TUGAS

BIOKIMIA ENZIM

Disusun oleh:
Alfiana Aprilia 165090200111002
Ayu Elsa Oktavia 165090201111033
Deni Meliza Putri 165090201111001
Eldina Maya Sari 165090201111039
Frida Ramadhania 165090201111020
Hany Musfiroh 165090201111028

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
ALAM
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
2020
RESUME JURNAL:

Isolasi Dan Karakterisasi Xilanase Dari Bacillus Circulans

Krisna septiningrum, Maelita R. Moeis

1. PENDAHULUAN
Enzim merupakan biokatalisator yang berperan penting pada semua reaksi biokimia
dalam sistem kehidupan yang berlangsung di dalam sel mikroorganisme, tanaman, hewan,
dan manusia. Xilanase merupakan enzim ekstraseluler yang mempunyai kemampuan untuk
menghidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi xilosa. Xilanase merupakan salah satu contoh
enzim yang memiliki nilai komersial yang tinggi. Hal tersebut dikarenakan xilanase banyak
pemanfaatannya di berbagai industri pangan, pakan ternak, pemutih bubur kertas/pulp, dan
biokonversi lignoselulosa untuk bahan bakar Xilanase dapat diproduksi oleh beberapa
organisme seperti bakteri, alga jamur, aktinomistes, ragi, protozoa, gastropoda, dan
artropoda. Beberapa jenis bakteri dan jamur diketahui mampu menghasilkan xilanase
ekstraseluler yang dapat menghidrolisis hemiselulosa menjadi xilosa. Selain itu beberapa
mikroorganisme yang terdapat pada ruminansia diketahui berpotensial sebagai penghasil
xilanase karena hewan ruminansia tersebut mengkonsumsi hemiselulosa dalam jumlah besar.
Genus Bacillus diketahui sebagai penghasil xilanase yang aktif pada suhu 50 0C –
600C, dengan pH 7-9, sehingga enzim dari bakteri ini diharapkan dapat diproduksi dan
digunakan pada proses awal pemutihan pulp di industri pulp dan kertas. Penelitian yang
berhubungan dengan hal tersebut telah dilaporkan oleh beberapa peneliti seperti Khasin et al.
(1993), Nakamura et al.(1993), Blanco et al. (1995), Sunna et al. (1997) dan Sa-Pereira et al
(2002). Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan Bacillus circulans. Penelitian ini
diharapkan dapat mengatasi permasalahan ketersediaan enzim yang spesifik dan kendala
yang dihadapi dalam aplikasinya di industri pulp dan kertas. Pengembangan produksi dalam
skala komersial diharapkan dapat menciptakan kewirausahaan baru dan juga mendukung
perkembangan industri pulp dan kertas yang berwawasan lingkungan.

2. ALAT DAN BAHAN

2.1 Alat
 Rotary Shaker
 Kantung dialisis berbahan dasar selulosa (SIGMA CHEMICAL) dengan ukuran pori yang
dapat memisahkan protein minimal 12 kDa
 Refrigerated centrifuge
 Pengaduk magnetik
 Kolom kromatografi
 Avometer
 Spektrofotometer
 Waterbath
 Elektroforesis Mini Protean IixI (Bio Rad).

2.2 Bahan
 B. circulans yang berasal dari laboratorium Mikrobiologi, Sekolah Ilmu dan
Teknologi Hayati, ITB, Bandung.
 Bahan Utama:
o Ammonium sulfat
o NaHCO3
o Na2CO3
o Matriks DEAE-Toyopearl 650 M (Tosoh Corp, Tokyo, Jepang)
o NaCl
o Xilosa
o K3FeCN6
o Bovine serum albumin (BSA, Fraksi V, Merck)
o Basa Tris
o Glisin
o NaOH
o Poliakriamida
o Gliserol
o Bromofenol biru
o Congo Red
o Asam asetat
 Medium xilan:
o Pepton 0,5%
o Ekstrak ragi 0,5%
o K2HPO4 0,1%
o MgSO4.7H2O 0,02%
o Xilan oat spelt 0,5% (Sigma Chemical)
o pH medium diatur 10,5 dengan Na2CO3 1%
3. METODE
3.1 Isolasi Xilanase
A. Pembuatan Kurva Tumbuh dan Kurva Aktivitas Xilanase dari B. Circulans.

