Efek pada respon imun bahan antidiabetes

dari ubi jalar berkulit putih

(Ipomoea batatas L.)

Bahan dan metode

Bahan : WSSP (Ipomoea batatas L.), disebut juga caiapo, adalah purdikejar dari Prefektur
Kagawa Asa Agricultural Cooperative (Kagawa, Jepang). Ekstrak utuh diperoleh dengan cara
dihaluskan. Korteks dihomogenisasi dengan ad 10ml aquadest. Seluruh ekstrak dan korteks
kemudian diliofilisasi untuk membuat tablet WSSP.
Isolasi dan pemurnian
Bahan aktif WSSP diekstraksi dengan pengendapan dengan etanol 85% kemudian dengan
perlakuan asam trikloroasetat. Cairan supernatan yang diperoleh dengan sentrifugasi didialisis
untuk menghilangkan asam trikloroasetat kemudian diliofilisasi. Serbuk dilarutkan dalam buffer
fosfat, dan larutan dilewatkan pada kolom butil dan fenil-hidrofobik untuk mengisolasi AWSSP.
Tindakan antidiabetik AWSSP, seperti aktivitas hipoglikemik dan efek peningkatan insulin
darah, dikonfirmasi pada tikus tipe 2.
AWSSP adalah 8,4% dari berat WSSP. Berat molekul AWSSP dikonfirmasi kurang dari 22.000
dengan elektroforesis gel natrium dodesulfatpoliakrilamida. Elektroforesis gel natrium
dodesilsulfat-poliakrilamida dilakukan dengan gel poliakrilamida 15% dan buffer Tris-trisin
dengan adanya 2-merkaptoetanol. Setelah elektroforesis, gel diwarnai dengan Coomassie
Brilliant Blue.
Persiapan neutrofil atau monosit
Neutrofil dan monosit manusia dari darah vena donor sehat yang diobati dengan heparin diisolasi
dengan media pemecahan monopoli dengan sentrifugasi pada 400g selama 30 menit Neutrofil
dan monosit dicuci tiga kali dengan medium RPMI 1640 dengan 100 µ / mL penisilin G dan 100
g / mL streptomisin dan disuspensi kembali pada konsentrasi 5.106 sel / mL dalam RPMI 1640
medium lentur diberikan dengan 10% serum sapi janin yang tidak diaktifkan oleh panas. Sel (1
106 sel) diinkubasi pada kaca penutup selama 90 menit pada suhu 37 ° C dan kemudian dicuci
tiga kali dengan media RPMI 1640 untuk menghilangkan sel yang tidak melekat.
Estimasi fagositosis
Pengaruh AWSSP pada fagositosis dan fusi fagosom-lisosom oleh leukosit manusia dievaluasi
dengan Staphylococcus aureus sel dilapisi dengan AWSSP in vitro. Staphylococcus aureus 209P
ditanam dalam nutrient agar pada suhu 37 ° C selama 24 jam dan kemudian dibunuh dengan
autoklaf. AWSSP yang diisolasi (0,2 sampai 25,0 g / mL) dicampur dengan suspensi sel
penghilang panas dari Staphylococcus aureus 209P (1 108 sel / mL) kemudian disuspensikan
dalam gelatin 0,1% ditambah buffer Hank dengan cara diaduk kuat-kuat. Fagositosis dimulai
dengan menambahkan 200 L inaktif berlapis AWSSPS. aureus suspensi pada kultur neutrofil
(atau monosit) 10(56 sel / mL) pada kaca penutup. Setelah diinkubasi Selama 60 menit (3 jam)
dengan neutrofil (monosit) pada suhu 37 ° C, penutup kaca dicuci tiga kali dengan medium
RPMI 1640, dan neutrofil serta monosit diikat dengan metanol kemudian diwarnai dengan biru
metilen. Dilapisi AWSSP staphylococcus aureus yang telah berfagositosis ke neutrofil atau
monosit diamati di bawah mikroskop. Seratus dua puluh sel dalam bidang mikroskopis diperiksa
secara acak, dan jumlah bakteri fagositosis per sel dihitung.
Perkiraan laju fusi fagosom-lisosom
Fusi fagosom-lisosom oleh neutrofil diuji dengan menggunakan metode yang sama seperti yang
dijelaskan untuk studi fagositosis setelah neutrofil diberi label awal dengan jeruk akridin (5 g /
mL) pada kaca penutup selama 15 menit pada suhu 37 ° C. Fusi fagosom-lisosom dimulai
dengan penambahan inaktif stephylacoccus aureus sel dilapisi dengan AWSSP (rasio neutrofil
1:10 terhadap bakteri) dalam volume total 200 L medium RPMI 1640 ditambah dengan 10%
serum janin sapi. Setelah inkubasi selama 60 menit, penutup kaca dicuci tiga kali dengan
medium RPMI 1640 dan dibiarkan mengering. Fusi fagosom-lisosom ditentukan dengan
mengamati bakteri bernoda orange tajam di bawah mikroskop fluoresensi dengan panjang
gelombang emisi 520 nm. Seratus sel dalam bidang mikroskopis diperiksa secara acak, dan
jumlah bakteri per sel dihitung. Indeks fusi didefinisikan sebagai persentase fusi positif dikalikan
dengan jumlah rata-rata fagosom fusi per sel.
Penentuan produksi anion superoksida oleh neutrofil
Generasi anion superoksida (O2) oleh neutrofil diukur berdasarkan reduksi sitokrom C sebagai
dijelaskan sebelumnya [15–18]. Campuran reaksi standar mengandung 80 M sitokrom C, 1
106neutrophils / mL, dan 5 107 sel / mL Stephylacoccus aureus dilapisi dengan AWSSP dalam
volume total 1,0 mL larutan garam HEPES. Setelah inkubasi selama 60 menit pada suhu 37 ° C,
suspensi disentrifugasi pada suhu 5000g selama 1 menit. Absorbansi pada 550 nm dari setiap
larutan supernatan diukur dalam spektrofotometer. Nilai reduksi sitokrom C dihitung dari
persamaan E550 nm 2.1 104M / cm, dimana E550 nm adalah koefisien kepunahan molar pada
550 nm.
Hasil
Hasil uji fagositosis dengan konsentrasi AWSSP berkisar antara 0,2 hingga 25,0 g / mL
ditunjukkan pada Gambar 1. Laju fagositik berlapis AWSSP stephylacoccusaureus oleh
neutrofil secara signifikan lebih tinggi (sekitar delapan kali) dibandingkan laju fagositosis tanpa
lapisan stephylacoccus aureus. Phagolaju sitik berlapis AWSSP S. aureus oleh monosit itu
sekitar dua kali kecepatan fagositosis kontrol.
 Gambar. 1. Efek bahan antidiabetes dari Ipomoea batatas L. pada fagositosis: (A) neutrofil
manusia dan (B) monosit manusia. Nilai mewakili mean deviasi standar dari tiga eksperimen
berbeda. Sig- sangat berbeda dari kontrol, *P. 0,05, **P. 0,01, ***P. 0,001.
disajikan dalam Tabel 1. Pada konsentrasi 25 g / mL AWSSP, 46% sel fagositik dibunuh dengan
mencerna bakteri yang menyatu dalam fagosom.

