Optimasi Teknik Ekstraksi Protein Daun Tanaman Padi

(Oryza sativa L.)

Susianti
Divisi Fisiologi Molekular, Aktivitas Biologi Laboratorium Sentral Universitas Padjadjaran,
Jl. Bandung – Sumedang Km. 21
susianti@unpad.ac.id

ABSTRAK

Ekstraksi protein adalah salah satu teknik dasar dalam bidang biologi molekular untuk
mengisolasi protein dari berbagai jenis bahan biologi seperti sel, bakteri, jaringan hewan dan
tanaman. Teknik ini merupakan metode yang sederhana dalam pengerjaannya namun paling
penting sebagai titik awal untuk pemurnian protein atau tahapan analisis proteomik berikutnya.
Ekstraksi protein dari jaringan hewan atau sel cenderung lebih sederhana dan mudah karena
struktur dari membran sel yang tidak terlalu sulit untuk dihancurkan. Sedangkan, untuk
melakukan ekstraksi protein yang berasal dari tanaman lebih sulit dan membutuhkan
protocol/modifikasi khusus. Dalam implementasinya pada penelitian tertentu khususnya yang
berkaitan dalam bidang pertanian dan farmasi untuk mempelajari ekstraksi protein dari tanaman
belum ada standard baku optimal di Universitas Padjadjaran. Ada beberapa faktor seperti
temperatur, larutan dapar ekstraksi, khelat, dan detergen yang digunakan harus diperhatikan
ketika melakukan ekstraksi protein tumbuhan. Oleh karena itu, proses optimasi menjadi hal yang
penting untuk mendapatkan lysate protein yang terbaik. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan
optimasi proses ekstraksi protein dari tanaman. Daun tanaman padi (Oryza sativa L.) diekstraksi
menggunakan modifikasi larutan dapar ekstraksi dan dilakukan kuantifikasi protein serta
pemisahan protein menggunakan elekroforesis gel poliakrilamida sebagai tolak ukur keberhasilan
proses ekstraksi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa protein dari daun tanaman padi dapat
terekstraksi dengan baik terlihat dari hasil kuantifikasi protein yang didapatkan sebesar 2.472,5
mg/L, dan hasil elektroforesis gel poliakrilamida dimana protein terpisah sesuai dengan ukuran
proteinnya. Optimasi teknik ekstraksi protein dengan modifikasi larutan dapar ekstraksi menjadi
teknik yang sederhana, efisien dan efektif untuk mengekstrak protein total dari daun tanaman
padi.

Kata kunci: ekstraksi, protein, tanaman padi, elektroforesis

Pendahuluan karakterisasi dan menghitung tingkat

ekspresi protein oleh sel atau jaringan
Padi (Oryza sativa L.), salah satu
hewan maupun tanaman (Gulcicek, et al.
tanaman pangan terpenting di dunia yang
2005). Waruwu (2013) menyatakan
menjadi makanan pokok jutaan orang
bahwa identifikasi protein secara
khususnya di benua Asia dan Afrika
kuantitatif dapat diamati melalui analisis
(Wu, et al. 2014). Seiring dengan
profil protein yang didapat dari hasil
bertambahnya konsumsi untuk bahan
ekstrasi protein, yang merupakan aspek
pangan, peningkatan kualitas padi selalu
paling penting dalam menentukan
menjadi tantangan bagi para peneliti
keberhasilan analisis proteomik (Vilhena,
tanaman. Banyak penelitian telah
et al. 2015). Proses ekstraksi protein dari
dilakukan baik studi genomik maupun
sel atau jaringan hewan cenderung lebih
studi proteomik. (Zhang, et al. 2017).
sederhana dan mudah karena struktur dari
Dalam beberapa tahun terakhir, studi membran sel yang tidak terlalu sulit
proteomik telah mengalami untuk dihancurkan sedangkan untuk
perkembangan, baik untuk identifikasi, melakukan ekstraksi protein yang berasal

