11
Analisis Lipid Peroksida Hati
Pengukuran kadar lipid peroksida hati
dilakukan pada akhir perlakuan. Sebanyak 1-2
gram hati disimpan dalam larutan NaCl 0.9%
dingin. Hati segar tersebut dibuat 10% b/v
homogenat hati dalam larutan KCl 1.15%
dingin. Kemudian diambil sebanyak 0.1 mL
homogenat ke dalam tabung reaksi. Tahap
selanjutnya ke dalam tiap tabung ditambahkan
0.2 mL SDS 0.8% dan 1.5 mL asam asetat
20%, serta diatur pHnya dari 2.5 menjadi 3.5
oleh penambahan NaOH 1 M dengan
menggunakan pH meter. Selanjutnya
ditambahkan 0.7 mL akuades dan 1.5 mL
TBA 1.0% dalam pelarut asam asetat 50%,
kemudian dipanaskan ke dalam penangas air
mendidih pada suhu 95oC selama 60 menit,
selanjutnya didinginkan pada suhu ruang.
Tahap selanjutnya setiap tabung
ditambahkan 1 mL akuades dan 5 mL n-
butanol:piridin (15:1 v/v). Campuran diaduk
dengan vorteks, lalu disentrifugasi pada
kecepatan 4000 rpm (888 g) selama 10 menit.
Kemudian lapisan atas pada larutan diambil,
lalu serapannya diukur pada panjang
gelombang 532 nm dengan spektrofotometer.
Serapan yang terukur akan dimasukkan pada
persamaan garis dari kurva standar (y=a+bx)
sehingga diperoleh konsentrasi lipid
peroksida. Larutan blanko juga disiapkan
dengan menggunakan akuades yang diberi
perlakuan seperti larutan sampel.
Analisis Data (Mattjik & Sumertajaya
2000). Rancangan acak lengkap digunakan
pada rancangan penelitian ini. Analisis data
yang dilakukan dengan metode ANOVA
(analysis of variance) pada tingkat
kepercayaan 95% dan taraf α = 0.05. Jika
terdapat perbedaan dalam perlakuan, maka
dilakukan uji Duncan pada selang
kepercayaan 90%, taraf α = 0.1. Model
rancangan tersebut menurut Mattjik &
Sumertajaya (2000) adalah Yij = µ + τ +εi
Keterangan :
I = 1,2,......t dan j = 1,2,.......r.
Yij = Pengamatan pada perlakuan ke-i
dan ulangan ke-j.
µ = Pengaruh rataan umum.
Τ = Pengaruh perlakuan ke-i, i = 1,
2, 3, 4, 5.
εi = Pengaruh galat acak perlakuan
ke-i dan ulangan ke-j, j = 1, 2, 3,
4, 5.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Histopatologi Pankreas
Hasil pemeriksaan histopatologi organ
pankreas kelompok normal (kelompok 1)
menunjukkan bahwa tidak ada kelainan
nekrosis dan inflamasi yang terjadi. Pulau
Langerhans terlihat normal (Gambar 5a).
Jumlah Pulau Langerhans yang terdapat di
preparat sebanyak 12 buah. Jumlah ini
merupakan jumlah Pulau Langerhans
terbanyak.
Hasil pemeriksaan histopatologi organ
pankreas kelompok diabetes yang diinduksi
aloksan (kelompok 2) menunjukkan bahwa
terjadi hiperplasia dibagian duktus pankreas
(Gambar 5b). Jumlah Pulau Langerhans ada 9
buah. Jumlah ini lebih sedikit daripada jumlah
normal. Hal ini membuktikan bahwa induksi
aloksan mampu merusak pankreas hewan
coba yang ditunjukkan dengan berkurangnya
Pulau Langerhans dan terjadinya hiperplasia.
Hiperplasia merupakan keadaan
meningkatnya jumlah sel secara mitosis
(Underwood 1999) karena sel-sel tersebut
tidak dapat beradaptasi terhadap peningkatan
beban kerja untuk memproduksi insulin
(Corwin 2009) karena beberapa sel β telah
rusak karena pemberian aloksan.
Hasil analisis histopatologi terhadap
pankreas tikus kelompok 3 yaitu kelompok
diabetes yang kemudian diberi perlakuan
dengan glibenklamid (obat antidiabetes
komersial). Hasil analisis menunjukkan tidak
adanya kelainan nekrosis dan inflamasi
(Gambar 5c). Jumlah Pulau Langerhans ada 9,
jumlah ini lebih sedikit dibandingkan dengan
jumlah kelompok normal karena Pulau
Langerhans pankreas rusak oleh induksi
aloksan. Jumlah Pulau Langerhans kelompok
ini sama dengan jumlah Pulau Langerhans
kelompok diabetes, tetapi keadaan pankreas
lebih baik karena tidak terjadi kelainan
dikarenakan adanya induksi glibenklamid
yang merupakan obat antidiabetes komersial.
Hasil analisis hisptopatologi kelompok 4
yang merupakan kelompok diabetes yang
diberi perlakuan ekstrak etanol 70% daun
wungu dengan dosis 25 mg/kgBB
menunjukkan adanya inflamasi berupa
peradangan ringan dan ditemukannya limfosit
(Gambar 5d). Jumlah Pulau Langerhans
sebanyak 8 buah. Hasil ini menunjukkan
bahwa ekstrak dengan dosis 25 mg/kgBB
belum dapat memperbaiki pankreas yang
rusak oleh aloksan karena masih
ditemukannya inflamasi pada pankreas dan
jumlah Pulau Langerhans juga lebih sedikit

