EKTRAKSI DAN PARTIAL PURIFI KATION

DARI ENZIM PEROKSIDASE DARI TANAMAN

UNTUK PELABELAN ANTIBODI

Dosen : Fathin Hamida,M.Si

Kelompok 3:
Rina Sinaga (17334018)
Tri Yuniati (17334019)
Vidya Retno Prabandari (17334020)
Anisa Fatriah (17334021)
 LANDASAN TEORI
Enzim adalah molekul biopolimer yang tersusun
dari serangkaian asam amino dalam komposisi dan
susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim
memegang peranan penting dalam berbagai reaksi
di dalam sel.
Sebagai protein, enzim diproduksi dan digunakan
oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi, antara
lain konversi energi dan metabolisme pertahanan
sel. Amilase mempunyai kemampuan untuk
memecah molekul-molekul pati dan glikogen
 ENZIM PEROKIDASE
• Enzim peroksida adalah enzim golongan
oksidoreduktase yaitu enzim yang mampu
mengkatalisis reaksi oksidasi atau reduksi
suatu bahan. Golongan ini dibagi lagi menjadi
2 sub golongan yaitu enzim oksidase dan
dehidrogenase.
• Peroksidase merupakan enzim oksidase yaitu
enzim yang dapat mengkatalisis reaksi antara
substrat dengan molekul oksigen
 Ekstraksi dan Partial Purifi kation dari Enzim
peroksidase dari sumber tanaman untuk Pelabelan
antibodi

Penelitian ini dilakukan dari November 2016 hingga

Mei 2017 di Mekelle untuk mengekstrak dan
memurnikan sebagian enzim peroksidase dari
Ipomoea batatas, Solanum tuberosum, Solanum
lycopersicum, Daucus carota dan Schinus molle untuk
digunakan dalam pelabelan antibodi.
 Sebagian pemurnian dilakukan dengan
presipitasi amonium sulfat bersama dengan dialisis
tubing dan aktivitas enzim tanaman ekstraksi adalah
ditentukan secara spektrofotometri.
Studi lebih lanjut tentang tumbuhan kaya
peroksidase alami dengan teknik canggih dan
percobaan konjugasi peroksidase tanaman iniuntuk
antibodi sebagai label untuk ELISA (Enzyme-linked
immunosorbent assay atau penetapan kadar
imunosorben taut-enzim) dianjurkan
 Tanaman adalah sumber peroksidase yang kaya
dan terutama ditemukandi akar dan kecambah dari
tumbuhan yang lebih tinggi.
Tanaman Peroksidase (POD) superfamili terdiri
dari glikoprotein yang mengandung heme yang
berbeda dalam struktur dan sifat katalitiknya.
Enzimnya hadir secara alami pada tanaman
seperti umbi kentang, lobak kuda, bit, kedelai,tomat,
pisang, pepaya, wortel, lobak, gandum, kurma, beats
dan stroberi
Enzim yang paling populer itu telah digunakan
dalam kit assay immunosorbent Enzyme-linked
alkalin fosfatase, lobak peroksidase dan β-
galaktosidase. Di antaranya peroksidase banyak
digunakan untuk menyiapkan antibodi-enzim
atau konjugat anti-antibodi-enzim
Peroksidase, enzim bioteknologik yang penting
adalah di mana-mana enzim yang termasuk kelas
enzim oksidoreduktase dan umumnya mengkatalisis
reaksi antara hidrogen peroksida sebagai
elektronakseptor dan berbagai macam substrat
melalui pembebasan oksigen.
 ELISA
• Enzim-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
adalah suatu teknik biokimia yang terutama
digunakan dalam bidang imunologi untuk
mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen
dalam suatu sampel
• Tes ELISA digunakan untuk mendeteksi zat
yang memiliki sifat antigenik terutama protein
 Pengumpulan tanaman dan persiapan
ekstrak enzim
Supernatan
Masing masing Ektrak
disaring dan
enzim kasar 100 gr dari
endapannya
setiap tanaman + 400 ml
dibuang

6000 RPM selama 15

menit

Mulai dari inaktivasi

didinginkan segera termal, aktivitas enzim,
ekstrak enzim kasar proteinisi dan aktivitas
dipanaskan pada (tempatkan dalam
ember es untuk 30 enzim spesifik dari
65°C selama 3 menit ekstrak akhir ditentukan
dalam bak air menit)
dan diawetkan pada -
20°C
 Pemurnian parsial dan dialisis
peroksidase