1
dari tanaman lebih sulit, karena tanaman
mengandung banyak protease dan
senyawa pengganggu seperti
polisakarida, lipid, polifenol, dan
metabolit sekunder yang lainnya
(Lledías, et al. 2017 & Rodrigues, et al.
2012). Meskipun beberapa protokol
ekstraksi protein tercantum dalam banyak
literatur, namun tidak ada protokol
ekstraksi protein yang bersifat universal
untuk mengekstrak semua jenis protein,
sehingga efektivitas teknik ekstraksi
protein sangat bergantung pada struktur
protein dan karakteristik kimianya
(Abdullah, et al. 2017).
Dalam implementasinya pada penelitian
tertentu khususnya yang berkaitan dalam
bidang pertanian dan farmasi untuk
mempelajari ekstraksi protein dari
tanaman di Universitas Padjadjaran
belum terstandarisasi dengan optimal.
Beberapa faktor seperti temperatur,
larutan dapar lisis, khelat, dan detergen
yang digunakan harus diperhatikan ketika
melakukan ekstraksi protein. Oleh karena
itu, proses optimasi ekstraksi menjadi hal
yang penting untuk mendapatkan kualitas
lysate protein yang terbaik. Tujuan dari
penelitian ini untuk melakukan optimasi
proses ekstraksi protein dari daun
tanaman padi (Oryza sativa L.)
menggunakan modifikasi larutan dapar
ekstraksi dan dilakukan kuantifikasi
protein serta pemisahan protein
menggunakan elekroforesis gel
poliakrilamida sebagai tolak ukur
keberhasilan proses ekstraksi.
Bahan dan Metode
Bahan habis pakai
Bahan-bahan yang digunakan
meliputi larutan Dapar Ekstraksi (terdiri
dari 23,96 gram Sukrosa, 6,05 gram Tris-
Base, 10 mL 0,5M EDTA pH 8,0, 0,75
gram Kalium Klorida, 250 µL Asam
Klorida, 2 mL 2-merkaptoetanol (2-ME),
dilarutkan dalam 100 mL akuades),
larutan Dapar Pengendap (terdiri dari 1,4
gram Amonium Asetat, 140 µL 2-
merkaptoetanol, dilarutkan dalam 200
mL metanol), Larutan Dapar Lisis (terdiri
2
dari 57 gram Urea, 4 mL Triton-X,
0,4844 gram Tris-Base, 0,2314 gram
DTT, dilarutkan dalam 100 mL akuades),
Polivinilpirolidon (PVP), Protease
Inhibitor (PI), Bovine Serum Albumin
(BSA), Reagen Lowry, Folin Ciocalteu,
Nitrogen Cair, Ladder Protein,
Poliakrilamida 30%, Running Buffer
(terdiri dari 1,5 gram Tris-Base, 7, 2
gram Glisina, dan 0,5 gram SDS),
Sample Buffer, Sodium Dodecyl Sulfate
(SDS) 10%, Stacking Buffer, Resolving
Buffer, Amonium Persulfat, TEMED,
Coomassie Blue, Metanol, Asam Asetat
Glasial.
Metode Pengerjaan
Pengambilan Sampel
Daun tanaman padi (Oryza sativa L.)
berumur 30 hari dibersihkan dan
dipotong menjadi ukuran yang lebih kecil
sebelum digunakan (Islam, et al. 2004
dan Wang, et al. 2008).
Ekstraksi Protein
Proses ekstraksi protein menggunakan
metode Lin & Chang (2014) yang telah
dimodifikasi. Daun tanaman padi
sebanyak 1,5 gram dihaluskan dengan
mortar dan alu menggunakan nitrogen
cair hingga halus merata. Ekstraksi
dilakukan pada suhu 4○C. Daun tanaman
padi yang telah halus ditambahkan 5 mL
dapar ekstraksi, ditumbuk hingga
berbuih. Kemudian ditambahkan 0,5 g
PVP sambil ditumbuk, dan ditambahkan
kembali 5 mL dapar ekstraksi, ditumbuk
hingga berbuih. Lalu ditambahkan 25 μL
protease inhibitor dan 5 mL dapar
ekstraksi. Campuran ditumbuk hingga
berbuih. Setelah itu, campuran
dipindahkan kedalam tabung 1,5 mL dan
disentrifugasi 20 menit dengan kecepatan
15.000 rpm pada suhu 4○C. Filtrat yang
diperoleh kemudian disaring dan
dipindahkan kedalam tabung 1,5 mL
baru, ditambahkan dapar pengendap
