, dilakukan pengamatan, yaitu parameter yang
dilihat adalah pengenceran tertinggi dari serum darah mencit yang masih dapat
mengaglutinasi sel darah merah sapi (SDMS), dicatat dan diperoleh hasil
pengamatan.
Tanaman sirih hijau (Piper betle L.) merupakan salah satu jenis tumbuhan
yang banyak dimanfaatkan untuk pengobatan. Daun Sirih mengandung
berbagai senyawa kimia aktif yang dipengaruhi oleh area geografis dan
lingkungan. Bahan dari sirih yang banyak digunakan yaitu bagian daunnya
karena memiliki kandungan minyak atsiri sebanyak 4,2% dan sebagian besar
komponennya terdiri dari betephenol yang berperan sebagai agen antibakteri.
Daun sirih hijau memiliki beberapa kandungan lainnya seperti polyphenol dan
anthocyanin sebagai antioksidan. Antioksidan ini bertindak sebagai penangkal
radikal bebas yang baik untuk meningkatkan daya tahan tubuh (Setyani dkk.,
2016).
Sistem imun adalah sistem yang membentuk kemampuan tubuh untuk
melawan bibit penyakit dengan menolak berbagai benda asing yang masuk ke
tubuh agar terhindar dari penyakit. Sistem imun mencakupi semua struktur dan
proses yang menyediakan pertahanan tubuh untuk melawan bibit penyakit dan
dapat dikelompokkan menjadi dua kategori yaitu, sistem imun bawaan (innate)
yang bersifat non-spesifik dan sistem imun adaptif yang bersifat spesifik.
Innate immunity sendiri mempunyai peran terdepan dalam menghambat
masuknya dan mengeluarkan patogen yang telah berhasil masuk dalam
jaringan dengan cepat. Adaptive immunity membutuhkan waktu yang relatif
lama dan sampai berhari-hari untuk bekerja melawan patogen, namun adaptive
immunity lebih efektif dalam menangkal virus. Adaptive immunity mempunyai
karakteristik yang khas, karena akan baru terbentuk setelah adanya stimulasi
dari patogen atau setelah terjadinya infeksi virus. Jenis imunitas ini mempunyai
kemampuan memori imunologis yaitu dapat mengenali dan mengingat patogen
yang pertama kali masuk ke dalam tubuh (Adijaya & Bakti, 2021).
 Imunoglobulin adalah substansi dari molekul dalam serum yang dapat
menetralkan serta menghancurkan antigen atau mikroorganisme penyebab
infeksi. Molekul akan dibentuk sel B membentuk reseptor permukaan sebagai
antigen dan sebagai antibodi yang disekresikan ke dalam cairan ekstraseluler.
Antibodi yang dibentuk sebagai reaksi terhadap jenis antigen memiliki susunan
asam amino berbeda dengan antibodi yang dibentuk dengan antigen dari
masing-masing penyebab hanya dapat berikatan dengan antigen yang relevan
atau yang spesifiknya saja. Antibodi atau imunoglobulin adalah golongan
protein yang dibentuk sel plasma (proliferasi sel B) setelah terjadi kontak
dengan antigen pada imunitas humoral (Hilma dkk., 2022).
Terdapat lima jenis imunoglobulin, yaitu Immunoglobulin G merupakan
komponen utama (terbanyak) dari total imunoglobulin serum. IgG dapat
mengaktifkan komplemen meningkatkan pertahanan badan melalui opsonisasi
dan reaksi inflamasi (peradangan). Immunoglobulin A ditemukan dalam
jumlah sedikit di dalam serum, tetapi kadarnya dalam cairan sekresi saluran
napas, saluran cerna, saluran kemih, air mata, keringat, ludah, dan kolostrum
lebih tinggi sebagai IgA sekretori. Imunoglobulin M merupakan Ig terbesar.
Kebanyakan sel B mengandung IgM pada permukaannya sebagai reseptor
antigen. IgM dibentuk paling dahulu pada respons imun primer tetapi tidak
berlangsung lama, karena itu kadar IgM yang tinggi merupakan tanda adanya
infeksi dini. Imunoglobulin D ditemukan dengan kadar yang sangat rendah
dalam darah. IgD tidak mengikat komplemen, mempunyai aktivitas antibodi
terhadap antigen berbagai makanan dan autoantigen seperti komponen nukleus.
Immunoglobulin E ditemukan dalam serum dalam jumlah yang sangat sedikit.
Antibodi ini dengan mudah diikat oleh sel mast, basofil, eosinofil, makrofag,
dan trombosit yang pada permukaannya memiliki reseptor untuk fraksi Fc dari
IgE (Hilma dkk., 2022)..
Imunomodulator adalah substansi biologis atau sintetis yang dapat
menstimulasi, mensupresi atau memodulasi berbagai komponen dalam sistem
imun baik sistem imun bawaan maupun sistem imun adaptif. Obat sintesis atau
bahan sintetis obat, sumber immunomodulator dapat berasal dari bahan alami
atau herbal (Ira, 2020). Imunostimulan berfungsi untuk meningkatkan fungsi
dan aktivitas sistem imun. Imunosupresan berfungsi untuk menghambat atau
menekan aktivitas sistem imun (Maulana dkk., 2018).
Jenis golongan obat sistem imun yang biasa digunakan adalah obat
golongan antiinflamasi nonsteroid seperti (ketoprofen, aspirin, ibuprofen, asam
mefenamat, dan lain-lain), obat-obat imunosupresan (azatioprin, klorambusi,
sitoksan, dan lain-lain), obat-obatan untuk imunostimulan (isoprinosin,