dibandingkan dengan kelompok normal. Dosis
25mg/kgBB masih terlalu kecil sehingga
belum memberikan perlindungan terhadap
pankeas. Selain itu ditemukannya limfosit
yang menunjukkan adanya benda asing yang
terdapat di pankreas sehingga limfosit (sel
darah putih) terdeteksi di pankreas.
Hasil analisis histopatologi kelompok 5
yang diberi perlakuan ekstrak etanol 70%
daun wungu dengan dosis 50 mg/kgBB
menunjukkan tidak ada kelainan nekrosis dan
inflamasi (Gambar 5e). Jumlah Pulau
Langerhans sebanyak 4 buah. Dosis 50
mg/kgBB sudah dapat memperbaiki pankreas
yang rusak akibat aloksan karena tidak adanya
kelainan yang ditemukan, tetapi jumlah Pulau
Langerhans sangat sedikit dibandingkan
jumlah normal.
Sel β Pulau Langerhans manusia akan
mengalami penurunan 10% dibandingkan
dengan normal setelah terjadi diabetes
mellitus tipe 1, sedangkan penurunan sel β
akan mencapai 50%-60% pada penderita
diabetes mellitus tipe 2 (Gepts 1981).
Penurunan jumlah Pulau Langerhans pada
penelitian ini disebabkan oleh kondisi diabetes
mellitus tipe 1 pada hewan coba yang
diinduksi aloksan.
Hasil analisis histopatologi kelompok 6
merupakan kelompok tikus diabetes yang
diberikan perlakuan ekstrak dosis 100
mg/kgBB menunjukkan bahwa tidak ada
kelainan nekrosis dan inflamasi pada pankreas
(Gambar 5f) dan terdapat 7 Pulau Langerhans.
Dosis 100 mg/kgBB telah mampu
Keterangan: tanda panah () = menunjukkan Pulau Langerhans.
Gambar 5 Histopatologi pankreas tikus. (a) kelompok normal, (b) kontrol negatif, (c)
kontrol positif, (d) dosis 25 mg/kgBB, (e) dosis 50 mg/kgBB, (f) dosis 100
mg/kgBB, (g) dosis 200 mg/kgBB.
12
memberikan perlindungan dan memperbaiki
pankreas yang telah dirusak aloksan tetapi
jumlah Pulau Langerhans masih lebih sedikit
dibandingkan kelompok normal.
Hasil analisis histopatologi kelompok 7
merupakan kelompok tikus diabetes yang
diberikan perlakuan ekstrak dosis 200
mg/kgBB menunjukkan tidak ada kelainan
nekrosis dan inflamasi yang terjadi dan
terdapat 7 buah Pulau Langerhans (Gambar
5g). Dosis ekstrak 200 mg/kgBB telah mampu
memperbaiki pankreas yang rusak akibat
diabetes mellitus tipe 1 tetapi jumlah Pulau
Langerhans masih lebih sedikit dibandingkan
dengan kelompok normal. Hasil analisis
histopatologis ini ditunjukkan pada Tabel 1.
Perbaikan pankreas pada kelompok
perlakuan yang diberikan ekstrak etanol 70%
daun wungu disebabkan oleh senyawa
flavonoid dan alkaloid yang dikandung daun
wungu yang mempunyai potensi antidiabetes
(Andayani et al. 2008). Hasil pengujian
histopatologi telah menunjukkan bahwa masih
terdapat kelainan dan inflamasi pada
kelompok diabetes dan kelompok yang
diberikan ekstrak 25 mg/kgBB. Hasil ini
belum cukup memberikan informasi tentang
kemampuan daun wungu dalam memperbaiki
keadaan Pulau Langerhans dan tingkat sekresi
insulin, sehingga diperlukan pengujian
selanjutnya. Pengujian yang dapat dilakukan
adalah teknik pewarnaan imunohistokimia
yang dapat mendeteksi kemampuan sel β
Pulau Langerhans untuk mensekresikan
insulin.
 13

