Malaria adalah suatu penyakit yang disebabkan oleh

protozoa obligat intraseluler dari genus plasmodium.

Penyakit ini secara alami ditularkan oleh gigitan nyamuk

Anopheles betina. Penyakit malaria ini dapat menyerang siapa
saja terutama penduduk yang tinggal di daerah tempat
nyamuk berkembangbiak dengan baik.
 P l a sm odium v i vax, s e cara
k l inis d i kenal s e bagai
m a laria t e rtiana k a rena
s e ra ngan d e mamnya t erjadi
s e tiap t iga h a ri s e kali 1 1 . s e cara k l inis j u ga d i kenal j u ga
s e bagai m a laria q u artana
k a rena s e ra nga n d e ma mnya
t e rjadi s etiap e m pa t h a ri
s e kali .
secara klinis dikenal juga
sebagai malaria ovale dengan
pola demam yang terjadi tidak
khas setiap satu sampai dua
ha ri s e kali
secara klinis juga dikenal juga
sebagai malaria quartana karena
serangan demamnya terjadi setiap
e mpat ha ri s e kali.

selama ini dikenal hanya ada pada

monyet ekor panjang (Macaca
fascicularis), ditemukan pula
ditubuh manusia
Malaria adalah penyakit infeksi
yang disebabkan oleh parasit
(Plasmodium) yang ditularkan oleh
gigitan nyamuk yang terinfeksi
(vector borne desease). Malaria
pada manusia dapat disebabkan
oleh P. malariae, P. vivax, dan P.
Ovale.
Parasit membiak dalam sel darah merah, menyebabkan
symptom termasuk anemia (kepala terasa ringan, sesak
nafas), termasuk juga symptom umum lain seperti
demam, sejuk, mual, koma dan kematian.

 Menghalang gigitan nyamuk melalui kelambu nyamuk dan

penghalang serangga.

 Melakukan langkah pengawalan nyamuk seperti

menyembur racun serangga dalam rumah.

 Mengeringkan kawasan air menggenang tempat nyamuk

bertelur.
 • Air liur nyamuk yang mengandung parasit
plasmodium dalam stadium gametosit masuk ke
dalam tubuh manusia dan membentuk stadium

 Pada umumnya ditularkan seksual

melalui gigitan nyamuk • Gamet betina dan jantan akan bersatu
Anopheles betina yang
menghasilkan sporozoit berbentuk kista.
menghisap darah untuk
pertumbuhan telurnya. • Sporozoit akan masuk ke dalam hati dan
berkembang biak menjadi skizon eksoeritrositik
 Biasanya ia aktif menggigit pada orang yang sensitif.
pada waktu malam hari.
• Hepatosit pecah dan terjadi stadium aseksual
(merozoid) dalam darah 6 sampai 11 hari yang
selanjutnya menjadi gametosit selama 3-14 hari
sesuai dengan spesies plasmodium malaria.
Untuk dapat melihat adanya parasit di
dalam darah penderita, perlu dibuat
sediaan darah malaria (SD).
Selanjutnya diwarnai dengan
pewarnaan giemsa. Pemeriksaan SD
ditetesi minyak imersi dan diperiksa di
bawah mikroskop menggunakan
lensa objektif perbesaran 100x. Jika
ditemukan parasit pada pemeriksaan,
penderita dinyatakan positif malaria
Rapid test mendeteksi adanya antigen
dari Plasmodium falciparum (Histidine
Rich Protein II). Deteksi sangat cepat
hanya membuthkan waktu 3-5 menit,
tidak memerlukan latihan khusus,
sensitivitasnya baik. Mekanisme kerja tes
ini berdasarkan deteksi antigen parasit
malaria, dengan menggunakan metoda
imunokromatografi, dalam bentuk
dipstik
 T
e
b
a
l