levamisol arginin, dan lain-lain) (Sukmayadi dkk., 2014). Mekanisme kerja
obat stimuno disini adalah obat stimuno mengandung senyawa murni yaitu
flavonoid yang memiliki efek fagositosis yang berfungsi menghilangkan
patogen. Obat stimuno terbukti sebagai imunomodulator, dengan cara
memberikan rangsangan kepada reseptor sel imun serta mengirimkan sinyal
intraseluler pada reseptor sel sehingga dapat meningkatkan kerja sel imun lebih
baik (Wahyuni dkk., 2019).
Prinsip kerja dari pengujian aktivitas imunoglobulin ini adalah mengamati
pengenceran tertinggi dari serum darah mencit yang masih dapat
mengaglutinasi sel darah domba dari hewan yang telah di induksi dengan
kontrol positif dan kontrol uji selama 6 hari berturut-turut kemudian pada hari
ke 7 di berikan imunisasi SDMD 2% (Effendi & Widiastuti, 2014). Fungsi dari
penambahan EDTA pada tabung eppendorf adalah untuk mencegah
penggumpalan darah dengan cara mengikat ion kalsium atau menghambat
pembentukan thrombin yang diperlukan untuk mengkonversi fibrinogen
menjadi fibrin dalam proses pembekuan. Sel Darah Merah Domba digunakan
karena sel darah merah domba merupakan antigen polivalen, yang merupakan
protein dengan determinan pontesial yang lebih besar dibandingkan dengan
monovalen. Sel darah merah domba bersifat tidak larut sehingga sering
digunakan sebagai antigen dan diinjeksikan pada hewan coba, karena semakin
asing antigen yang digunakan semakin efektif menimbulkan respon imun.
Alasan menggunakan larutan PBS (Phosphate Buffered Saline) disini adalah
untuk mengatur pH dan keseimbangan osmolaritas sel dengan menyediakan air
dan ion organik penting (Effendi & Widiastuti, 2014).
 Pengujian immunoglobulin dengan metode hemaglutinasi yaitu sel darah
merah di aglutinasi oleh antibodi yang menyerang antigen yang telah
digabungkan secara kimiawi pada permukaan sel darah merah. Sel darah merah
disini merupakan indikator nyata dari interaksi antigen dan antibodi. Parameter
pengujian aktivitas imunoglobulin M (IgM) menggunakan metode
hemaglutinasi berdasarkan titer imunoglobulin M (IgM) yaitu dengan
memperoleh data pengenceran tertinggi dari serum darah mencit yang dapat
mengaglutinasi SDMS (Rahman dkk., 2021). Prinsip percobaan ini adalah
mengamati serum darah yang masih dapat mengaglutinasi sel darah merah sapi
(SDMS) 2% yang memperlihatkan bahwa pemberian sampel uji memberikan
efek terhadap peningkatan efektivitas IgM (Effendi & Widiastuti, 2014).
Rentang waktu pengamatan untuk pengujian IgG dan IgM adalah untuk
lama waktu induksi larutan uji dan kontrol dilakukan selama 5-7 hari. Lalu,
imunisasi SDMD dilakukan pada hari terakhir induksi perlakuan. Sedangkan
untuk pengamatan aktivitas IgG dan IgM, setelah darah mencit diambil secara
intrakardial, darah didiamkan selama 1-2 jam lalu disentrifuge dan diambil
supernatannya lalu diberi perlakuan lanjutan sesuai tahapan pengujian dan
diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C (Effendi & Widiastuti, 2014).
Alasan mengenai banyaknya mencit mati setelah diimunisasi yaitu bisa
disebabkan oleh beberapa faktor misalnya dari salah penyuntikan, karena rute
pemberiannya melalui intraperitoneal bisa saja mengenai organ dalam mencit
sehingga bisa mati. Alasan lain juga bisa dikarenakan antigen yang kita berikan
tidak bisa diterima antibodi mencit. Alasan lainnya bisa juga dikarenakan
alergi. Sama halnya seperti manusia, ketika diimunisasi terdapat kasus bisa
meninggal. Hal ini bisa dikarenakan adanya alergi hebat sehingga
menimbulkan syok dan bisa menyebabkan kematian. Biasanya jika mengalami
alergi yang hebat maka akan kolaps karena pembuluh darah di tubuh melebar
secara mendadak sehingga suplai darah berkurang, dan biasanya terjadi kejang-
kejang terlebih dahulu. Ini juga bisa menjadi alasan mengenai banyaknya
mencit mengalami kematian setelah diimunisasi (Novita, 2015).
 Antibodi umum yang terbentuk pada mencit yaitu karena adanya respon
imun yang terjadi dari sistem imun non spesifik terhadap antigen untuk
melindungi dan mempertahankan tubuh. Prinsipnya jika sistem imun bekerja
optimal, maka tidak akan mudah terkena penyakit, sistem keseimbangan tubuh
juga akan normal. Umumnya sistem imun terdiri atas sistem imun nonspesifik
(innate) dan spesifik (adaptive). Sistem imun nonspesifik bersifat tidak
spesifik, tetapi aktivitas sistem imunnya terjadi lebih cepat karena tidak
melibatkan sel memori, sedangkan pada sistem imun spesifik akan dapat
mengenali patogen atau mitogen asing yang pernah terpapar sebelumnya
sehingga dapat memberikan respon imun yang lebih baik karena melibatkan sel
memori. Sistem imun spesifik dan nonspesifik, keduanya masing-masing