AWSSP, bahan antidiabetes dari ubi jalar kulit putih; FI, indeks fusi; PI, indeks fagositik
* FI didefinisikan sebagai persentase fusi positif dikalikan dengan
rata-rata jumlah fagosom yang menyatu per sel.† PI didefinisikan sebagai persentase fagositosis
positif dikalikan dengan jumlah rata-rata bakteri fagositosis per sel.
Indeks fusi untuk lapisan AWSSP stephylacoccus aureus sel secara signifikan lebih tinggi
daripada untuk kontrol ( Gambar 2). Pada konsentrasi AWSSP 25,0 g / mL, indeks fusi berlapis
AWSSPS. aureus sel oleh neutrofil sekitar lima kali lipat dari kontrol tanpa lapisan. Fagositosis
dan fusi fagosom-lisosom meningkat dengan jumlah AWSSP. Rasio indeks fusi dengan indeks
fagositik untuk monosit manusia adalah tindakan antidiabetik, kami berhipotesis bahwa WSSP
mungkin berpengaruh pada kekebalan. Oleh karena itu kami menyelidiki apakah AWSSP, bahan
antidiabetes dari WSSP, memengaruhi respons imun leukosit manusia. Hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa bahan antidiabetes.

Gambar. 2. Pengaruh bahan antidiabetes dari Ipomoea batatas L. pada

fusi fagosom-lisosom oleh neutrofil manusia. Nilai mewakili mean
deviasi standar dari tiga eksperimen berbeda. Sangat berbeda dengan kontrol, *P. 0,05, **P. 0,01.

Gambar. 3. Pengaruh bahan antidiabetes dari Ipomoea batatas L. pada pelepasan anion
superoksida dari neutrofil manusia. Hasil adalah deviasi standar rata-rata dari tiga percobaan
yang berbeda. Hasil tidak berbeda secara signifikan dari kontrol.