Ekstrak enzim
Amonium sulfat 5000 RPM 30 menit
kasar

Supernat dibuang dan

sedimentasi dilarutkan
dalam jumlah kecil dari
fosfat burd ered salin
 Estimasi protein dari ekstrak enzim
Total isi protein dari ekstrak diukur dengan biuret metode
menggunakan albumin serum Bovine sebagai standar
untuk kalibrasi. Konsentrasi yang berbeda dari Bovine
Serum Albumin (BSA) (0, 0,4, 0,8,1,2, 1,6 dan 2 mg / ml)
dan ekstrak tanaman dituangkan ke dalam tabung reaksi
dan pembacaan mereka diambil setelah penambahan
reagen biuret. Semua tabung diinkubasi pada suhu kamar
selama 20 menit dan membaca adalah diambil pada 540
nm. Konsentrasi protein dari ekstrak diperkirakan dari
pembacaan absorbansi mereka dengan menggambar
poin dengan proteinkonsentrasi BSA sebagai nilai x 'dan
absorbansi rata-rata mereka sebagai y ’nilai pada kertas
grafik.
 UJI ENZIM PEROKSIDASE
Pengenceran serum ekstrak enzim diperiksa untuk
peroksidase uji aktivitas. Tes dilakukan dengan menggunakan
Ortho-Phenylenediamine Dihydrochloride (OPD) sebagai
Substrat pada suhu kamar. OPD, di kehadiran enzim
peroksidase, bereaksi dengan hidrogen peroksida dalam satu
ke satu stoikiometri untuk menghasilkan 2, 3-
diaminophenazine, kuning. Senyawa oranye yang memiliki
daya serap maksimal 492 nanometer.
Formasi warna seperti itu bersama dengan
intensitasnya digunakan untuk menunjukkan ketersediaan
enzim target dengan konsentrasinya. Perubahan dalam
absorbansi pada 492 nm karena oksidasi OPD di hadapannya
hidrogen peroksida dan ekstrak enzim pada suhu kamar
dimonitor menggunakan Multiskan Spektrofotometer.
2H2O2 Plant Peroxidase 2H2O + O2
OPD + O2 Oxidized OPD (colored)