Isolat B. Circulans
- Ditumbuhkan pada medium xilan
- Diinkubasi selama 80 jam

Sampel

Diambil sampel Diambil sampel Diambil sampel

sebanyak 3 mL sebanyak 3 mL sebanyak 3 mL
setiap 2 jam setiap 6 jam setiap 12 jam
sekali sampai sekali sampai sekali sampai jam
jam ke-24 jam ke-60 ke-80

-
- Dihitung jumlah koloni dan aktivitas
xilanasenya
- Dibuat kurva pertumbuhan dan aktivitas
xilanase

Kurva Pertumbuhan dan

Aktivitas Xilanase

B. Produksi Xilanase
Kultur B. Circulans

- Diinokulasikan dalam medium xilan

- Diinkubasi pada suhu 37oC, dishaker dengan
kecepatan 200 rpm selama 18 jam

Hasil
- Disentrifugasi kecepatan 8000 gram selama
10 menit suhu 4oC

Ekstrak kasar xilanase

3.2 Pemurnian Parsial Xilanase
Seluruh tahapan pemurnian dilakukan pada suhu 4oC.

a) Fraksinasi bertingkat dan dialisis

Ekstrak kasar xilanase

- Difraksinasi bertingkat dengan ((NH4)2SO4)

Larutan persen saturasi 0-20, 20-

40, 40-60, 60-80, dan 80-100
- Diaduk dan disentrifugasi dengan kecepatan
12.000 rpm selama 25 menit

Endapan

- Dilarutkan dalam buffer NaHCO3-Na2CO3 25

mM pH 9,3

- Didialisis dalam 4,8 L buffer NaHCO3-

Na2CO3 selama 24 jam

Enzim Xilanase
 b) Kromatografi Penukar Ion
Kromatografi dilakukan dengan menggunakan bahan pendukung DEAE-Toyopearl 650 M
yang telah disetimbangkan dengan buffer NaHCO3-Na2CO3.

Filtrat hasil dialisis

Dialirkan ke dalam kolom

Dielusi dengan menggunakan larutan NaCl (0-450 mM) dalam buffer NaHCO3-Na2CO3
fraksi hasil pemisahan

Diuji Diukur
aktivitas kadar
xilanase protein

Uji Aktivitas Xilanase

Aktivitas xilanase diuji dengan mengukur jumlah gula pereduksi dari substrat xilan dengan
menggunakan metode Ferisianida Alkali

Substrat xilan oat spelt 1-3%

Dipipet sebanyak 150 µL ke dalam buffer Na2CO3-NaHCO3 25-100 mM (pH 10,5)

Diinkubasi pada suhu 39 ºC selama 30 menit

Ditambahkan 600 µL ferisianida alkali dan dididihkan selama 10 menit

Ditambahkan 4 mL air

Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 420 nm

Nilai absorbansi xilanase

Satu unit (U) aktivitas xilanase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan
1 µmol gula pereduksi (xilosa) per menit dengan xilan sebagai substrat.

- Pengukuran Kadar Protein

Kadar protein diukur dengan metode Bradford dengan menggunakan bovine serum albumin
(BSA, Fraksi V; Merck) sebagai standar.
Karakterisasi Xilanase
- Penentuan pH dan Suhu Optimum

Penentuan pH optimum dilakukan dengan menguji aktivitas xilanase pada rentang pH 8 –

10 dengan rentang pH 0,5. Untuk penentuan pH optimum digunakan dua jenis buffer yaitu
buffer Tris-Cl untuk pH 8 dan buffer Glisin-NaOH untuk pH 8,5-10.

Penentuan suhu optimum dilakukan dengan menguji aktivitas xilanase pada rentang
suhu 30-90ºC selama 30 menit dengan rentang 10ºC pada pH optimum yang diperoleh

- Analisis Zimogram

Sampel enzim dielektroforesis dengan native gel poliakrilamida 10 % selama 4-5 jam dalam
kondisi dingin (4-8ºC)

Enzim

Dicampur dengan sampel buffer 5x yang mengandung Tris-Cl 312,5 mM pH 6,8,

gliserol 50% (v/v) dan Bromofenol biru 0,05%

Sampel sebanyak 10-36 µL dimasukkan ke dalam sumuran

Dielektroforesis dengan arus sebesar 24 mA pada double strength running buffer

(pH 9)

Gel dielektroforesis pada Mini Protean IIxI (Bio Rad) dengan tanki elekroforesisi
vertikal