Tabel 1 Gambaran histopatologi pankreas hewan coba

Jumlah Pulau
Kelompok percobaan Keterangan
Langerhans
Normal 12 T.D.K.N.I
Diabetes 9 Terjadi hiperplasia dibagian duktus pankreas
Glibenklamid 9 T.D.K.N.I
Ada inflamasi (peradangan ringan) dan
Dosis 25 mg/kgBB 8
ditemukannya limfosit
Dosis 50 mg/kgBB 4 T.D.K.N.I
Dosis 100 mg/kgBB 7 T.D.K.N.I
Dosis 200 mg/kgBB 7 T.D.K.N.I
Keterangan: TDKNI= Tidak ditemukan kelainan nekrosis dan inflamasi

Imunohistokimia Pankreas Hasil analisis imunohistokimia kelompok

Pengujian histopatologi telah
menunjukkan jumlah Pulau Langerhans dan
kondisi patologis pankreas secara umum.
Untuk mendeteksi insulin yang diekspresikan
oleh sel β Pulau Langerhans maka dilakukan
pewarnaan imunohistokimia.
Hasil analisis imunohistokimia kelompok
normal (kelompok 1) menunjukkan dari 12
Pulau Langerhans yang terdeteksi semuanya
mengekspresikan insulin dengan kuat. Pulau
Langerhans dari kelompok normal masih
dalam keadaan baik karena jumlahnya paling
banyak dan semua Pulau Langerhans
mengekspresikan insulin dengan kuat
(Gambar 6a).
Hasil analisis pada kelompok diabetes
(kelompok 2) menunjukkan bahwa dari 9
Pulau Langerhans yang terdeteksi hanya 2
Pulau Langerhans yang mengekspresikan
insulin dengan kuat, 4 Pulau Langerhans
mengekspersikan insulin dengan sedang, dan
3 Pulau Langerhans lainnya lemah
mengekspresikan insulin (Gambar 6b).
Aloksan telah merusak pankreas tikus
sehingga mengurangi kemampuan sel β
pankreas untuk menghasilkan insulin.
Aloksan dapat menghancurkan sel β
pankreas setelah 24 jam pemberian. Aloksan
akan bereaksi dengan agen-agen pereduksi
seperti sistein, asam askobat sehingga
menghasilkan radikal bebas anion superoksida
dan hidrogen peroksida. Hidrogen peroksida
kemudian dengan cepat berdifusi masuk ke
dalam membran sel dan mencapai lisosom
bila tidak didegenerasi oleh sistem antioksidan
tubuh (Dunn 1943 dalam Magdalena 2002).
Kelompok 2 merupakan kelompok kontrol
negatif yang hewan coba diinduksi aloksan.
Aloksan menyebabkan keadaan diabetes
mellitus dan menyebabkan berkurangnya
kemampuan sel β pankreas menghasilkan
insulin. Hasil yang menunjukkan lemahnya
sekresi insulin sesuai dengan teori yang ada.
3 yang merupakan kelompok kontrol negatif
menunjukkan dari 9 Pulau Langerhans
terdapat 7 Pulau Langerhans yang
mengekspresikan insulin dengan kuat, dan 2
Pulau Langerhans mengekspresikan insulin
dengan sedang (Gambar 6c). Jumlah Pulau
Langerhans kelompok 3 yang terdeteksi sama
dengan kelompok 2 yaitu 9 buah tetapi
kemampuan produksi insulin kelompok 3 jauh
lebih tinggi karena Pulau Langerhans yang
telah rusak oleh aloksan berhasil diobati oleh
glibenklamid yang merupakan obat
antidiabetes komersial.
Glibenklamid merupakan obat diabetes
