Tugas Resume Jurnal

Hubungan antara Xilanase dengan Struktur Xilan

Oleh :
Kelompok 5 :
1. Nur Meili Zakyah (162520101012)
2. Sandy Pradipta (162520101019)
3. Dea Ajeng Pravita (172520101001)
4. Zahroh Istantini (172520101004)

Program Magister Bioteknologi

Pasca Sarjana Universitas Jember
2017
 Hubungan antara Xilanase dengan Struktur Xilan

1. Pendahuluan
Enzim xilanase digunakan secara komersial pada industri pulp kertas,
makanan dan pakan ternak. Xilanase merupakan enzim hidrolisis. Enzim xilanase
mampu mendegradasi polimer xilan dengan cara memutus ikatan antargugus pada
bagian tengah secara acak yang akan menghasilkan xilooligosakarida. Struktur
enzim xilanase dan substrat xilan telah banyak diketahui. Namun, masih sedikit
informasi mengenai pengaruh struktur xilan pada kinerja xilanase yang berbeda.
White et al. (1998) membandingkan empat xilanase dalam aplikasi pulp bleaching
dan menetapkan bahwa penampilan mereka cukup berbeda. Namun White et al.
(1998) tidak menentukan struktur substrat xilan dan tidak menghubungkan
perbedaan kinerja xilanase dengan struktur xilan tersebut. Sehingga penelitian ini
bertujuan untuk mengukur tingkat hidrolisis xilan oleh xilanase sebagai langkah
pertama untuk mengukur perbedaan kinerja antar xilanase (Liab et al., 2000)