memiliki dua komponen, yaitu imunitas humoral dan imunitas seluler. Dalam
sistem imun nonspesifik seluler terdapat keterlibatan sistem makrofag-monosit,
sedangkan pada sistem humoral melibatkan aktivasi sistem komplemen. Sistem
imun spesifik seluler terdiri dari sel limfosit T dan sistem imun spesifik
humoral melibatkan sel limfosit B. Kedua sistem imun tubuh (spesifik dan non
spesifik) tersebut bekerja sama dalam mempertahankan keseimbangan tubuh
(Erniati & Ezraneti, 2020).
Pengujian terhadap serum darah mencit diuji dengan menambahkan antigen
yang sama dengan antigen yang diinjeksikan yaitu sel darah merah sapi
(SDMS 2%). Interaksi antara antigen dengan antibodi menyebabkan terjadinya
reaksi sekunder yaitu berupa aglutinasi atau presipitasi sebab antigen
merupakan partikel-partikel kecil yang tidak larut. Gumpalan yang terbentuk
antara antigen dan antiserum spesifik akan bersatu dan akhirnya mengendap
sebagai gumpalan-gumpalan besar dan mudah terlihat dengan cairan di atasnya
tetap jernih. Karena umumnya antibodi memiliki lebih dari satu reseptor
pengikat antigen sehingga antibodi bereaksi dengan molekul antigen lain yang
mungkin sudah berikatan dengan salah satu molekul antibodi dan terbentuklah
gumpalan. Reaksi aglutinasi baru dapat terjadi bila rasio antara antigen dan
antibodi seimbang. Sehingga terbentuk zona ekuivalen, dibantu oleh inkubasi
suhu 37°C dan oleh gerakan yang menambah kontak antigen dan antibodi
(misalnya mengocok, mengaduk dan memutar) serta berkumpulnya gumpalan
memerlukan garam-garam yang berasal dari PBS dengan pH 7,2 yang
digunakan (Indrisari dkk., 2017).
Respon pembentukan antibodi dinyatakan sebagai titer antibodi primer dan
sekunder. Titer antibodi primer merupakan gambaran jumlah IgM yang
terbentuk yang merupakan awal respon imunitas primer. IgM ini juga
merupakan imunoglobulin yang pertama diproduksi. Apabila antigen yang
sama masuk ke dalam tubuh, maka akan meningkatkan kadar antibodi dalam
darah dan mencapai kadar maksimum yang jauh lebih tinggi dibanding repson
awal/primer. Antibodi sekunder merupakan gambaran dari sel memori B yang
akan diaktifkan apabila ada antigen yang sama masuk ke dalam tubuh kembali.
Respon sekunder ini ditandai dengan adanya respon yang lebih cepat serta
lebih banyak dalam produksi antibodi, karena adanya ekspansi sel memori
akibat paparan antigen yang sama (Puspitaningrum dkk., 2017).
Serum adalah bagian cair darah yang tidak mengandung sel-sel darah dan
faktor-faktor pembekuan darah sedangkan plasma adalah bagian cair dari darah
yang tidak mengandung sel-sel darah tetapi masih mengandung faktor-faktor
pembekuan darah. Alasan mengapa pada mencit kita mengambil serumnya
sedangkan SDMD diambil bagian endapanya, adalah karena pengujian ini
merupakan uji aktivitas IgM dan pengertian imunoglobulin merupakan
substansi molekul yang terdapat dalam serum berfungsi untuk menetralkan dan
menghancurkan antigen atau mikroorganisme penyebab infeksi maka
digunakanlah serum mencit untuk pengujian ini. Darah terdiri atas 55%
komponen cair yaitu plasma dan 45% komponen padat yaitu sel-sel darah. Sel-
sel darah merah dapat dipisahkan dari plasma dengan gaya sentrifugal dengan
prinsip semakin berat partikel maka akan semakin mengendap kedasar
(Handayani dkk, 2022). Dan juga karena yang digunakan sebagai antigen untuk
induksi produksi antibodi pada penelitian ini adalah sel darah merah domba
(SDMD) maka yang diambil adalah endapan yang merupakan bagian dari sel
darah merah (Effendi & Harti, 2014).
 Dari data yang telah diberikan pengamatan dengan melihat aglutinasi yaitu
pengenceran tertinggi dari serum darah mencit yang masih memberikan reaksi
aglutinasi positif. Aglutinasi terjadi bila antigen yang berbentuk partikel
direaksikan dengan antibodi spesifik. Antibodi tersebut disebut spesifik jika
hanya bereaksi dengan antigen yang merangsang produksinya. Gumpalan yang
terbentuk antara antigen dan antiserum spesifik akan bersatu dan akhirnya
mengendap sebagai gumpalan gumpalan besar dan mudah terlihat dengan
cairan di atasnya tetap jernih. Ini terjadi karena pada umumnya antibodi
memiliki lebih dari satu reseptor pengikat antigen sehingga antibodi bereaksi
dengan molekul antigen lain yang mungkin berikatan dengan salah satu
molekul antibodi dan terbentuklah gumpalan. Reaksi aglutinasi dibantu oleh
suhu yang tinggi (370C), oleh gerakan yang menambah kontak antigen dan
antibodi (misalnya mengocok, mengaduk dan memusing) dan dengan adanya
larutan yang mengandung garam (PBS) menyebabkan berkumpulnya
gumpalan. sehingga dapat disimpulkan bahwa darah mencit memiliki antibodi
apabila terbentuk gumpalan antara antigen dan antiserum spesifik yang