dalam filtrat dengan perbandingan 3:1
dan diinkubasi pada -20○C selama 4 jam.
Setelah itu, campuran disentrifugasi pada
15.000 x rpm 4○C selama 20 menit. Pelet
dicuci sebanyak 2 kali dengan 1,8 mL
dapar pengendap. Kemudian pelet
diresuspensi menggunakan dapar lisis
secukupnya lalu ditambahkan protease
inhibitor 1:1.000. Lysate protein
disimpan dalam freezer -80○C sebelum
digunakan untuk analisis protein
selanjutnya.
Kuantifikasi Protein
Lysate protein sebanyak 0,5 mL
dimasukkan kedalam tabung reaksi,
ditambahkan 5 mL reagen Lowry,
dihomogenkan menggunakan vortex
kemudian diinkubasi selama 10 menit
pada suhu 50○C. Setelah itu, campuran
ditambahkan larutan Folin Ciocalteu 1:1
sebanyak 0,5 mL, diinkubasi kembali
selama 10 menit pada suhu 50 ○C.
Absorbansi sampel diukur menggunakan
spektrofotometer pada panjang
gelombang 630 nm. Konsentrasi sampel
dihitung dengan menggunakan kurva
standar protein BSA.
Elektroforesis Gel Poliakrilamida
Lysate protein dimasukkan kedalam
tabung 1,5 mL, ditambahkan sample
buffer dengan perbandingan 1:1.
Campuran didenaturasi pada suhu 95○C,
kemudian segera dinginkan (snap freeze)
sebelum dilakukan elektroforesis. Setelah
itu, gel disiapkan. Sisir yang menempel
pada gel dilepas, kemudian gel
dimasukkan kedalam alat elektroforesis
dan running buffer dituangkan hingga
batas maksimal yang tertera pada alat
elektroforesis. Sampel (hasil denaturasi
protein) dimasukkan 15 μL kedalam
sumur gel yang telah disiapkan. Voltase
kontrol diatur selama 30 menit dengan
tegangan 80 V, diteruskan sampai semua
sampel terkumpul pada batas bawah
stacking gel. Setelah sampel memasuki
batas separating gel, voltase dinaikkan
menjadi 100 V selama 1 jam sampai
sampel menyentuh dasar gel.
Pewarnaan Protein (Coomassie Blue)
Untuk melihat keberhasilan pemisahan
protein, gel hasil elektroforesis
3
dipindahkan kedalam wadah, dicuci
dengan akuades 3x5 menit. Kemudian
dilakukan pewarnaan dengan
menggunakan Coomassie Blue selama 1
jam. Setelah itu, dilakukan penghilangan
warna Coomassie Blue pada gel
menggunakan campuran metanol, asam
asetat glasial dan akuades selama
semalam.
Hasil dan Pembahasan
Ekstraksi Protein
Daun tanaman padi dihaluskan
menggunakan nitrogen cair hingga
menjadi serbuk dengan tujuan untuk
memperluas permukaan, mengurangi
terjadinya proteolisis dan degradasi
protein sehingga difusi sampel dengan
pelarut pada saat ekstraksi dapat berjalan
dengan optimal (Abdullah, et al. 2017).
Proses ekstraksi protein dilakukan
menggunakan metode Lin & Chang
(2014) yang telah dimodifikasi dengan
penghilangan bahan kimia fenol dalam
larutan dapar ekstraksi, penghilangan
tahapan pencucian pelet menggunakan
aseton dan pengeringan vakum. Fenol
digunakan dalam larutan dapar ekstraksi
sebagai pengikat protein dan untuk
mengurangi degradasi protein yang
dihasilkan dari aktivitas proteolitik dan
kemudian fase fenol dimurnikan dengan
larutan dapar pengendap. Menurut
Faurobert, et al. (2007) metode ekstraksi
protein menggunakan fenol memiliki
aktivitas yang baik untuk mengurangi
interaksi molekuler antara protein dan
bahan lain, namun fenol memiliki sedikit
kecenderungan untuk melarutkan
polisakarida dan asam nukleat
(Chatterjee, et al. 2012). Selain itu, fenol
termasuk kedalam bahan berbahaya yang
bersifat racun karena sulit diuraikan oleh
