13

BAB III
METODE PENELITIAN

Penelitian dilakukan dengan menggunakan metode eksperimental di

laboratorium. Isolasi minyak atsiri bunga cengkeh dilakukan dengan metode
destilasi uap dan air. Identifikasi komponen senyawa kimia yang terdapat pada
minyak atsiri bunga cengkeh dilakukan dengan metode GC-MS. Uji aktivitas
antibakteri minyak atsiri dilakukan dengan metode gaseous contact menggunakan
airtight box.

3.1 Bahan dan Alat

3.1.1. Bahan
a. Bahan utama: simplisia bunga cengkeh (Syzygium aromaticum L.) yang
diperoleh dari Merapi Farma, Yogyakarta.
b. Bahan untuk identifikasi simplisia bunga cengkeh: kaca preparat,
kloralhidrat.
c. Bahan untuk proses destilasi: aquades, Na2SO4.
d. Bahan untuk uji aktivitas antibakteri: aluminium foil, Escherichia coli
strain, Staphylococcus aureus strain, DMSO, double tape, kapas, kertas
payung, kertas saring (diameter = 9 cm), larutan standar McFarland, lilin
(malam), Mueller-Hinton agar (MHA), dan Mueller-Hinton broth
(MHB).

3.1.2. Alat
a. Alat untuk untuk identifikasi simplisia bunga cengkeh: mikroskop.
b. Alat untuk destilasi : seperangkat alat destilasi uap dan air, peralatan
gelas.
c. Alat untuk identifikasi kandungan senyawa kimia minya atsiri: GC-MS
Shimadzu QP2010 SE.

13
 d. Alat untuk uji aktivitas antibakteri: airtight box, autoklaf, bunsen, cawan
petri, inkubator, Laminar Air Flow (LAF), lemari pendingin, microwave,
mikropipet, ose, dan perangkat gelas.

3.2 Cara Penelitian

3.2.1 Pengumpulan Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah simplisia bunga
cengkeh (S. aromaticum L.) yang diperoleh dari Merapi Farma, Yogyakarta.

3.2.2 Identifikasi Simplisia Bunga cengkeh

Identifikasi simplisia bunga cengkeh dilakukan secara makroskopik dan
mikroskopik di Laboratorum Biologi Farmasi Fakultas MIPA Universitas Islam
Indonesia, Yogyakarta dengan mengacu pada Materi Medika Indonesia Jilid IV
untuk memastikan bahwa simplisia yang digunakan benar-benar bunga cengkeh
(Syzygium aromaticum L.).

3.2.3 Isolasi Minyak Atsiri Bunga Cengkeh

Proses isolasi dilakukan dengan metode destilasi uap–air. Sebanyak 1 kg
bahan didestilasi selama 4 jam, diukur mulai dari tetesan kondensat pertama.
Destilat yang diperoleh ditambahkan natrium sulfat anhidrat (Na 2SO4) untuk
memisahkan minyak dan air kemudian disimpan dalam wadah tertutup rapat dan
dimasukan ke dalam lemari pendingin hingga siap digunakan. Minyak atsiri yang
diperoleh digunakan sebagai sampel untuk proses selanjutnya.

3.2.4 Identifikasi kandungan senyawa dengan GC-MS

Analisis kandungan senyawa dalam minyak atsiri dilakukan dengan
menggunakan alat GC-MS. Minyak atsiri bunga cengkeh bersifat volatil sehingga
menurut National Chemistry Instrumentation Center (NCIC) dilakukan analisis
senyawa kimia menggunakan GC-MS. Analisis dilakukan dengan parameter
identifikasi sebagai berikut:
a. Volume injeksi : 0,1 µL

14
b. Fase gerak : Helium
c. Fase diam : RTX-5MS
d. Suhu injektor : 250ºC
e. Suhu detector MS : 200ºC
f. Suhu kolom : 60-300ºC dengan kecepatan 10o/menit
g. Laju alir : 0,75 ml/menit
h. Bank data : Willey