mengendap. Namun pada percobaan kali ini tidak terdapat gumpalan yang
terbentuk.
Hasil pengujian yang telah dilakukan, dapat diambil kesimpulan bahwa uji
hemaglutinasi yang telah dilakukan menggunakan sampel uji infusa daun sirih
(Piper betle L.) dengan konsentrasi 5%, 10%, 15%, dan 20% dengan kontrol
positif stimuno dan kontrol negatif aquades. Nilai titer yang didapatkan yaitu
1/64 (kontrol positif), 1/64 (kontrol negatif), 1/8 (infusa 10%), 1/8 (infusa
20%). Hasil pengamatan pengujian menunjukkan bahwa tidak terjadi
penggumpalan pada sampel uji baik dari konsentrasi pengenceran tertinggi dan
terendah, hal ini bisa disebabkan oleh tidak terbentuknya antibodi pada darah
mencit, atau sampel uji yang digunakan tidak bekerja dengan baik.
I. Postest
1. Uraikan cara kerja yang anda lakukan pada pengujian aktivitas
immunoglobulin?
Jawab:
Prosedur kerja yang dilakukan yang pertama adalah pembuatan infusa.
Pertama, simplisia daun sirih yang telah dikumpulkan dicuci bersih,
dipotong-potong menjadi kecil, lalu dikeringkan. Setelah kering daun
sirih dihaluskan menggunakan blender dan diayak hingga diperoleh
serbuk halus lalu dibuat infusa daun sirih dengan pengenceran
konsentrasi 5%, 10%, 15%. Kedua, pembuatan kontrol positif. Tujuan
menggunakan kontrol positif adalah untuk mengetahui eksperimen
yang dilakukan sudah tepat dan menghasilkan efek positif pada
variabel tergantung. Kontrol positif yang digunakan dalam percobaan
ini adalah larutan stimuno. Diambil sirup stimuno sebanyak 2,6 mL
lalu dilarutkan dalam aquades sebanyak 100 mL lalu aduk hingga
homogen. Ketiga, pembuatan Larutan PBS (Phosphate Buffered
Saline). Tujuan ditambahkan PBS adalah untuk mengatur pH dan
kesimbangan osmolaritas sel dengan menyediakan air dan ion organik
penting. Ditimbang terlebih dahulu KH2PO4, KCl, NaH2PO4 dan NaCl,
untuk larutan A dibuat dengan KH2PO41,42 g/L dan KCl 8,3 g/L
sedangkan larutan B dibuat dengan NaH2PO4 1,38 g/L dan NaCl 8,5
g/L. Setelah ditimbang, diambil larutan A sebanyak 280 mL lalu
dicampurkan dengan larutan B sebanyak 720 mL kemudian dicek nilai
pH nya. Keempat, pembuatan SDMS dan pengujian Hemaglutinasi.
Disiapkan tabung eppendorf bersih dan kering yang sudah berisi
EDTA, dimana EDTA disini berfungsi sebagai antikoagulan, setelah
itu tabung yang berisi SDMS disentrifugasi dengan kecepatan 15000
rpm. Tujuan dilakukan sentrifugasi adalah untuk memisahkan
gumpalan darah dari plasmanya untuk memperoleh serum.
Selanjutnya, dicuci dengan PBS, pencucian dilakukan paling sedikit 3
kali. Tujuan dicuci sebanyak 3 kali adalah untuk menghilangkan
partikel yang tidak difagosit. Penambahan PBS ditambahkan dengan
volume sama banyak hingga diperoleh SDMS 50%, kemudian setelah
didapatkan SDMS 50% diambil sebanyak 0,4 ml dan diencerkan lagi
dengan 9,6 ml PBS. Pemilihan hewan uji, dipilih mencit jantan sehat
dan aktivitas normal dengan bobot badan statisti 25-30 gram alasan
digunakan mencit jantan yaitu karena mencit jantan tidak mengalami
siklus estrus sehingga sampel menjadi homogen, mudah dikendalikan
dan hasilnya diharapkan akan lebih akurat (Thahir, 2019). Penyiapan
hewan uji, masing-masing setiap kelompok perlakuan disiapkan 2 ekor
mencit, lalu diberi perlakuan pada masing-masing kelompok.
Kelompok 1 diberi perlakuan dengan infusa 5%, kelompok 2 dengan
infusa 10%, kelompok 3 dengan infusa 15%, kelompok 4 dengan
infusa 20%, kelompok 5 diberi perlakuan dengan larutan stimuno
sebanyak 1 mL dan kelompok 6 diberi perlakuan aquades sebanyak 1
mL untuk melihat ada atau tidaknya aktivitas pada pelarut.
Selanjutnya, masing-masing kelompok diberi perlakuan selama 6 hari
berturut-turut secara oral, di hari ke 7 semua kelompok perlakuan
diimunisasi dengan SDMS 2% sebanyak 0,1 ml secara intraperitoneal.
Setelah imunisasi, darah diambil secara intrakardial, kemudian
dibiarkan menggumpal pada suhu kamar selama 1-2 jam. Kemudian
disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm dan
diambil serumnya. Setelah serum didapatkan, dilakukan uji
hemaglutinasi yaitu serum diencerkan secara double dilution dengan
PBS sebanyak 50 μL pada setiap sumur mikrotitrasi kemudian
ditambahkan SDMS 2% sebanyak 50 μL, lalu dihomogenkan selama 5
menit. Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit dan
didiamkan semalam pada suhu kamar. Tujuan diinkubasi pada suhu
37oC adalah karena suhu tersebut merupakan suhu normal pada
manusia. Setelah proses inkubasi selesai, dilakukan pengamatan, yaitu
parameter yang dilihat adalah pengenceran tertinggi dari serum darah
 mencit yang masih dapat mengaglutinasi sel darah merah sapi(SDMS),
dicatat dan diperoleh hasil pengamatan.