T
i
p
i
s
Tes serologi mulai diperkenalkan sejak tahun 1962 dengan memakai teknik
indirect fluorescent antibody test. Tes ini berguna mendeteksi adanya spesifik
antibodi terhadap malaria atau pada keadaan dimana parasit sangat minimal.
Tes ini kurang bermanfaat sebagai alat diagnostik sebab antibodi baru terjadi
setelah beberapa hari parasitemia.
Manfaat tes serologi terutama untuk penelitian epidemiologi atau alat uji saring
donor darah. Titer > 1:200 dianggap sebagai infeksi baru dan test >1:20
dinyatakan positif. Metode-metode tes serologi antara lain indirect
haemagglutination test, immunoprecipitation techniques, ELISA test, radio-
immunoassay
PCR bekerja dengan cara memperbanyak suatu sekuens gen yang diinginkan
dan kemudian dibaca pada agarose gel yang telah dielektroforesis. Saat ini
telah banyak penelitian menggunaan metode PCR dalam identifikasi parasit
malaria, hal ini menunjukkan bahwa PCR lebih sensitif dan lebih spesifik
dibandingkan pemeriksaan mikroskopis

Pada tahun 2004, Singh telah mengembangkan suatu pemeriksaan

dengan metode nested PCR untuk mendeteksi perbedaan spesies
Plasmodium yang dapat menginfeksi manusia. Nested PCR adalah suatu
teknik perbanyakan sampel DNA menggunakan bantuan enzim DNA
polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk
mengamplifikasi fragmen
1. Real-Time PCR (RT-PCR / qPCR)
2. Reverse-Transcriptase PCR (RT-PCR)
3. Reverse-Transcriptase Real-Time PCR (RT-qPCR)
4. Nested PCR
5. Multiplex PCR
6. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) PCR
• Nested PCR merupakan modifikasi dari teknik PCR dalam meningkatkan spesifisitas
untuk memperoleh produk yang spesifik.

• Modifikasi dilakukan dalam penggunaan primer saat reaksi. Pada teknik

konvensional hanya digunakan 1 pasang primer, namun pada nested PCR
menggunakan 2 pasang primer berbeda (A dan B) serta melibatkan 2 tahap reaksi
amplifikasi.

• Penggunaan 2 pasang primer oligonukleotida dapat meningkatkan siklus dan

sensitifitas reaksi PCR, serta efisien untuk mengamplifikasi DNA target dari template
DNA yang panjang.
 Adapun alur pemeriksaan
diagnosis molekulernya adalah
sebagai berikut :

Diagnosis molekuler merupakan metode ISOLASI DNA

diagnosis yang digunakan untuk memahami
mekanisme molekuler suatu penyakit pada
setiap individu pasien (personalized medicine).
Nested-PCR

Amplifikasi DNA
target dengan
Elektroforesis
 Bahan-bahan yang diperlukan dalam isolasi
Isolasi DNA merupakan suatu
DNA adalah QIAmp® DNA Kit yang terdiri dari :
prosedur yang bertujuan untuk
memisahkan materi genetik suatu Proteinase K; Buffer AL; Buffer AW1; Buffer AW2;
makhluk hidup dari materi yang ada
dan Buffer AE, Etanol (100%), sampel darah, dan
disekitarnya.
air murni (aquabidest).
Bahan : Darah Segar (Whole Blood)
Sampel darah segar dalam tabung
EDTA diekstraksi dengan Adapun alat yang dibutuhkan adalah pulse
menggunakan protokol ekstraksi dari
vortexing, spindown, QIAamp spin column,
Qiagen blood mini kit sehingga
dihasilkan isolat DNA yang disimpan collection tube 2 ml, centrifuge, mikrocentrifuge
pada kulkas suhu -20⁰C hingga PCR
tube, mikropipet berukuran 100-100 uL, blue
dilakukan.
tips, yellow tips, stopwatch, dan waterbath 56°C
 5
3
1