mellitus yang bekerja dengan cara
meningkatkan sekresi insulin (Bailey &
Krentz 2010). Glibenklamid merupakan obat
oral dari turunan sulfonilurea. Pengobatan
dengan menggunakan glibenklamid secara
oral disarankan bagi penderita diabetes akibat
kerusakan sel β pankreas (Jones & Hattersley
2010). Hasil ini sesuai teori bahwa pemberian
glibenklamid pada kelompok 3 mampu
meningkatkan produksi insulin sel β pankreas.
Hasil analisis imunohistokimia kelompok
4 yang diberi perlakuan ekstrak daun wungu
dengan dosis 25 mg/kgBB menunjukkan dari
8 Pulau Langerhans terdapat 7 Pulau
Langerhans yang mengekspresikan insulin
dengan kuat, dan 1 Pulau Langerhans lainnya
mengekspresikan insulin dengan lemah
(Gambar 6d). Dosis 25 mg/kgBB ekstrak daun
wungu telah mampu meningkatkan sekresi
insulin tetapi dosis ini masih belum mampu
memperbaiki pankreas seutuhnya karena
masih terdapat inflamasi di pankreas
berdasarkan hasil pembacaaan histopatologi.
Hasil pembacaan imunohistokimia
kelompok 5 yang diberi perlakuan ekstrak
etanol 70% menunjukkan bahwa dari 4 Pulau
Langerhans yang terdeteksi semuanya
mengekspresikan insulin dengan kuat
(Gambar 6e). Sedangkan hasil pembacaan
 14

imunohistokimia untuk kelompok 6 yang daun wungu dosis 50 mg/kgBB merupakan

diberi perlakuan ekstrak daun wungu dosis
100 mg/kgBB menunjukkan dari 7 Pulau
Langerhans hanya 3 Pulau Langerhans yang
mengekspresikan insulin dengan kuat, 2 Pulau
Langerhans mengekspresikan insulin dengan
sedang, dan 2 Pulau Langerhans lemah
mengekspresikan insulin (Gambar 6f).
Hasil pewarnaaan imunohistokimia
terhadap pankreas tikus kelompok 7 yang
diberi perlakuan ekstrak daun wungu dengan
dosis 200 mg/kgBB menunjukkan bahwa 3
dari 7 Pulau Langerhans mengekspresikan
insulin dengan kuat, 2 Pulau Langerhans
mengekspresikan insulin dengan tingkat
sedang, 1 Pulau Langerhans tidak
mengekspresikan insulin (Gambar 6g).
Hasil pemeriksaan patologi pankreas
dengan pewarnaan histopatologi dan
imunohistokimia menunjukkan bahwa ekstrak
dosis yang memberikan hasil terbaik dalam
memperbaiki pankreas tikus yang diinduksi
aloksan karena semua Pulau Langerhans
kelompok 5 mengekspresikan insulin dengan
kuat dan tidak ada ditemukan kelainan
nekrosis dan inflamasi pada pankreas.
Meskipun dengan dosis 25 mg/kgBB
(kelompok 4) lebih banyak Pulau Langerhans
yang mampu mengekspresikan insulin dengan
kuat tetapi masih ditemukannya inflamasi dan
limfosit pada pankreas. Sedangkan jumlah
Pulau Langerhans yang mengekspresikan
insulin dengan kuat lebih sedikit pada
kelompok 6 (dosis 100 mg/kgBB) dan
kelompok 7 (dosis 200 mg/kgBB). Hasil
analisis ini terdapat pada Gambar 6 dan Tabel
2. Ekspresi insulin tingkat kuat, sedang, dan
lemah dinilai berdasarkan intensitas warna
yang dipancarkan.

