Nama : Nelly’a Agustin Devy Rosyadi

NPM : 222205119

“Leakage Induced in Eschericia coli Cells by Scondary Metabolites of the J7 Bacterial Isolates
from the Rhizosphere of Zingiber officinale Roscoe var. Rubrum”

1. Latar Belakang
Penyakit infeksi adalah masalah yang terus berkembang di bidang obat-obatan. Salah satu
penyebabnya adalah paparan bakteri, misalnya Escherichia coli. Saat ini, banyak bakteri telah
mengembangkan resistensi antibiotik yang prevalensinya dibantu oleh penggunaan antibiotik yang
berlebihan dan tidak tepat sebagai anti infeksi Resistensi mengacu pada suatu kondisi ketika bakteri
berubah dari waktu ke waktu dan bahkan dapat bertahan hidup terhadap antibiotik.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari fraksi paling aktif dari isolat
ini dari kemampuannya untuk menginduksi kebocoran pada sel E. coli. Metabolit sekunder diekstraksi
dari Isolat J7 menggunakan pelarut etil asetat kemudian difraksinasi dengan perbandingan pelarut
heksana dan etil asetat yang berbeda, yaitu 1:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, dan 0:1 (v/v),
etil asetat dan metanol dengan perbandingan 1:1 (v/v), dan metanol 100%.

2. Metode

Instrumen yang digunakan dalam penelitian ini adalah Laminar Air Flow (LAF; Monmouth
Scientific), Biological Safety Cabinet (BSC), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu 1800), CAMAG
TLC Scanner 4, dan peralatan gelas.
Pada percobaan ini dilakukan metodeEkstraksi, fraksinasi, dan kromatografi lapis tipis. Dengan
proses Kultur kaldu yang telah diinkubasi selama 14 hari disaring menggunakan corong Büchner dan corong
vakum, kemudian dipekatkan pada suhu di bawah 50o C. Filtrat diekstraksi dengan etil asetat dengan
perbandingan 1:1 (v/v). Ekstrak etil asetat difraksinasi dalam corong pisah sesuai dengan kepolarannya.
Pelarut yang digunakan dalam fraksinasi adalah campuran n-heksana dan etil asetat dengan perbandingan
yang berbeda, yaitu 1:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, 0:1 (v/v), etil asetat-metanol 1:1 (v/v), dan
metanol 100%. Hasil fraksinasi diuapkan pada suhu kamar di dalam lemari asam. Masing-masing fraksi
kemudian dielusi dengan Kromatografi Lapis Tipis menggunakan kombinasi kloroform, etil asetat, metanol
dengan perbandingan 4:1:0,5 (v/v) sebagai fase gerak. Setelah itu, fraksi-fraksi dengan spot dan profil Rf
yang sama dikategorikan ke dalam satu kelompok.

3. Identifikasi

a. Uji antibakteri ekstrak etil asetat dan fraksi kultur kaldu isolat J7
Pada Percobaan ini Media yang digunakan untuk uji ini adalah Mueller Hinton Agar (MHA)
yang telah diinokulasi dengan suspensi Escherichia coli. Langkah Selanjutnya, setiap sumuran pada
plate diisi dengan 50 μL ekstrak etil asetat kultur cair Isolat J7 dengan konsentrasi 40% (b/v),
dibiarkan meresap, dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 18-24 jam. Aktivitas penghambatan
pertumbuhan dari ekstrak ini ditunjukkandengan adanya zona bening di sekitar sumuran.

b. Uji kebocoran berdasarkan tingkat protein dan asam nukleat

Suspensi yang telah di inkubasi selama 18-24jam disentrifugasi dengan
kecepatan 3500 rpm selama 15-20 menit dengan tujuan agar memperoleh biomassa
mikroba. Selanjutnya biomassa dicuci dengan buffer fosfat pH 7,4 sebanyak 2 kali
pengulangan. Sel kemudian disuspensikan dalam 4mL larutan buffer fosfat pH 7,4
dan di inkubasi kembali selama 24 jam pada suhu 37℃. Suspensi yang telah di
inkubasi di sentrifugasi kembali dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit
kemudian isolat dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada pajang
gelombang 260 nm dan 280 nm dengan tujuan untuk mengetahui kandungan protein
dan asam nukleat.