organisme sehingga dalam penelitian ini
larutan dapar ekstraksi dibuat tanpa
penambahan fenol. Sedangkan
penghilangan tahapan pencucian pelet
menggunakan aseton dan pengeringan
vakum bertujuan untuk mencengah
hilangnya protein yang lebih banyak pada
saat ekstraksi dan efisiensi waktu
ekstraksi protein. Pencucian dengan
aseton biasanya dilakukan untuk
membantu menghilangkan sisa garam,
polifenol, dan juga untuk mengurangi
terjadinya degradasi protein (Rodrigues,
et al. 2012). Pada dasarnya, larutan dapar
ekstraksi yang digunakan mengandung
Polivinilpirolidon (PVP) yang berfungsi
sebagai antioksidan, membentuk ikatan
hidrogen dengan polifenol untuk
menghilangkan senyawa polifenol dalam
sampel. Adapun tahap sentrifugasi
bertujuan untuk membantu proses
pemisahan antara protein (filtrat) dan
senyawa non protein (endapan).
Selanjutnya, dapar pengendap
ditambahkan kedalam filtrat untuk
mengendapkan semua protein. Pelet yang
didapatkan biasanya tidak berwarna,
yang menunjukkan bahwa tidak ada
kontaminasi dari senyawa non protein
(Wang, et al. 2008). Setelah itu,
dilakukan pencucian menggunakan dapar
pengendap untuk memastikan semua
protein terendapkan dan untuk
menghilangkan sisa senyawa non protein.
Selanjutnya, pelet diresuspensi
menggunakan dapar lisis dan
ditambahkan protease inhibitor untuk
menginaktivasi protease pada lysate
protein.
Kuantifikasi Protein
Pengukuran jumlah protein dilakukan
dengan metode Lowry. Prinsip metode
ini berdasarkan reaksi biuret, dimana
ikatan peptida protein bereaksi dengan
tembaga (II) yang direduksi menjadi
tembaga (I) dalam kondisi basa,
kemudian bereaksi dengan larutan Folin-
Ciocalteau, menghasilkan yang warna
biru yang diukur dengan
spektrofotometer menggunakan larutan
standar BSA (Waterborg, 2002). Hasil
kuantifikasi protein dari ekstrak daun
tanaman padi yang didapat sebesar
2.472,5 mg/L.
4
0.6
Absorbansi
0.4 f(x) = 0.09 x − 0.15
0.2
R² = 0.86
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Konsentrasi BSA (mg/L)
Gambar 1. Kurva Standar BSA menggunakan
Metode Lowry
Elektroforesis Gel Poliakrilamida
Untuk melihat protein daun tanaman
padi, digunakan teknik elektroforesis gel
poliakrilamida. Teknik ini biasa
digunakan untuk memisahkan protein
berdasarkan ukuran molekulnya
(Mittelmann, et al. 2013). Lysate protein
yang diperoleh kemudian ditambahkan
sample buffer lalu didenaturasi pada suhu
95○C. Sample buffer mengandung 2-
merkaptoetanol yang berfungsi untuk
memecah ikatan disulfida protein sampel.
Pada saat elektroforesis berlangsung,
sampel akan bermigrasi melalui gel dari
elektroda yang bermuatan negatif menuju
positif. Protein yang memiliki berat
molekul kecil akan bermigrasi lebih cepat
dibandingkan dengan protein dengan
berat molekul yang tinggi.
Pewarnaan Gel (Coomassie Blue)
Pemisahan protein hasil elektroforesis
dapat dideteksi dengan metode
pewarnaan gel. Pada penelitian ini, gel
hasil elektroforesis dilakukan pewarnaan
menggunakan Coomassie Blue. Metode
pewarnaan ini bekerja dalam pH asam
dimana terjadi pembentukan daya tarik
elektrostatik (bersamaan dengan gaya
van der Walls) antara kompleks molekul
pewarna dari Coomassie Blue dan
kelompok asam amino protein (Nehete,
et al. 2013).
Kualitas protein dari daun tanaman padi
secara keseluruhan baik, terlihat dari
hasil perwarnaan gel menggunakan
Coomassie Blue pada gambar 2.