Tabel 2 Gambaran ekspresi insulin pankreas hewan coba

Jumlah
Kelompok
Pulau Ekspresi insulin % Ekspresi insulin
percobaan
Langerhans
Normal 12 12 kuat 100
Diabetes 9 2 kuat, 4 sedang, 3 lemah 22.22
Glibenklamid 9 7 kuat, 2 sedang 77.78
Dosis 25 mg/kgBB 8 7 kuat, 1 lemah 87.5
Dosis 50 mg/kgBB 4 4 kuat 100
Dosis 100
7 3 kuat, 2 sedang, 2 lemah 42.8
mg/kgBB
Dosis 200 3 kuat, 2 sedang, 1 lemah, 1 tidak 42.8
7
mg/kgBB mengekspresikan insulin

Keterangan: tanda panah () = menunjukkan ekspresi pewarnaan insulin Pulau Langerhans.

Gambar 6 Ekspresi insulin pankreas dengan pewarnaan imunohistokimia. (a) kelompok

normal, (b) kontrol negatif, (c) kontrol positif, (d) dosis 25 mg/kgBB, (e) dosis 50
mg/kgBB, (f) dosis 100 mg/kgBB, (g) dosis 200 mg/kgBB.

Lipid Peroksida
Pengukuran kadar lipid peroksida hati
dilakukan untuk mengetahui kerusakan sel
hati. Kadar lipid peroksida merupakan
parameter awal kerusakan hati yang
disebabkan oleh adanya radikal bebas dalam
tubuh. Pengukuran lipid peroksida dilakukan
pada semua tikus kelompok percobaan. Hasil
analisis menunjukkan bahwa kadar lipid
peroksida tertinggi terjadi di kelompok
diabetes (kelompok 2) yaitu 5.43976 µg/mL
± 1.46, sedangkan kadar lipid peroksida
paling rendah pada kelompok yang diberi
ekstrak etanol 70% daun wungu dengan dosis
200 mg/kgBB yaitu sebesar 3.2786 µg/mL ±
2.78.
Kadar lipid peroksida semua kelompok
(Tabel 12) yaitu kelompok 1 (kelompok
normal) sebesar 3.8553 µg/mL ± 0.97,
kelompok 3 (kontrol positif) sebesar 3.55042
µg/mL ± 1.97, kelompok 4 (dosis 25
mg/kgBB) sebesar 4.1349 µg/mL ± 2.52,
kelompok 5 (dosis 50 mg/kgBB) sebesar
5.2222 µg/mL ± 1.58, dan kelompok 6 (dosis
100 mg/kgBB) sebesar 3.80286 µg/mL ±
2.72.
Kadar lipid peroksida kelompok diabetes
(kelompok 2) paling tinggi karena banyaknya
radikal bebas yang terbentuk akibat pemberian
aloksan dan tidak adanya obat atau sumber
antioksidan yang diberikan. Aloksan
merupakan agen pengoksidasi yang kuat.
Aloksan akan tereduksi menjadi asam dialurat
dan menghasilkan radikal bebas. Radikal
bebas inilah yang merusak sel β pankreas
sehingga mengurangi/menghilangkan
kemampuan untuk memproduksi insulin.
Pemberian ekstrak daun wungu pada
kelompok dapat menurukan kadar lipid
peroksida. Pemberian dengan dosis terbesar
(200 mg/kgBB) dapat menurunkan kadar lipid
peroksida dan kadar yang diperoleh lebih
kecil dibandingkan dengan kadar lipid
peroksida pada kelompok 3 yang diberi
perlakuan glibenklamid. Hal ini disebabkan
oleh kemampuan senyawa flavonoid dan
alkaloid ekstrak daun wungu sebagai
antioksidan.
Senyawa yang mampu menetralisir atau
mengurangi efek degeneratif lipid peroksida