2 Menambahkan Melakukan spindown 1.5

Memasukan 20µl 200µl buffer AL ke 4 ml microcentrifuge tube
QIAGEN Protease 4
dalam sampel, untuk menghilangkan
(atau K Proteinase) cairan yang terdapat pada
kemudian divortex
ke dalam 1.5 ml
selama 15 detik. tutup tube.
microcentrifuge Menambahkan
tube. 200µl sampel ke Menginkubasi selama
microcentrifuge 10 menit dalam suhu
tube. 56°C pada waterbath.
6. Menambahkan 200µl etanol
(100%) ke dalam sampel,
kemudian divortex
menggunakan pulse-
vortexing selama 15 detik.
Setelah itu, spindown untuk
menghilangkan cairan yang
terdapat pada tutup tube.
7. Campuran larutan tersebut
dipindahkan ke QIAamp Spin
Column (2 ml collection tube)
tanpa membasahi pinggiran
tube, menutup tube, lalu
dicentrifuge dalam 6000 x g
(8000 rpm) selama satu menit.
Kemudian buang hasil filter
yang terdapat pada collection
tube.
8. Menambahkan 500µl buffer AW1
pada QIAamp Spin Column tanpa
membasahi pinggiran tabung.
Tutup, lalu lakukan centrifuge
dalam 6000 x g (8000rpm) selama
satu menit. Membuang hasil filter
yang terdapat pada collection tube.
9. Menambahkan 500µl buffer
AW2 pada QIAamp Spin
Column tanpa membasahi
pinggiran tabung. Tutup,
lalu lakukan centrifuge.
dalam kecepatan penuh
20000 x g (14000rpm)
selama tiga menit.
 Meletakkan QIAamp Spin Column kedalam 1.5ml microcentrifuge tube dan
menyingkirkan collection tube yang terdapat filter. menambahkan 200µl buffer

10
AE pada QIAamp Spin Column. Menginkubasi dalam suhu ruangan (15-25°C)
selama satu menit, lalu melakukan centrifuge dalam 6000 x g (8000rpm)
selama satu menit.

Membuang QIAamp Spin Column dan menutup 1,5 ml

11

microsentrifuge tube, hasil ekstraksi dapat disimpan pada

lemari pendingin.
 Proses ini memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi pada produk selama
amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak diperlukan.

• Dua set primer digunakan untuk mendukung metode ini, set kedua mengamplifikasi
target kedua selama proses pertama berlangsung.
• Sekuens DNA target dari satu set primer yang disebut primer inner disimpan di antara
sekuens target set kedua dari primer yang disebut sebagai outer primer.

Pada prakteknya, reaksi pertama dari PCR menggunakan outer primer, lalu reaksi PCR kedua
dilakukan dengan inner primer atau nested primer menggunakan hasil dari produk reaksi yang
pertama sebagai target amplifikasi. Nested primer akan menyatu dengan produk PCR yang pertama dan
menghasilkan produk yang lebih pendek daripada produk yang pertama.
 Melakukan pengenceran pada outer forward primer dan outer reverse primer. Mengambil
01 larutan outer forward primer sebanyak 2,5 uL kemudian mencampurkannya dengan larut-
an dd H2O sebanyak 7,5 uL. Begitu juga dengan outer reverse primer. Pada saat melaksa
nakan teknik PCR harus dilakukan pada lemari UV untuk PCR atau BSC

02 Melakukan vortex selama 10 detik pada kedua outer primer yang sudah diencerkan
. (untuk mengencerkan outer forward primer dan outer reverse primer)

Menyiapkan satu tube PCR kemudian mengisinya dengan mix sebanyak 12,5
03 uL, outer forward primer 0,5 , outer reverse
primer 0,5 uL, dan dd H2O 25 uL.

Memasukkan sampel ke dalam tube. Mengambil sampel yang sudah ter-

04 sedia kemudian memasukkannya ke dalam tube. Tube harus diangkat
agar bakteri dapat terlihat apabila sudah benar-benar masuk ke dalam
campuran.
Cara Kerja Nested-PCR

05 Setelah semua larutan dimasukkan, tube di vortex selama 10 detik.

06 Tube disimpan pada template kemudian diletakkan pada UV untuk PCR atau BSC.

Meletakkan tube PCR pada alat spindown. Posisi tube harus seimbang. Tube
07 di spindown selama 10 detik.

Alat PCR disetting untuk suhu denaturasi 95ºC , annealing 45ºC , inkubasi
08 15 detik, dan ekstensi 75ºC . Siklus disetting sebanyak 25 kali.
09 Tube PCR diletakkan pada alat PCR untuk memulai proses amplifikasi
pertama.