Gel direndam di dalam buffer Glisin-NaOH 100 mM pH 8,5 dengan substrat xilan
0,1% pada suhu 50ºC selama 20-30 menit

Gel diwarnai dengan Congo Red 0,1% selama 15 menit pada suhu ruangan

Gel dibilas menggunakan larutan NaCl 1 M sampai kelebihan warna pita hilang

Gel dibilas kembali menggunakan asam asetat 0,5%

Zona bening dengan

latar belakang biru
gelap menujukkan
adanya aktivitas enzim
xilanase
4. PEMBAHASAN
4.1 Isolasi xilanase
Pada penelitian ini digunakan B.circulans sebagai penghasil xilanase. Berdasarkan
jumlah koloni yang diperoleh, diketahui umur inokulum yang digunakan untuk menghasilkan
xilanase yaitu 18 jam dilihat dari kurva pertumbuhan. Untuk menghasilkan xilanase
digunakan suhu 37oC, pH 10,5 dengan pengadukan 200 rpm selama 18 jam. Jumlah inokulum
bakteri yang digunakan yaitu 10% (v/v). Xilanase yang dihasilkan memiliki aktivitas tertinggi
dan mempunyai waktu fermentasi yang singkat pada jam ke-18. Berdasarkan hasil yang
diperoleh, aktivitas tertinggi pada jam ke-18 dan jam ke-36 (0,378 U/mL enzim). Pada
kondisi ini, ekstrak kasar yang diperoleh yaitu 100 mL dengan menggunakan medium 100
mL. Hal ini menunjukkan xilanase yang dihasilkan mencapai rendemen 100%.

4.2 Pemurnian Parsial Xilanase

Enzim xilanase dari B. circulans diperoleh melalui pemisahan dan pemurnian parsial,
artinya enzim yang diperoleh tidak benar-benar murni. Kemudian hasil isolasi berupa ekstrak
kasar xilanase B. circulans difraksinasi bertingkat dan menghasilkan lima fraksi. Hasil
fraksinasi menunjukkan bahwa xilanase dapat mengendap pada seluruh tingkatan fraksinasi
yang digunakan ditunjukkan dengan adanya aktivitas enzim pada tiap fraksi (Tabel 1).
Kemudian fraksi-fraksi hasil pemekatan garam ammonium sulfat didialisis untuk
menghilangkan ammonium sulfat dan molekul kecil dengan berat molekul rendah.

Dari tabel 1 dapat dilihat bahwa xilanase mulai mengendap pada konsentrasi garam
dengan persen saturasi 0-20, dan pengendapan protein semakin meningkat seiring
meningkatnya persen saturasi. Hasil uji aktivitas spesifik tertinggi ditunjukkan pada aktivitas
xilanase dengan saturasi 20-40% yaitu sebesar 585,12 U/mg, sehingga sampel pada fraksi 20-
40% yang telah didialisis digunakan untuk proses pemurnian lebih lanjut menggunakan
kromatografi kolom penukar anion. Setelah sampel dialirkan kedalam kolom, sampel dielusi
secara bertahap menggunakan NaCl (0-450 mM) dalam buffer NaHCO3-Na2Co3 25 mM, pH
9,3 sehingga diperoleh 40 fraksi, dan diukur aktivitas enzim spesifiknya. Hasil pemisahan
protein dengan kolom penukar anion menunjukan puncak aktivitas tertinggi pada fraksi ke-14
dengan aktivitas spesifik sebesar 805,48 U/mg.

Dari tiga tahapan pemurnian (Tabel 2) dapat dilihat bahwa pemurnian xilanase
dengan fraksinasi (NH4)2SO4 dengan saturasi 30-40% menunjukkan peningkatan aktivitas
spesifi menjadi 585,12 U/mg dengan tingkat kemurnian 34 kali lipat dibanding ekstrak kasar
hasil isolasi. Hasil pemurnian kromatografi penukar anion menunjukkan peningkatan
aktivitas spesifik menjadi 805,48 U/mg dengan tingkat kemurnian 46,8 kali lipat jika
dibandingkan dengan ekstrak kasarnya.