2. Uraikan kegunaan atau fungsi dari sentrifugasi, EDTA, Sel Darah

Merah Domba (SDMD), dan Phospat Buffered Saline (PBS)?
Jawab:
Kegunaan atau fungsi dari sentrifugasi, EDTA, Sel Darah Merah
Domba (SDMD), dan Phospat Buffered Saline (PBS) yaitu :
a. Sentrifugasi
Fungsi dilakukan sentrifugasi adalah untuk memisahkan
gumpalan darah dari plasmanya untuk memperoleh serum.
b. Penambahan EDTA
Fungsi penambahan EDTA disini adalah sebagai antikoagulan
yaitu mencegah terjadinya penggumpalan darah dengan cara
mengikat ion kalsium atau menghambat pembentukan trombin
yang diperlukan untuk mengkonversi fibrinogen menjadi fibrin
dalam proses pembekuan.
c. Sel Darah Merah Domba (SDMD)
Sel darah merah domba merupakan antigen polivalen, yang
merupakan protein dengan determinan potensial yang lebih
besar dibandingkan dengan monovalen. Sel darah merah
domba disini bersifat tidak larut sehingga sering digunakan
sebagai antigen dan diinjeksikan pada hewan coba, karena
semakin asing antigen yang digunakan semakin efektif
menimbulkan respon imun.
d. Phospat Buffered Saline (PBS)
Phosphate Buffered Saline (PBS) berfungsi untuk mengatur pH
dan keseimbangan osmolaritas sel dengan menyediakan air dan
ion organik penting.
(Effendi & Widiastuti, 2014)
3. Jelaskan perbedaan penyuntikan intraperitonial dan intrakardiak?
Jawab:
Perbedaan penyuntikan intraperitonial dan intrakardiak, yaitu :
a. Intraperitoneal
Intraperitoneal adalah obat yang disuntikan dalam rongga
peritoneum akan diabsorpsi cepat, sehingga reaksi obat akan
cepat terlihat.
b. Intakardiak
Intrakardiak adalah penyuntikan yang diberikan langsung ke
dalam otot jantung atau ventrikel, karena sudah tidak mampu
lagi diserap secara intravena.
(Lucia, 2016)