secara umum dikenal sebagai antioksidan.
Antioksidan biasanya tersebar pada bagian
sitosol, mitokondria untuk melindungi organel
sel (Özbay & Dűlger 2002). Beberapa
flavonoid dilaporkan dapat menghambat lipid
peroksida secara enzimatis atau nonenzimatis.
Flavonoid seperti kuersetin dapat mengurangi
15
lipid peroksida di berbagai sistem biologis
(Letan 1996) seperti mitokondria, mikrosom
(Bindoli et al.1977; Cavallini et al. 1978) dan
kloloplast (Takahama 1983). Beberapa
penelitian yang dilakukan oleh Videla et al.
(1981), Younes dan Siegers (1981), Muller
dan Sies (1982), (Valenzuela & Guerra 1986)
melaporkan bahwa efek penghambatan oleh
katekin, kuersetin, dan flavonoid pada lipid
peroksida diukur secara in vitro dengan
metode kolorimetri terhadap pembentukan
asam tiobarbiturat.
Bindoli et al. (1977) melaporkan bahwa
silimarin (turunan flavonoid) melindungi
mitokondria dan mikrosom hati tikus dari
pembentukan lipid peroksida yang diinduksi
oleh Fe2+-askorbat dan NADPH-Fe3+-ADP.
Pengurangan kadar lipid peroksida secara
enzimatis oleh flavonoid melibatkan sistem
sitokrom p450 yang terdapat di hati (Bindoli
et al.1977; Cavallini et al. 1978).
Tahap enzimatis (proses biotransformasi)
runtuk membuang zat asing (xenobiotik)
terjadi di hati dengan 2 fase yaitu fase I dan
fase II. Fase I merupakan fase penambahan
gugus fungsi seperti –OH, –SH, –NH2, dan –
COOH. Fase II merupakan tahap konjugasi
zat asing untuk menigkatkan kelarutan zat
asing dalam air. Sitokrom p450 merupakan
coupled-enzyme yang terdiri dari dua enzim
yaitu NADPH-sitokrom p450-reduktase dan
enzyme yang memiliki gugus heme (Casarett
dan Doull 1986). Penghambatan nonenzimatis
terhadap lipid peroksida merupakan interaksi
lansung senyawa silimarin (flavonoid) dengan
radikal bebas penyebab lipid peroksida
(Bindoli et al.1977; Cavallini et al. 1978).
Senyawa flavonoid yang berperan sebagai
antioksidan dalam penelitian ini belum
diketahui, sehingga masih diperlukan
penelitian lanjutan untuk memurnikan dan
mengkarakterisasi senyawa flavonoid di
ekstrak etanol daun wungu. Penelitian
lanjutan untuk mengetahui mekanisme kerja
flavonoid sebagai antioksidan juga diperlukan.
Ekstrak daun wungu pada semua dosis yang
dilakukan dalam penelitian ini dapat
menurunkan kadar lipid peroksida jika
dibandingkan dengan kadar lipid peroksida
kontrol negatif, tetapi setelah dilakukan uji
ANOVA terhadap nilai penurunan lipid
peroksida oleh ekstrak diperoleh bahwa
penurunan oleh ekstrak daun wungu belum
memberikan pengaruh secara signifikan pada
tingkat kepercayaan 95% dan taraf α = 0.05
dan diperlukannya penggulangan pengukuran
kurva standar (Tabel 3 dan Gambar 7).