4.3 Karakterisasi Enzim Xilanase

Gambar 2. Pengaruh pH (A) dan suhu (B) terhadap aktivitas enzim xilanase hasil pemurnian parsial

Karakterisasi enzim xilanase dengan menggunakan enzim hasil pemurnian parsial

(fraksi 14) dengan parameter pH dan suhu. Zimogram dilakukan untuk mengetahui
keragaman xilanase dari setiap tahapan pemurnian yang dilakukan, pH dan suhu berpengaruh
terhadap aktivitas xilanase. Xilanase B circulans memiliki rentang pH yang cukup luas yaitu
8,5-10, dengan aktivitas maksimum pada pH 9,5 (Gambar 2A). pH optimum xilanase hasil
pemurnian ini lebih tinggi jika dibandingkan dengan xilanase B circulans AB 16 (Xyl A dan
Xyl B) yang memiliki pH optimum 6,0-6,5 dan aktivitas xilanase cenderung menurun seiring
meningkatnya pH yang digunakan (% penurunan 27% - 52% untuk pH 8,0 dan 50%-61%
untuk pH 9,0) sehingga menunjukkan xilanase diperoleh memiliki keunggulan karena
mempunyai pH optimum lebih tinggi.
Pengaruh suhu terhadap aktivitas xilanase dilakukan dengan menginkubasi xilanase
pada berbagai rentang suhu selama 30 menit pada pH 9,5 (Gambar 2B). Xilanase B circulans
memiliki rentang suhu yang cukup luas yaitu 40 0C-800C dengan aktivitas maksimum pada
suhu 800C. Karakteristik yang sama juga diperoleh dari xilanase (Xyl A dan Xyl B) dari B
circulans AB 16 yang menunjukkan aktivasi tertinggi pada suhu 750C-800C. Perbedaan
aktivitas enzim terhadap suhu dan pH yang digunakan pada penentuan pH dan suhu optimum
dapat terjadi karena adanya perbedaan interaksi kimia yang terjadi pada protein. Interaksi
kimia menyebabkan perubahan konformasi protein yang berpengaruh terhadap stabilitas dan
aktivitas suatu protein. Stabilitas dan aktivitas suatu protein dipengaruhi oleh keadaan
lingkungan mikro protein dan distribusi asam amino bermuatan pada permukaan protein.
Modifikasi pada protein dapat meningkatkan interaksi pada protein sehingga protein tersebut
menjadi lebih rigid dan stabil pada suhu dan pH tinggi, sehingga enzim tidak terdenaturasi.
Analisis menggunakan metode zimogram dilakukan untuk mengetahui keragaman xilanase
pada setiap tahapan pemurnian yang dilakukan. Keragaman enzim terjadi karena adanya
isoenzim. Produksi isoenzim pada mikroba agar bisa menghidrolisis substrat xilan, gen
isoenzim ditemukan dalam bentuk polisistronik maupun non-polisistronik dalam beberapa
salinan dalam genom.

Gambar 3. Hasil zimogram dari ekstrak kasar (A), fraksinasi

saturasi 20-40 % (B) dan fraksi 14 (C)

Hasil Zimogram dari sampel hasil fraksinasi

dengan saturasi 20-40% dan kromatografi penukar ion
(fraksi 14) (Gambar 3) menunjukkan adanya dua jenis
xilanase. Hasil zimogram digunakan untuk menjelaskan adanya dua puncak aktivitas pada
penentuan suhu optimum. Kedua xilanase diduga isoenzim karena kedua protein mengendap
pada fraksi yang sama (% saturasi 20-40). pH optimum xilanase yang diperoleh (pH 9,5),
mungkin pH dari kedua xilanase B circulans (Xyn A dan Xyn B) pada fraksi 14 mendekati
nilai pI akibatnya kedua protein dapat mengendap pada fraksi yang sama. Titik isoelektrik
suatu protein tercapai, permukaan protein akan terhidrasi akibatnya protein memiliki
kelarutan yang rendah sehingga mudah mengendap.

5. KESIMPULAN
Enzim xilanase dari B circulans telah dapat dihasilkan pada suhu 370C dengan
pengadukan 200 rpm selama 18 jam dengan rendemen 100 %. Enzim xilanase dimurnikan
secara parsial melalui tahap fraksinasi ammonium sulfat (saturasi 20-40 %) dan kromatografi
penukar ion DEAE-ToyoPEARL. Pemurnian parsial menunjukkan peningkatan aktivitas
spesifik (805,48 U/mg) dengan kemurnian 48 kali. Karakterisasi enzim menunjukkan
xilanase dari B circulans memiliki pH optimum 9,5 dan suhu optimum 800C.