4. Uraikan fungsi teknik atau cara kerja yang digunakan setiap

percobaan:
a. Penyiapan sel darah merah domba (SDMD)
Darah domba ditampung dalam tabung bersih dan kering yang
berisi serbuk EDTA sebagai antikoagulan. Untuk 1 mL darah
domba, diperlukan 1 mg EDTA. Sel darah merah domba (SDMD)
dipisahkan dari plasmanya dengan disentrifugasi pada kecepatan
1500 rpm. Selanjutnya sel darah merah domba dicuci dengan
menambahkan PBS (Phosphat Buffered Saline) dalam jumlah
besar dan tabung berisi suspensi tersebut dibolak – balik beberapa
kali dan disentrifugasi kembali. Lakukan pencucian paling sedikit
3 kali. Setelah selesai, PBS dibuang dan diperoleh SDMD 100%.
Kemudian pada SDMD 100% tadi tambahkan PBS dengan volume
sama hingga diperoleh suspensi SDMD 50%. Siapkan antigen yang
akan digunakan dengan mengencerkan 0,4 mL suspensi SDMD
50% dengan 9,6 mL PBS sehingga diperoleh 10 mL suspensi
antigen (SDMD 2% v/v).
b. Penyiapan Phospate Buffered Saline (PBS)
Phospate Buffered Saline (PBS) disiapkan terlebih dahulu
membuat larutan A yaitu latutan KH2PO4 1,38 g/L dan KCl 8,3 g/L
dan larutan B NaH2PO4 1,42 g/L dan NaCl 8,5 g/L. Selanjutnya
280 mL larutan A ditambahkan pada 720 mL larutan B.

c. Penyiapan dan pemilihan hewan uji

Hewan uji yang digunakan adalah mencit jantan (Mus musculus)
yang sehat dan memiliki aktivitas normal, dengan bobot badan
statis 25-30 gram. Selanjutnya disiapkan hewan uji sebanyak 12
ekor mencit yang dibagi atas 4 kelompok yaitu kelompok uji,
kelompok positif, dan kelompok negatif.

d. Perlakuan hewan uji (kontrol positif dan negatif serta kontrol uji)
1) Kelompok kontrol positif
Mencit diberi larutan stimuno dengan volume 1 mL secara
oral setiap hari selama 6 hari. Kemudian di hari ketujuh
diimunisasi dengan SDMS 2% dengan volume 0,1 mL/ekor
secara intraperitonial. Selanjutnya pada hari kelima setelah
imunisasi, darah mencit diambil secara intrakardial.
2) Kelompok kontrol negatif
Mencit diberi larutan aquades dengan volume 1 mL secara
oral setiap hari selama 6 hari. Kemudian di hari ketujuh
diimunisasi dengan SDMS 2% dengan volume 0,1 mL/ekor
secara intraperitonial. Selanjutnya pada hari kelima setelah
imunisasi, darah mencit diambil secara intrakardial.
3) Kelompok kontrol uji
Mencit diberi larutan ekstrak daun sirih dengan seri
konsentrasi 5%, 10%, 15%, dan 20% dan untuk masing-
masing konsentrasi diberikan pada 2 mencit dengan volume 1
 mL secara oral setiap hari selama 6 hari. Kemudian di hari
ketujuh diimunisasi dengan SDMS 2% dengan volume 0,1
mL/ekor secara intraperitonial. Selanjutnya pada hari kelima
setelah imunisasi, darah mencit diambil secara intrakardial

e. Uji hemaglutinasi dalam pengujian aktivitas IgM pada hewan uji

1) Pengambilan Sampel Darah Hewan Uji
Pada hari ke -5 setelah imunisasi, darah diambil secara
intrakardial, kemudian dibiarkan membeku/menggumpal
pada suhu kamar selama 1-2 jam, selanjutnya disentrifugasi
dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit dan diambil
serumnya (supernatannya).
2) Uji Hemaglutinasi
Serum yang diperoleh selanjutnya diencerkan secara ‘double
dilution’: 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64 dengan PBS
sebanyak 50 µL untuk setiap sumur mikrotitrasi, selanjutnya
pada setiap sumur ditambahkan 50 µL statisti SDMD 2% v/v,
diaduk rata (digoyang-goyangkan) selama 5 menit.
Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37OC selama 60 menit dan
didiamkan semalam pada suhu kamar. Dilakukan pengamatan
pengenceran tertinggi dari serum darah mencit yang masih
dapat mengaglutinasi sel darah merah domba (SDMD).