4. Hasil
Kultur dibuat dengan menggabungkan kultur starter dan media SNB dengan perbandingan 1:10
untuk mendapatkan konsentrasi 10% (v/v). Media SNB cair merupakan media pertumbuhan yang sesuai,
asalkan nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri seperti sumber karbon dan mineral lainnya
tersedia.
Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etil Asetat dari Kaldu Kultur Isolat J7
Sebelum menggunakan, media Mueller Hinton (MH) terlebih dahulu diinokulasi dengan
suspensi Escherichia coli sebanyak 108 CFU/mL dengan menggunakan kapas steril. Setelah itu,
ekstrak dituang ke dalam lubang atau sumuran berdiameter 6 mm. Pada konsentrasi 40%, ekstrak
menghasilkan zona hambat dengan diameter rata-rata 17,6±1,35 mm. sedangkan kontrol negatif
(DMSO 10%) tidak menunjukkan adanya aktivitas penghambatan. Kontrol positif (Kloramfenikol
0,1%) menghasilkan zona hambat dengan ukuran rata-rata 45,2±3,48 mm.

Fraksinasi ekstrak etil asetat hasil kultur isolat J7

Fraksinasi ekstrak etil asetat menggunakan gradien konsentrasi pelarut berupa
n-heksan, etit asetat, dan metanol yang dicampur hingga menghasilkan total volume
100mL. Kromatografi Lapis Tipis fraksi 1:3 menghasilkan pola kromatogram yang bervariasi
sehingga pecahan yang profilny sama digabungkan menjadi satu
kelompok hingga diperoleh 8 kelompok pecahan

Aktivitas antibakteri fraksi F1-F8 terhadap Echerchia coli

Dalam jurnal ini, diperoleh hasil penelitian menunjukkan bahwa hanya F2 dan
F3 yang menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap bakteri Echerchia coli.
MIC F3 dan F3 adalah 10% dengan diameter zina hambat masing-masing 11,58
0,95mm dan 9,25 0,87mm. Pengujian kebocoran pada F2 pada panjang gelombang
260nm diperoleh hasil bagian DNA yaitu purin, pirimidin dan ribonukleotida,
sedangkan pada panjang gelombang 280nm diperoleh tirosin dan triptofan.

Nilai Rf KLT
Dari hasil penelitian, titik fraksi aktif dan tidak aktif dapat dibedakan pada
panjang gelombang 254nm. Nilai Rf F2 sebesar 0,57 dan 0,62, sedangkan nilai Rf
F3 sebesar 0,56 dan 0,61. Bercak yang tampak diduga merupakan zat aktif yang
bertanggung jawab terhadap daya hambat pada bakteri Echerchia coli karena hanya
ditemukan pada elusi fraksi aktif. Sesuai dari hasil uji kerentanan antibakteri yaitu
F2 kebih aktif dibandingkan F3.

5. Kesimpulan
Hasil uji aktivitas percobaan ini, antibakteri menunjukkan bahwa F2 dan F3 memiliki sifat
antibakteri terhadap Escherichia coli. F2 merupakan fraksi yang paling aktif, dimana pada konsentrasi
10% menghasilkan zona hambat dengan diameter 11,58±0,95 mm. F2 menyebabkan kebocoran
komponen seluler, yang ditunjukkan dengan peningkatan asam nukleat dan protein yang diamati pada
panjang gelombang 260 dan 280 nm. Ketika dianalisis pada panjang gelombang 254 nm, nilai Rf dari
bercak F2 dan F3 masing- masing adalah 0,56-0,57 dan 0,61-0,62. Sementara itu, pada panjang
gelombang 260, nilai Rf adalah 0,47-0,48 dan 0,56-0.57. Bintik-bintik ini diprediksi sebagai agen di
balik sifat penghambatan ekstrak etil asetat dari IsolatJ7 terhadap Escherichia coli.

Daftar Pustaka :
Leswara, D.F., Sulistyani,N. & Kintoko.(2019). Leakage Induced in Eschericia coli Cells by
Scondary Metabolites of the J7 Bacterial Isolates from the Rhizosphere of Zingiber
officinale Roscoe var. Rubrum. Pharmaciana, vol 9(1), 145-156.