10 Menambahkan 1µL inner forward primer dan 1µL inner reverse primer ke dalam tu
be PCR untuk amplifikasi kedua.

Alat PCR disetting untuk suhu denaturasi 95ºC , annealing 45ºC , inkubasi 15
11 detik, dan ekstensi 75ºC . Siklus disetting sebanyak 35 kali.

12 Tube PCR dimasukkan ke dalam alat PCR.

Primer dan Ukuran Amplikon Plasmodium spp.
Untuk Pemeriksaan Nested PCR
 Proses amplifikasi bertujuan untuk memperbanyak fragmen D N A target
yang telah diisolasi. Proses amplifikasi menggunakan teknik Polymerase
Chain Reaction (PCR) secara konvensional. Alat PCR yang digunakan
adalah Rotor-Gene® Q (Q iagen).

Elektroforesis merupakan suatu cara untuk membaca atau

menginterpretasikan hasil dari proses PCR.
Prinsip elektroforesis agarose adalah teknik pemisahan asam
nukleat/protein berdasarkan perbedaan medan listrik, molekul dan partikel
bermuatan akan bergerak ke arah elektrode yang memiliki muatan
berlawanan di bawah pengaruh medan listrik.
 1 2 3 4
Menghitung jumlah tiap Mencampurkan setiap Melakukan aliquot
Membuat campuran
bahan yang dibutuhkan bahan dengan volume campuran reaksi
reaksi dengan
sesuai dengan perhitungan tersebut sebanyak 24
perhitungan: 25 μL pada setiap reaksi,
volume tiap bahan total reaksi ke dalam μL pada setiap 0,2 ml
per reaksi ×(total
nomor reaksi + 1 dikalikan dengan reaksi microsentrifuge tube, microsentrifuge tube.
(total nomor reaksi + 1). kecuali DNA tamplate.
 5 6 7
Menambahkan Menempatkan tube ke Menjalankan reaksi
DNA tamplate dalam rotor, kemudian PCR sesuai dengan
sebanyak 1 μL memasukkan rotor ke kondisi PCR yang
pada setiap tube. dalam Rotor-Gene®️ Q telah ditentukan.
(Qiagen).
 Hasil PCR Nest 1 (Plasmodium spp) dengan Amplikon Sebesar
1100 bp, M adalah Marker DNA, K adalah Kontrol Positif,
Sampel positif No.36

Hasil PCR Nest 1 (Plasmodium spp) dengan Amplikon

sebesar 1100 bp, M adalah marker DNA, K adalah
kontrol positif, Sampel Positif No. 84,85,86,87

Pada pemeriksaan PCR, PCR nest-1 menggunakan

primer genus Plasmodium spp. ditemukan 5 sampel
positif dengan ukuran amplikon 1100 bp (sampel no. 36,
84, 85, 86 dan 87).
Selanjutnya dilakukan PCR nest-2 dengan 5 pasang primer sesuai spesies
Plasmodium dan ditemukan 2 spesies yaitu P. falciparum dan P. vivax. Sebanyak
satu sampel (1,1%) P. falciparum yaitu pada sampel no. 36 dengan ukuran amplikon
205 bp dan empat sampel (4,6%) P. vivax yaitu pada sampel no. 84, 85, 86 dan 87
dengan ukuran amplikon 120 bp.

Hasil PCR Nest 2 (P. Falciparum) dengan

Amplikon Sebesar 205 bp
M adalah Marker DNA
A-D = sampel No.36
suhu annealing 60°C (A),
59° C(B),58°C(C) dan 57°C(D).
Hasil PCR Nest 2 (P.vivax) dengan Amplikon
sebesar 120 bp, M adalah Marker DNA, Hasil PCR Nest 2 (P.vivax) dengan
Sampel positif no.84 dan 85. Amplikon Sebesar 120 bp, M adalah
Marker DNA, Sampel positif no.86 dan 87.
CREDITS: This presentation template was created by Slidesgo, including icons by
Flaticon, and infographics & images by Freepik