M 1 2 3 4 5
90 kDa -
50 kDa -
34 kDa -
26 kDa -
20 kDa -
Gambar 2. Pemisahan protein daun tanaman padi pada
Gel Poliakrilamida 12% (M:Marker DNA , 1-7:Lysate
protein daun tanaman padi)
Kesimpulan
Optimasi teknik ekstraksi protein dengan
modifikasi larutan dapar ekstraksi
menjadi teknik yang sederhana, efisien
dan efektif untuk mengekstrak protein
total dari daun tanaman padi. Dari hasil
penelitian menunjukkan bahwa protein
dari daun tanaman padi (Oryza sativa L.)
dapat terekstraksi dengan baik terlihat
dari hasil kuantifikasi protein yang
didapatkan sebesar 2.472,5 mg/L, dan
hasil elektroforesis gel poliakrilamida
dimana protein terpisah sesuai dengan
ukuran proteinnya.
Ucapan Terima Kasih
Penelitian ini didanai oleh Hibah Internal
Unpad dalam skema Hibah RTKU
Gelombang I Tahun 2018. Penulis ingin
mengucapkan terima kasih kepada Ronny
Lesmana., dr., M.Kes., AIFO., PhD. atas
bimbingannya selama penelitian ini
berlangsung.
Daftar Pustaka
Abdullah, F. I., L. S., Chua & Z. Rahmat.
(2017). Comparison of protein extraction
methods for the leaves of Ficus
deltoidea. J Fundam Appl Sci, 9(2), 908-
924.
Chatterjee, M., Sumanti, G., Anirban, B.,
& Sampa, D. (2012). Optimization of an
Efficient Protein Extraction Protocol
Compatible with Two-Dimensional
Electrophoresis and Mass Spectrometry
6 7
from Recalcitrant Phenolic Rich Roots of
Chickpea (Cicer arietinum L.)
International Journal of Proteomics.
Volume 2012, Article ID 536963.
Faurobert, M., Pelpoir E., & Chaïb, J.
(2007). Phenol Extraction of Proteins for
Proteomic Studies of Recalcitrant Plant
Tissues. In: Thiellement H., Zivy M.,
Damerval C., Méchin V. (eds) Plant
Proteomics. Methods in Molecular
Biology, vol 355. Humana Press.
Gulcicek, E. E., Christopher, M.,
Colangelo, W. McMurray, Kathryn, S.,
Kenneth, W., Terence, W., & Hongyu, Z.
(2005). Proteomics and the Analysis of
Proteomic Data: An Overview of Current
Protein-Profiling Technologies Curr
Protoc Bioinformatics. July; 0 13:1-40.
Islam, N., M. Lonsdale, N. M.
Upadhyaya, T. J. Higgins, H. Hirano &
R. Akhurst. (2014). Protein extraction
from mature rice leaves for two-
dimensional gel electrophoresis and its
application in proteome analysis.
Proteomics, 4, 1903–1908.
Lin, D. & Chang, S. (2014). Extraction of
Total Proteins from Rice Plant. Bio-
protocol. Vol 4, Iss 21, Nov 05.
Lledías, F., Felipe H., Viridiana R.,
Abisaí G.M., Gladys I. C., Jorge N.S.
(2017). A Rapid and Reliable Method for
Total Protein Extraction from Succulent
Plants for Proteomic Analysis. Springer
Science+Business Media New York.
Mittelmann, N. Á., Eva, D. S., Eva,
M.G.C., Azahara, M. M., Juan, C. P. C.,
Sandra, P. L., Estefanía, S. C., Cristina,
T. J., Carmelo, R., Francisco, J. C., &
José, M. P. (2013). Polyacrylamide gel
electrophoresis: a powerful tool in the
food-processing sector. High School
5
Students of Agricultural Science
Research. Vol III.
Nehete, J. Y., Rajendra, S. B., Minal, R.
N., & Sonali, R. G. (2013). Natural
proteins: Sources, isolation,
characterization and applications.
Pharmacognosy Reviews, Vol 7, Issue
14.
Rodrigues, E. P., Adalgisa, R. T., Jesiane,
S. da Silva B., Luciano, H., &
Mariangela, H. (2012). A simple,
economical and reproducible protein
extraction protocol for proteomics studies
of soybean roots. Genetics and Molecular
Biology, 35, 1 (suppl), 348-352.
Vilhena, M. B., Monica, R. F., Daiana,
S., Giselle, C. & Ricardo, A. A. (2015).
Evaluation of protein extraction methods
for enhanced proteomic analysis of
tomato leaves and roots. Anais da
Academia Brasileira de Ciências, 87(3):
1853-1863.
Wang, W., Fuju, T., & Shaoning, C.
(2008). Optimizing protein extraction
from plant tissues for enhanced
proteomics analysis. J. Sep. Sci., 31,
2032 – 2039.
Waruwu, M. (2013). Analisis Profil
Protein. Diakses 6 Agustus 2018, dari:
http://matiusnana.blogspot.com/2013/12/
analisis-profil-protein.html.
Waterborg, J. H. (2002). The Lowry
Method for Protein Quantitation. In:
Walker J.M. (eds) The Protein Protocols
Handbook. Humana Press.
Wu, J., Dong, Y. L., Yiming, W., S. T.
Kim, Seong-Bum Baek, S. G. Kim, & K.
Y. Kang. (2014). Protein profiles
secreted from phylloplane of rice leaves
free from cytosolic proteins: Application
to study rice-Magnaporthe Oryzae
interactions. Physiological and Molecular
Plant Pathology, 88, 28-35.
Zhang,Y., Liang T., Xiaojun L., Leilei L.,
Weixing C., & Yan Z. (2017). Modeling
the leaf angle dynamics in rice plant.
PLoS ONE 12(2): e0171890.