Larutan uji standar mengandung 0,4 mg / ml OPD, 0,01 ml

3% hidrogen peroksida, 0,09 ml air suling dan 0,1 ml ekstrak
enzim total 0,2 ml. Kontrol tes di mana enzim ekstrak atau substrat
digantikan oleh buff er yang dilakukan. Perubahan dalam
absorbansi dicatat untuk setiap 30 detik selama 5 menit selama
reaksi. Satu unit aktivitas peroksidase (u) mewakili jumlah enzim
yang mengkatalisis oksidasi 1 μmol OPD di 1 menit di bawah
kondisi pengujian.Total aktivitas enzim dari Tanaman dihitung
menurut sebagai berikut:
Unit / ml = perubahan absorbansi per menit x faktor
pengenceran x 1000 ml enzim yang
digunakan dalam pengujian.
Aktivitas peroksidase spesifik adalah rasio aktivitas enzim (u / ml)
untuk konsentrasi protein (mg / ml) yang dinyatakan dalam u / mg
protein dan itu dihitung .
 Analisis data
Data pada nilai absorbansi untuk setiap mentah dan
sebagian dimurnikan ekstrak enzim tanaman
disimpan dalam spreadsheet excel. Sederhana
Statistik deskriptif digunakan untuk menentukan
mean diff diff hasil. Semua tes pembacaan
dilakukan menggunakan Multi scan
spektrofotometri digabungkan ke komputer dan
printer. Nilai dilaporkan adalah rata-rata setidaknya
tiga penentuan independen. Semua ini dilakukan
dengan menggunakan paket statistik untuk ilmu
sosial versi soft ware 20.
 HASIL
Dari lima pabrik yang digunakan dalam penelitian ini, hasil maksimum dari
enzim peroksidase dalam ekstrak kasar diperoleh dari Ipomoea batatas yang 479 u* /
ml diikuti oleh Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Daucus carota dan Schinus
molle dengan hasil 355,42 u*/ ml, 278,05 u*/ml, 192,91 u*/ ml dan 4,89 u*/ ml
masing-masing. Setidaknya hasil aktivitas enzim ditemukan dari ekstrak kasar Schinus
molle.
 Diamati bahwa setelah pemurnian parsial, enzim aktivitas
Solanum tuberosum dan Solanum lycopersicum adalah nyata meningkat
dibandingkan dengan ekstrak enzim mentah. Ekstrak tanaman lain juga
meningkat dalam aktivitas setelah amonium presipitasi sulfat.
Kandungan protein dari masing-masing ekstrak enzim berkurang ke
tingkat yang lebih tinggi dari pemurnian parsial oleh amonium
presipitasi sulfat yang menunjukkan bahwa protein yang tidak perlu asin
keluar. Penurunan kadar protein diamati dari ekstrak Schinus molle.
Pengenceran serum dari setiap ekstrak enzim dilakukan, di
mana kentang peroksidase menunjukkan perubahan warna
yang dapat dideteksi dengan upto mata tanpa bantuan 10-7
pengenceran dan kerapatan optik dari 1,01 absorbansi. Ubi
dan tomat peroksidase juga menghasilkan 0,93 dan 0,97
absorbansi pada pengenceran yang sama, masing-masing.
Sedimen dan supernatan ekstrak enzim parsial yang
dimurnikan keduanya menunjukkan aktivitas peroksidase
dengan nilai tertinggi diamati dari sedimen semua ekstrak
tumbuhan. Namun, itu supernatan menunjukkan kandungan
enzim terendah bahkan di bawah minyak mentah ekstrak
tumbuhan.
Diukur secara spektrofotometri, dengan peningkatan reaksi
periode, tren konstan peningkatan nilai absorbansi dalam POD
di semua sumber diamati. Untuk memurnikan enzim yang
diinginkan, ekstrak itu mengalami saturasi 80% dengan
(NH4)2SO4. Itu adalah yang paling umum digunakan reagen
untuk mengaramkan protein karena kelarutannya yang tinggi
memungkinkan pencapaian solusi dengan kekuatan ionik yang
tinggi [26]. Peningkatan berarti dalam penyerapan minyak
mentah kentang, ubi jalar, tomat, wortel dan merica Peru
adalah 1,11, 0,74, 1,01, 0,1, dan 0,25, masing-masing setelah
langkah pemurnian parsial par. Demikian pula aktivitas POD
pada berbagai pengenceran dan pada selang waktu yang
berbeda bervariasi secara signifikan, yang menyetujui bahwa
semua sumber tanaman berbeda satu sama lain secara
signifikan. Ini adalah perbedaan yang luar biasa antara densitas
optik nilai-nilai yang dikaitkan dengan variasi dalam aktivitas
POD pada tanaman di hubungan dengan lokasi anatomi, usia
jaringan / tanaman, fisiologis aktivitas dan keadaan menjadi
segar atau terisi.
Dalam penelitian ini, semua ekstrak tanaman yang diuji
menunjukkan harapan ketersediaan aktivitas enzim
peroksidase di dalamnya. Hal tersebut menyiratkan tanaman
uji berpotensi menjadi sumber komersial enzim peroksidase di
masa depan. Poin penting lainnya adalah perbedaan utama
dalam aktivitas enzim dari sedimen dan supernatan dari
ekstrak. Hasil dari penelitian ini sesuai dengan [4] adalah
investigasi mereka menghasilkan aktivitas enzim utama yang
diperoleh dari sedimen di belakang sentrifugasi. Peroksidase
Gratis mengendap saat ditambahkan garam yang bersaing
untuk molekul air dalam pembentukan ikatan. Ini