5. Hitunglah angka titer dari masing-masing kelompok perlakuan (sesuai

tabel dalam modul yang telah disediakan)?
Jawab:
a. Kontrol uji infusa 10%
Angka titer = 1/8
Data titer pengenceran = [2 log (8) + 1] = 2, 208
 b. Kontrol uji infusa 20%
Angka titer = 1/8
Data titer pengenceran = [2 log (8) + 1] = 2, 208
c. Kontrol uji negatif
Angka titer = 1/64
Data titer pengenceran = [2 log (64) + 1] = 4,612
d. Kontrol uji negatif
Angka titer = 1/64
Data titer pengenceran = [2 log (64) + 1] = 4,612
e. Kontrol uji positif
Angka titer =1/64
Data titer pengenceran =[2 log (64) + 1] = 4,612

6. Jelaskan mengapa digunakan pengenceran bertingkat dalam

menentukan angka titer?
Jawab:
Penggunaan metode pengenceran bertingkat dalam menentukan angka
titer antibodi adalah untuk menentukan keberadaan antibodi darah
dalam wallplate. Tujuan dilakukannya pengenceran bertingkat untuk
melihat apakah daun sirih dapat memberikan pengaruh pada aktivitas
imunoglobulin M (IgM) berupa aglutinasi (penggumpalan) pada sel
darah merah mencit yang diinduksi dengan sel darah merah kambing
(Ilham dkk., 2016).

7. Jelaskan fungsi dari nilai angka titer dan hubungan angka titer dengan
peningkatan aktivitas imunoglobulin?
Jawab:
Fungsi dari nilai angka titer adalah untuk melihat apakah daun sirih
hijau (Piper betle L.) mampu meningkatkan imunoglobulin M (Igm)
pada mencit serta dapat memberikan aktivitas imunoglobulin M (Igm)
terhadap variasi dosis infusa daun sirih hijau (Piper betle L.), dimana
 semakin besar angka titer yang diperoleh maka semakin baik dalam
peningkatan aktivitas imunoglobulin M (IgM) mencit (Ilham dkk.,
2016).

8. Simpulkan hasil percobaan yang diperoleh disesuaikan dengan tujuan

percobaan?
Jawab:
Kesimpulan dari tujuan percobaan yang dilakukan yaitu untuk
memperoleh data aktivitas imunoglobulin M (IgM) sampel uji dengan
mengamati pengenceran tertinggi dari serum darah mencit yang masih
dapat mengaglutinasi sel darah merah domba. Hasil yang diperoleh
dapat dipengaruhi dari pengambilan sampel darah pada mencit secara
intrakardial serta pengamatan dari aktivitas imunoglobulin dilakukan
dengan melihat aglutinasi yang terjadi dan dihitung titer antibodi yaitu
pengenceran tertinggi darah mencit yang menunjukkan aglutinasi. Dan
hasil akhir dari uji hemaglutinasi dapat ditentukan dengan melihat pola
pengendapan sel darah merah pada dasar well plate.
Hasil pengujian yang telah dilakukan, dapat diambil kesimpulan
bahwa uji hemaglutinasi yang telah dilakukan menggunakan sampel
uji infusa daun sirih (Piper betle L.) dengan konsentrasi 5%, 10%,
15%, dan 20% dengan kontrol positif stimuno dan kontrol negatif
aquades. Nilai titer yang didapatkan yaitu 1/64 (kontrol positif), 1/64
(kontrol negatif), 1/8 (infusa 10%), 1/8 (infusa 20%). Hasil
pengamatan pengujian menunjukkan bahwa tidak terjadi
penggumpalan pada sampel uji baik dari konsentrasi pengenceran
tertinggi dan terendah, hal ini bisa disebabkan oleh tidak terbentuknya
antibodi pada darah mencit, atau sampel uji yang digunakan tidak
bekerja dengan baik.
 DAFTAR PUSTAKA

Adijaya, O., & Bakti, A. P. 2021. Peningkatan Sistem Imunitas Tubuh Dalam
Menghadapi Pandemi Covid-19. Jurnal Kesehatan Olahraga. 9(03), 51-60.

Effendi, N., & Harti, W. 2014. Identifikasi Aktivitas Imunoglobulin M (IgM)

Ekstrak Etanolik Daun Ceplukan (Physalis minima Linn.) Pada Mencit.
Jurnal Kesehatan. 8(2): 358.

Erniati, E., & Ezraneti, R. 2020. Aktivitas imunomodulator ekstrak rumput laut.
Acta Aquatica: Aquatic Sciences Journal. 7(2), 79-86.

Fristiohady, A., Wahyuni, W., Malik, F., Leorita, M., Yusuf, M. I., Febriansyah,
H., & Sahidin, S. 2019. Efek Imunomodulator Ekstrak Etanol Spons
Xestospongia Sp. Terhadap Aktivitas Fagositosis Makrofag Pada Mencit
Jantan Galur Balb/C. Jurnal Mandala Pharmacon Indonesia. 5(1), 15-30.