2. Bahan dan Metode

2.1. Persiapan xylans terlarut
Pada tahap ini berfungsi untuk mempersiapkan xylan terlarut dari alam dan
mengetahui isolasi total polisakarida. Langkah-langkah yang dilakukan adalah
sebagai berikut. Dipersiapkan Birchwood Xylan (BWX), Oat Spelled Xylan
(OSX), Larchwood Xylan (LWX), Barley Husk Xylan (BHX), dan Yellow Poplar
Xylan (YPX). Masing-masing Xylan (1,0 g) dan 100 ml dari air deionisasi diaduk
dalam suhu (4°C) selama 24 jam. Campuran disentrifugasi pada 5000×g selama
20 menit dalam centrifugasi Beckman. Supernatan disaring melalui penyaring
Whatman. Larutan dikonsentrasi pada suhu 4°C yang dapat mengaduk sel dalam
membran YP3 dari 100 ml sampai kurang dari 10 ml sebanyak tiga kali. Setiap
kali air deionisasi digunakan untuk mengembalikan volume. Volume akhir dari
setiap larutan adalah 100 ml. Xylans terlarut disimpan pada suhu 4°C dan
digunakan untuk analisis komposisi karbohidrat dan pola keterkaitan glycosyl dan
pengukuran aktivitas xilanase. Berat kering dari xylans terlarut juga ditentukan
diikuti berdasarkan: larutan (10 ml) dikeringkan dalam oven pada suhu 102°C
selama 24 jam. Berat tersebut diambil, dan dikonversikan ke mg/ml. Setiap
volume dilakukan dalam rangkap dua. Kemudian didapatkan hasil akhir bobot
kering adalah sebagai berikut: BWX, 3,5 mg / ml ± 0,5; OSX, 2,7 mg / ml ± 0,1;
BHX, 3,3 mg / ml ± 0,3; LWX, 5.4 mg / ml ± 0,2; YPX, 1,5 mg / ml ± 0,3.
2.2. Analisis komposisi karbohidrat dari xylans terlarut
Pada tahap ini berfungsi untuk mengetahui total komposisi karbohidrat dari
xylans terlarut. Langkah-langkah yang dilakukan adalah sebagai berikut. Setiap
sampel xylan terlarut (100 μg) dihidrolisis dengan1,0 M metanol-HCl (500 μl)
selama 16 jam pada suhu 80°C dalam standar internal myo-inositol (20 μg).
Kelebihan metanol-HCl diuapkan pada suhu sekitar 40°C dengan aliran nitrogen,
dan metanol (250 μl) kemudian ditambahkan ke sampel dan dikeringkan dengan
aliran nitrogen lagi. Metilglikosida yang dilepaskan adalah N-asetilasi dengan
menggunakan campuran reagen asetilasi: metanol (200 μl), piridin (20μl), dan
anhidrida asetat (20 μl), selama 15 menit pada suhu 45°C. Sampel N-asetililasi,
setelah dikeringkan dengan aliran nitrogen, diturunkan dengan iodotrimethylsilane
(200 μl) selama 20 menit pada suhu 80°C. Sampel dikeringkan lagi dengan aliran
nitrogen dan diselesaikan pada kolom DB-1 (30 m; 0,25 × 0,25, id) GC-MS (gas
kroma tography/ mass spectrometry) menggunakan myo-inositol sebagai standar
internal. Kondisi suhu yang digunakan: suhu awal 160°C dinaikkan sampai 200°C
pada 2°C/menit dan kemudian meningkat menjadi 260°C pada 10°C/menit.
Standar turunan metilglikosida digunakan untuk identifikasi gula.
2.3. Analisis keterkaitan glikosil pada xylans terlarut
Pada tahap ini berfungsi untuk mengetahui gambaran struktur xylan dengan
melalui keterkaitan glikosil pada xylans terlarut. Langkah-langkah yang dilakukan
adalah sebagai berikut. Sampel xilan yang terlarut (100 μg) dimetilasi dengan
NaOH/Mel. Xilan yang dimetilasi diekstraksi dengan metilena klorida. Ekstrak
dikeringkan dan dihidrolisis dengan asam trifluoroasetat (500μl, 2M, 120°C)
selama 2 jam, dengan reduksi 500 μl larutan ammonium hidroksida 1,0M yang
mengandung 10mg/ml boraratuteridadium pada suhu kamar selama 3 jam. Sampel
yang diekstraksi diasetilasi dengan anhidrida asetat (250μl)/piridin (250 μl) pada
suhu 120°C selama 3 jam. Metoda alditol asetat yang dihasilkan secara parsial
dianalisis dengan GC-MS menggunakan kolom silika Sp2330 leburan (panjang
30m) dalam sistem GC-MS menggunakan myo-inositol sebagai standar internal.
Kondisi suhu yang digunakan: 2 menit pada suhu awal 80°C, meningkat menjadi
170°C pada 30°C/menit, kemudian sampai 240°C pada 40°C/ menit, dan ditahan
pada 240°C selama 5 menit.
2.4. Xilanase dan pemurniannya
Pada tahap ini berfungsi untuk memproduksi dan mempurifikasi enzim
xylanase. Langkah-langkah yang dilakukan adalah sebagai berikut. Thermatoga
maritima xylanase (TmX) diproduksi dan dimurnikan. Xilanase dari T. maritima
hipertermofil diklon ke strain Escherichia coli yang digunakan untuk produksi
enzim. E. coli dikultur dalam media 20-l yang terdiri dari tryptone 1%, ekstrak