3.2.5 Persiapan untuk Uji Antibakteri

a. Sterilisasi Alat
Alat dan media yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri disterilkan
dalam autoklaf dengan suhu 121ºC selama ±15 menit dan airtight box
disterilkan dengan swab alkohol kemudian dilapisi dengan alumunium foil
dan diletakkan di bawah sinar UV selama 30 menit.
b. Pembuatan Seri Konsentrasi Minyak Atsiri
Minyak atsiri bunga cengkeh hasil isolasi dilarutkan dengan DMSO
sehingga didapat konsentrasi 25; 12,5; 6,25; 3,13; dan 1,56% dengan
volume akhir 1 mL.
c. Pembuatan Media Agar Miring
Sebanyak 0,95 gram MHA dilarutkan dalam 25 mL aquades, kemudian
dipanaskan dengan microwave sampai warna kuning bening. Masukkan ke
dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Tutup tabung reaksi
dengan kapas dan alumunium foil. Sterilisasi dengan autoklaf pada suhu
121ºC selama 15 menit. Tempatkan ditempat yang miring dan diamkan
sampai padat pada suhu kamar.
d. Pembuatan Biakan Bakteri
Sebanyak 1 ose isolat bakteri E. coli dan S. aureus dibiakkan pada media
agar miring MHA dengan pola zig-zag, masing-masing bakteri dibuat 2
biakan bakteri. Lakukan dalam keadaan steril pada ruang isolasi dengan
sinar UV atau di dalam LAF. Kemudian inkubasi biakan pada suhu 37ºC
selama 24 jam.

15
e. Pembuatan Media Broth
Sebanyak 0,63 gram MHB dilarutkan dalam 30 mL aquades, kemudian
dipanaskan dengan microwave sampai warna kuning bening. Masukkan ke
dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Tutup tabung reaksi
dengan kapas dan alumunium foil. Sterilisasi pada suhu 121ºC selama 15
menit.
f. Pembuatan suspensi bakteri
Koloni E. coli dan S. aureus hasil biakan diambil dengan ose steril dan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 5 mL MHB. Inkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam, kemudian setarakan kekeruhannya dengan
standar McFarland. Jumlah bakteri yang memenuhi syarat untuk uji
kepekaan yaitu: 105-108 CFU/ml.
g. Pembuatan media agar untuk cawan petri
Sebanyak 24,7 gram MHA dilarutkan dalam 650 mL aquades. Larutan
MHA dipanaskan dengan microwave dan disterilisasi menggunakan
autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit. Dituang 20 mL media MHA
steril pada cawan petri dan didiamkan hingga memadat.

3.2.6 Uji Efek Antibakteri dengan Metode Gaseous Contact

Disiapkan airtight box dengan volume 1,3 L yang telah dilapisi dengan
aluminium foil untuk melindungi dinding airtight box dari paparan minyak atsiri
yang sulit dibersihkan. Lilin (malam) ditempelkan di tepi bagian atas airtight box
untuk mencegah kebocoran udara.
Cawan petri yang berisi masing-masing 20 mL media MHA yang telah
memadat, disebarkan di permukaannya dengan 10 µL suspensi bakteri dengan
menggunakan spreader, kemudian dimasukkan ke dalam airtight box. Kertas
saring dimasukkan ke dalam airtight box dan ditempelkan ke dinding airtight box
dengan menggunakan double tape, kemudian diteteskan minyak atsiri sebanyak
260 µL dari masing-masing seri konsentrasi minyak atsiri dengan menggunakan
mikropipet. Masing-masing konsentrasi dibuat 3 kali replikasi. Kontrol disiapkan
dengan meneteskan 260 µL DMSO ke kertas saring. Kontrol digunakan untuk

16
melihat ada atau tidaknya efek dari pelarut. Airtight box kemudian ditutup dan
bagian tutupnya dilapisi lagi dengan selotip untuk mencegah kebocoran udara.
Semua airtight box di inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Didapat nilai MID
yang menunjukkan konsentrasi terkecil dalam menghambat pertumbuhan bakteri
pada sistem tertutup.

3.3 Analisis Hasil

Pengujian efek antibakteri dengan menggunakan metode gaseous contact
terhadap bakteri E. coli dan S. aureus akan didapat nilai Minimal Inhibitory Dose
(MID). MID merupakan dosis minimal untuk menekan pertumbuhan
mikroorganisme dalam sistem tertutup. MID dari minyak atsiri bunga cengkeh
tercatat dengan tidak adanya pertumbuhan bakteri E. coli dan S.aureus secara
visual. Nilai MID dinyatakan dengan satuan volume per unit volume (µL/L
udara). Analisis kandungan senyawa dalam minyak atsiri bunga cengkeh yang
dilakukan dengan menggunakan GC-MS akan diperoleh dua data yaitu
kromatogram dan spektra massa, kemudian dibandingkan dengan literatur.

17