Handayani, S. P., Andri, S., & Muhammad Ardi, A. 2022. Pengaruh Sentrigufasi
Spesimen Darah Anemia Terhadap Derajat Aglutinasi Pemeriksaan
Golongan Darah Metode Slide. Jurnal Analis Kesehatan. 11(1), 44-45.

Hilma. H. S., Adi, I. C., & Sarasati, W. 2022. Kajian Potensi Daun Sirih Hijau
(Piper betle L.) sebagai Antibakteri. Jurnal Sain Veteriner. 40 (2), 128-
138.

Indrisari, M., Habibie, H., & Rahimah, S. 2017. Uji efek ekstrak etanol daun jarak
pagar (Jatropha curcas L.) terhadap titer imunoglobulin M (IgM) dan
imunoglobulin g (IgG) pada tikus putih jantan (Rattus norvegicus). Jurnal
farmasi UIN Alauddin Makassar. 5(4), 244-250.

Ira, L. C. 2020. Potensi Herbal Sebagai Imunomodulator. Jurnal Kedokteran Ibnu

Nafis. 9(2), 33-44.
Leksono, W. B., Pramesti, R., Santosa, G. W. & Setyati, W. A. 2018. Jenis Pelarut
Metanol dan N-Heksana Terhadap Aktivitas Antioksidan Ekstrak Rumput
Laut gelidium sp Dari Pantai Arini Gunung Kidul Yogyakarta. Jurnal
Kelautan Tropis. 21(1), 9-16.

Lucia, L. 2016. Eksperimental Farmakologik: Orientasi Preklinik. Surabaya:

Sandira Surabaya.

Ilham, F. R. P., Victoria, Y.f., dan Arsyik, I. 2016. Aktivitas Imunoglobulin M

(IgM) Ekstrak Buah Mengkudu (Morinda citrifolia L.) Terahadap Tikus
Putih (Rattus Norvegiens). Jurnal Sains dan Kesehatan. 1(6), 20-22.

Maulana, Y. A., Subarnas, A., & Berbudi, A. 2018. Aktivitas Imunomodulator

Tanaman Sambiloto (Andrographis paniculata Nees). Jurnal Farmaka.
16(3), 16-21.

Novita, R. Pemilihan Hewan Coba pada Penelitian Pengembangan Vaksin

Tuberculosis. Jurnal Biotek Medisiana Indonesia. 4(1), 15-23.

Oki Selfiana, M., Susilorini, T. E., & Puguh, S. 2017. Pengaruh Lama
Penyimpanan Dekok Daun Sirih Hijau (Piper Betle L.) Terhadap Aktivitas
Daya Hambat Bakteri Streptococcus Agalactiae Penyebab Matitis Pada
Sapi Perah. Jurnal Ilmu dan Teknologi Hasil Ternak. 12(1), 47-50.

Puspitaningrum, I., Kusmita, L., & Franyoto, Y. D. 2017. Aktivitas

Imunomodulator fraksi etil asetat daun som jawa (Talinum triangulare
(Jacq.) terhadap respon imun non spesifik. Jurnal Ilmu Farmasi dan
Farmasi Klinik. 14(1), 24-29.

Setyani, W., Setyowati, H., & Ayuningtyas, D. 2016. Pemanfaatan ekstrak

terstandarisasi daun som jawa (Talinum paniculatum) (Jacq. Gaertn) dalam
sediaan krim anti bakteri Staphylococcus aureus. Jurnal Farmasi Sains dan
Komunitas. 14(10), 44-51.
Sukmayadi, A. E., Sri A. S., Melisa I. B., & Anisa D. A. 2014. Aktivitas
Imunomodulator Ekstrak Etanol Daun Tempuyung (Sonchus arvensis
Linn.). Jurnal IJPST. 1(2) 56-57.

Thahir, Z. 2019. Uji Efek Antidiare Ekstrak Daun Mengkudu (Morinda Citrifolia
L) Pada Mencit (Mus musculus). Jurnal Kesehatan Yamasi Makassar. 3(2),
35-36.

Wahyuni., Yusuf, M. I., Malik, F., Lubis, A. F. Indalifiany, A., Sahidin, I. 2019.
Efek Imunomodulator Ekstrak Etanol Spons Melophlus sarasinorum
Terhadap Aktivitas Fagositosis Sel Makrofag Pada Mencit Jantan Balb/C.
Jurnal Farmasi Galenika (Galenika Journal of Pharmacy). 5(2), 147-157.
 LEMBAR PENGESAHAN

Samarinda, 24 September 2022

Mengetahui
Asisten Praktikum, Praktikan,

Putri Sekardjati Grace Akwila

NIM. 1913016101 NIM. 2013016215