membuktikan bahwa pengendapan oleh garam untuk
pemurnian protein adalah baik untuk mengisolasi mereka dari
larutan encer dari berbagai campuran. Jumlah minimum enzim
yang ditemukan dalam supernatan adalah mungkin karena
sentrifugasi efektif yang digunakan.
Penelitian sebelumnya menunjukkan pengaruh
pelarut dalam ekstraksi enzim dari bahan tanaman.
Melaporkan itu, pelarut organik lebih baik dalam
mengekstraksi peroksidase dari alam sumber
tanaman. Hal yang menarik dalam penelitian ini
adalah efek dari konsentrasi substrat (hidrogen
peroksida dan OPD) aktivitas peroksidase
menunjukkan bahwa aktivitas peroksidase meningkat
dengan peningkatan konsentrasi substrat yang sesuai
dengan titik saturasi maksimum sekitar 3% untuk
hidrogen peroksida dan 0,4 mg / ml untuk OPD,
menunjukkan bahwa situs aktif sudah jenuh substrat.
pH dari pelarut, suhu, jenis dan konsentrasi substrat juga
dapat memiliki pengaruh pada aktivitas peroksidase
tanaman [29]. Dilaporkan bahwa pemurnian peroksidase
dari Gongronema latifolium menggunakan Guiacol
sebagai substrat menghasilkan pemurnian yang lebih
tinggi lipat bila dibandingkan dengan OPD pada suhu
optimum 30oC dan pH 7 masing-masing. Pada penelitian
ini 80% saturasi (NH4)2SO4 adalah menemukan yang
terbaik di mana semua ekstrak menunjukkan aktivitas
enzimatik yang baik di belakang pemurnian [21].
Standarisasi nilai saturasi (NH4)2SO4 sebagai 50-85%,
sementara [30] memurnikan peroksidase dari biji yang
berbeda seperti lobak dengan presipitasi 35-90%. Temuan
dari [7] adalah 1,21 kali lipat pemurnian untuk kedelai
peroksidase menggunakan 85% yang sama nilai saturasi.
Perbedaannya mungkin karena kadar garam yang
digunakan untuk pemurnian atau konsentrasi garam dan
durasi kejenuhan untuk pemurnian.
Secara umum konsentrasi OPD (0,4 mg / ml) digunakan
dalam hal ini studi adalah sama dengan nilai yang
digunakan dalam tes enzim lainnya. Peroksidase aktivitas
yang ditunjukkan pada konsentrasi 0,25 g / ml ekstrak
tanaman adalah ditemukan sebanding dengan studi
canggih. PBS juga digunakan di tempat air suling dan
tidak menunjukkan perbedaan pada peroksidase
aktivitas. Campuran air suling dan ekstrak enzim adalah
digunakan sebagai kontrol negatif dengan tidak adanya
substrat dan tidak ada aktivitas peroksidase dan hasil
yang diperoleh dari penelitian ini adalah murni terkait
dengan kandungan enzim peroksidase dari setiap
tanaman.
Perubahan dalam pembacaan panjang gelombang
spektrofotometer adalah diuji pada semua ekstrak enzim
tanaman untuk mendapatkan hasil maksimum, adalah
492 nm menghasilkan pembacaan tertinggi. Th tidak
sesuai dengan Temuan [31] yang mendapat hasil
maksimum dengan membaca pada 460 nm dan [4] pada
panjang gelombang 470 nm. Ini menunjukkan bahwa
lingkungan kondisi mungkin memiliki pengaruh pada sifat
dan konsentrasi tanaman peroksidase. Ekstrak dari semua
tanaman pada konsentrasi 0,25 g / ml menunjukkan
aktivitas peroksidase sebelum dan sesudah langkah
pemurnian parsial.
Aktivitas enzim maksimum diperoleh dari Ipomoea batatas setelah
evaluasi ekstrak kasar 479 u / mg protein yang diikuti oleh Solanum
lycopersicum dengan 355,42 u / mg. Hasilnya ada di perjanjian dengan
POD ekstraksi dari limbah jeruk yang mengakibatkan 734,1 u / mg
protein [32], tetapi berbeda dari hasil [33] (14 u / mg). Ekstraksi
tanaman pada 0,1 mg / ml memang menunjukkan aktivitas enzim
minimum dengan kerapatan optik minimum. Pemurnian sebagian
parsial dengan 80% saturasi amonium sulfat, Solanum tuberosum
menunjukkan tinggi aktivitas enzim peroksidase dengan 2567,81 u /
mg protein yang menunjukkan bahwa langkah dialisis menghilangkan
banyak protein dan yang tidak diinginkan memperbaiki jalan menuju
produk enzim yang jernih. Hasilnya menunjukkan peroksidase yang
baru diekstrak ini sama aktifnya dengan yang paling umum
menggunakan enzim dalam konjugasi antibodi, Horseradish Peroxidase
Enzim (HRP), menuju substrat yang paling umum,
Orthophenylenediamine Dihidroklorida.
Dalam penelitian ini Solanum tuberosum telah
menunjukkan enzim peroksidase yang menjanjikan
aktivitas setelah beberapa dimurnikan oleh amonium
sulfat dan ini bisa menjadi sumber kaya peroksidase
untuk immunoassays enzim. Ipomoea batatas dan
solanum lycopersicum juga menunjukkan moderat
aktivitas enzim peroksidase. Peroksidase kentang dan ubi
jalar bisa disarankan sebagai kandidat pengganti
peroksidase lobak, terutama di Ethiopia di mana tanaman
ini bisa diperoleh murah dan cukup segar. Namun, Daucus
carota dan Schinus molle hanya menunjukkan
ketersediaan enzim sedikit.