ragi 0,5%, 0,5% NaCl, dan 50 mg/ml ampisilin pada suhu 37°C selama 16 jam.
Supernatan yang diperoleh melalui sentrifugasi dan lisis sel E. coli dijaga pada
suhu 85°C selama 1 jam untuk mendenaturasi protein nonthermostable.
Pendinginan dan sentrifugasi menjadikan supernatant untuk menghasilkan enzim
yang dimurnikan dengan kromatografi filtrasi gel (Sephacryl S-400) dengan
menggunakan buffer asetat 50mM (pH 5.5). TmX yang dimurnikan tanpa selulase
(endoglucanase, exoglucanase, dan þ-glucosi-dase), mannanase, arabinosidase,
dan þ-xylosidase.
Crude xilanase dari strain Orpinomyces pc2 (OpX) dan Aureobasidium
pullulans strain Y-2311-1 (ApX). OpX diproduksi dari cultivasi E. coli, di mana
gen xynA-2 dari jamur anaerobik Orpinomyces sp. strain PC2 yang dikloning.
Gen dan protein rekombinannya dengan masing-masing xynA-2 dan XynA-2
yang dipatenkan. ApX yang digunakan dalam penelitian ini hanya mengandung
domain katalitik xilanase pada protein yang dipatenkan. Budidaya E. coli
dilakukan pada fermentor yang mengandung 20 l media Luria-Bertani (1%
tryptone, 0,5% ekstrak ragi, 0,5% NaCl, dan 50 mg/l ampicillin, pH 6,5) pada
suhu 37°C. Selama budidaya, isopropil-þ-D-thiogalaktopiranosida (1mM)
ditambahkan saat densitas optik medium kultur mencapai 1,0 pada 600 nm.
Budidaya dilanjutkan untuk penambahan 4 jam. Sel yang dipanen dengan
sentrifugasi kultur disangga dalam buffer 20 mM sodium sitrat, dan pH 6.0.
Supernatan diperoleh melalui penghilangan puing-puing sel dengan sentrifugasi
pada 10.000×g selama 30 menit pada suhu 4°C. Enzim dimurnikan dengan
kromatografi filtrasi gel (Sephacryl S-400, 50 mM buffer Tris-HCl, pH 8.0) untuk
menghilangkan aktivitas trace þ-xylosi-dase dan arabinosidase. ApX dimurnikan
dengan homogenitas menggunakan kromatografi penukar ion (DEAE-Sephadex
A-50) dan kromatografi filtrasi gel (Sephadex G-75). Crude Xilanase II dari
Trichoderma longibrachiatum (TlX) disediakan oleh Iogen Corporation (Ottawa,
Kanada). TlX mentah dimurnikan dengan kromatografi filtrasi gel (Sephacryl, S-
400) dengan menggunakan buffer asetat 50 mM (pH 5.0) untuk menghilangkan
aktivitas sel (endoglucanase, exoglucanase, dan þ-glukosidase).
2.5. Uji xilanase pada xylans terlarut pada kondisi optimal
Pada tahap ini berfungsi untuk mengetahui kondisi optimal enzim xylanase
pada xylans terlarut. Langkah-langkah yang dilakukan adalah sebagai berikut.
Setiap enzim disesuaikan dengan 0,340-0,350 U/ml pada BWX terlarut pada pH
dan suhu optimal. Jumlah enzim ini kemudian digunakan pada semua substrat
pada saat yang sama yaitu pada kondisi optimal. Waktu pengujian selama 30
menit. Jumlah gula pereduksi yang dilepaskan dari xylans diukur dengan uji DNS
(3,5-dinitrosalicylic acid), seperti yang dijelaskan di bawah ini (hasilnya
ditunjukkan pada Tabel 4). Dengan menggunakan xilanase murni dan xylans
terlarut, mengatur dosis xilanase sampai 1,00 U/ml pada kondisi optimal untuk
setiap enzim pada BWX terlarut. Jumlah xilanase yang sama pada semua substrat
selama 10 menit dan mengukur gula yang dilepaskan dengan menggunakan uji
DNS (Hasil ditunjukkan pada Tabel 5). Kondisi optimal yang ditentukan untuk
xilanase terdaftar sebagai berikut: Y TmX pH = 5,5, suhu 92°C, 50 mM NaOAc
buffer Y OpX pH = 8.0, suhu 40°C, 50 mM Penampung Tris-HCl Y ApX pH =
5,0, 40°C, 50 mM NaOAc buffer Y TlX pH = 5.0, 50 ° C, 50 mM NaOAc buffer.
2.6. Uji DNS
Pada tahap ini berfungsi untuk mengetahui hasil dari uji DNS. Langkah-
langkah yang dilakukan adalah sebagai berikut. Tabung gelas 5 ml mengandung
0,5 ml xylan terlarut, buffer 0,4 ml, dan 0,1 ml enzim yang disesuaikan. Tabung
dipasang di penampung air pada saat yang tepat selama 10 menit, kemudian
ditambahkan larutan DNS (1 ml), dan tabungnya ditutup dengan marmer.
Campuran diuapkan selama 5 menit. Tabung dibiarkan dingin pada suhu kamar.
Absorbansi dibaca pada 575nm, dan dikoreksi dengan substrat (enzim
ditambahkan hanya setelah direbus). Aktivitas kemudian ditentukan dengan
menggunakan kurva standar xilosa, dan data dilaporkan dalam U/ml. Satu unit
xilanase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk melepaskan 1
μg xilosa per menit pada kondisi pengujian diatas.

3. Hasil dan Pembahasan

3.1 Komposisi karbohidrat pada xilan

a) Xylan BWX 94% mengandung xylose, standar substrat yang ideal untuk
aktivitas xilanase, selain itu juga mengandung sedikit glucose dan
galactose
b) Xylan OSX mengandung 2 karbohidrat dominan yaitu glucose dan
arabinose, selain itu juga mengandung sedikit glucose dan galactose
c) Xylan BHX memiliki komposisi karbohidrat yang sama dengan OSX,
tetapi BHX mengandung sedikit Rhamnose, glucoronic dan galacturonic
acid, BHX mengandung xilose lebih banyak dibanding OSX
d) Xylan LWX mengandung 3 jenis karbohidrat yaitu 47,5% xylose; 26,5
glucose dan 26% mannose
e) Xylan YPX mengandung xylose paling sedikit dibandingkan dengan 4
xylan lainnya dan mengandung komposisi karbohidrat yang heterogen
3.2 Pola Glikosil linkage pada xylan

3.3

3.3

3.3

3.3
3.3 R
a
s
i
o
xilose unit pada
xilan

a) Derajat subsitusi setiap xylan berbeda-beda , adapun urutannya adalah

sebagai berikut : OSX>YPX>BHX>BWX>LWX
b) Rata-rata jumlah residu xylose menunjukkan panjang rantai, semakin
besar nilainya maka semakin panjang rantainya,
c) Rantai terpanjang dimiliki oleh BWX dan LWX sedangkan rantai
terpendek adalah BHX

3.4 Aktivitas xilanase pada substrat xilan terlarut

Berikut ini adalah hasil pengukuran aktivitas xylanase dalam dua waktu yang
berbeda.
(30-min incubation)

(10-min incubation)

Aktivitas xylanase diukur pada dua waktu yang berbeda, yaitu 10 menit
dan 30 menit. hasil pengamatan menunjukkan bahwa setiap enzim memiliki
aktivitas yang berbeda-beda. Akivitas yang berbeda-beda didasarkan pada
ckarakteristik substrat berupa panjang rantai dan jumlah percabangan, bukan
hanya bergantung pada kadar xylan pada suatu substrat.

Aktivitas OpX dan TlX menunjukkan aktivitas yang hampir sama pada
substrat BWX, OSX, dan BHX. Aktivitas OpX dan TlX sedikit lebih rendah pada
substat LwX dan lebih rendah lagi pada substrat YpX. Hal ini disebabkan karena
YpX memiliki panjang rantai yang pendek (5,5) namun jumlah percabangan
relatif besar (12,7). Jumlah rantai yang pendek mempersulit interaksi antara
substrat dan enzim sehingga menyebabkan aktivitasnya rendah. Enzim ini
memproduksi xylan dari percabangan substratnya sehingga lebih menyukai
substrat dengan banyak cabang.

Aktivitas TmX paling baik terjadi pada substrat LwX. Hal ini dapat
menjadi indikasi bahwa ApX lebih mampu menghidrolisis substrat dengan
karakter rantai panjang (36.5) dengan sedikit percabangan (3.8). Aktivitas TmX
paling tidak efektif pada YpX, dimana YpX memiliki karakteristik rantai pendek
dengan banyak percabangan.

Aktivitas ApX paling baik terjadi pada substrat BwX dan paling tidak
efektif pada substrat LwX. Hal ini dapat menjadi indikasi bahwa ApX lebih
mampu menghidrolisis substrat dengan karakter rantai panjang (BwX : 36.5) dan
percabangan reatif besar (11.8). ApX mampu menghidrolisis xylan rantai panjang
dan tetap efektif pada percabangan. Sementara TmX mampu menghidrolisis xylan
rantai panjang namun tidak efektif pada percabangan.
4. Kesimpulan
a) Xylan paling banyak ditemukan dari sampel BwX (94,1%)
b) Xilanase terbaik umumnya adalah OpX
c) Efektivitas xilanase ditentukan oleh struktur xilan:
 Panjang rantai (dengan 8 xiloses paling lambat, hal ini mungkin dapat
diatasi dengan b-xylosidase. Panjang rantai 19 akan terhidrolisis
perlahan dengan beberapa xilanase);
 Tingkat substitusi, dengan, 5% lebih disukai untuk beberapa xilanase
dan memperlambat laju untuk yang lain.

Daftar Pustaka
Liab, K., Azadi, P., Collins, R., Tolan, J., Kim, J. S., & Eriksson, K. E. L. (2000).
Relationships between activities of xylanases and xylan structures. Enzyme
and Microbial Technology, 27(1–2), 89–94. https://doi.org/10.1016/S0141-
0229(00)00190-3