Parlan

240120190501
Enzim dan Mikrobial
ISOLASI BAKTERI PENGHASIL ENZIM LIPASE DARI COCO BUTTER
SUBTITUTE DAN KARAKTERISASI LIPASENYA

Ivonne Telussa
Jurusan Kimia, FMIPA Universitas Pattimura
Jl. Ir. M. Putuhena-Kampus Poka Ambon
ivont@ymail.com
Prosiding FMIPA Universitas Pattimura 2013 – ISBN: 978-602-97522-0-5

Alat

Gelas kimia, gelas ukur, tabung reaksi, labu takar, labu Erlenmeyer, batang

pengaduk, dan pipet tetes), neraca analitis (Ohaus), jarum oose, botol semprot,

spatula, cawan petri, shaker (Rossi), pipet mikro 100-1000 µL, 10-100 µL, dan 1-10

µL (effendorf, Jerman), spektrofotometer UV-Vis (Spectronic 20 Genesys),

Bahan

Bacto agar, pepton, beef extract, dan NaCl, pepton,, CaCl2, tween 20,

KH2PO4, p-nitrofenol (sigma), p-nitrofenilpalmitat (sigma), asetonitril (sigma), etanol

(sigma), etanol 70% (teknis), BSA (sigma), tris-base (merck), HCl (merck), glisin

(merck), metanol (merck), asam asetat glasial (merck), minyak zaitun (market stock),

rhodamin B, ammonium sulfat (merck).

Prosedur Kerja

1. Screening Mikroorganisme Lipolitik

Bakteri diisolasi dari Sampel coco buter subtitute pada nutrient broth cair dan

diinkubasi pada 370C 150 rpm selama 24 jam. Bakteri dipindahkan secara aseptik

pada tabung reaksi yang berisi medium cair Nutrient broth 1 mL secara kontinyu

pada 5 tabung dimasukkan sebanyak 10 μL dan kemduain diinokulasikan ke media

padat Nutrient broth, diinkubasi pada 370C. Bakteri pada media rhodamine B
Parlan
240120190501
Enzim dan Mikrobial
kemudian diinkubasi pada temperatur 37ºC selama 2-8 hari, kemudian diamati

dibawah sinar UV. Diagram proses dapat dilihat pada gambar 1.

2. Produksi Enzim Lipase

Koloni tunggal bakteri diinokulasi pada 20 mL media Nutrient broth cair,

kemudian diinkubasi dalam shaking inkubator pada temperatur 37ºC dan kecepatan

150 rpm selama 24 jam untuk dijadikan starter. 0,1 mL starter dipindahkan ke 100

mL media Nutrient Broth cair yang telah ditambahkan olive oil dan tween 80 sebagai

surfaktan. Kemduian diinkubasi dalam shaking incubator pada temperatur 37ºC dan

kecepatan 150 rpm selama 16 jam. Untuk memisahkan sel bakteri dengan enzim

maka dilakukan sentrifuga pada 12000xg selama 20 menit pada temperatu 4ºC.

Diagram proses dapat dilihat pada gambar 2 dan 3.

3. Uji Aktivitas Lipase

Selama melakukan pembuatan kurva pertumbuhan, pada setiap pengukuran

OD diambil pula 1 mL kultur pada media Nutrient Broth yang diukur tersebut untuk

diuji aktivitas optimumnya. Media ini dimasukkan dalam tabung Eppendorf 1,5 mL

dan kemudian disentrifuga pada 12000xg selama 15 menit dengan menggunakan

mikrosentrifuga (Micro 22R, Zentrifugen) pada temperatur 4ºC. Selanjutnya

supernatan dipindahkan pada tabung Eppendorf 1,5 mL steril baru. Aktivitas enzim

pada fasa supernatan kemudian diuji dengan menggunakan substrat pNP-palmitat

yang dilarutkan dalam asetonitril hingga konsentrasinya 10 mM. Substrat ini

kemudian ditambahkan dengan etanol dan bufer kalium fosfat (pH 7.5) sehingga

komposisi akhirnya adalah asetonitril : etanol : bufer = 1 : 4 : 95 (v/v/v). 0,6 mL

larutan campuran tersebut kemudian ditambahkan dengan 0,4 mL enzim

Parlan
240120190501
Enzim dan Mikrobial
(supernatan hasil sentrifuga) dan diinkubasi pada temperatur 55ºC dengan

menggunakan water bath selama 15 menit. Absorban larutan ini kemudian diukur

pada panjang gelombang 405 nm dengan menggunakan Spectronic 20 Genesys.

Diagram proses dapat dilihat pada gambar 4.

Parlan
240120190501
Enzim dan Mikrobial
Parlan
240120190501
Enzim dan Mikrobial
Gambar 1. Proses isolasi bakteri Lipolitik

Gambar 3. Proses extraksi Lipase

Gambar 2. Proses Isolasi Lipase

Parlan
240120190501
Enzim dan Mikrobial
Gambar 4. Pengujian aktivitas

Lipase
Parlan
240120190501
Enzim dan Mikrobial
ISOLATION AND ACTIVITY TEST OF THERMO STABLE LIPASE ENZYME
FROM THERMOPHILIC BACTERIA POST MERAPI ERUPTION

Drajat Pramiadi, Evy Yulianti, dan Anna Rakhmawati

J. Sains Dasar 2014 3(1) 9 - 19

Alat dan Bahan

Media NA, NB, minyak zaitun, Rhodamine-B, aquades, aseton :

ethanol

(1:1), 0,05M NaOH, buffer fosfat, phenolphtalien 1%, aluminium foil,

kasa, kapas steril.

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol sampel steril,

thermometer, pH meter, forteks, water bath, Bunsen, pipet ukur,

jarum ose, petridish, tabung reaksi, autoklaf, incubator, gelas objek,

erlemeyer, hot plate, magnetic stirrer, oven, test tube, mikroskop,

kamera foto, spektrofotometer, sentrifus, jangka sorong.

Prosedur Kerja

1. Isolasi Bakteri

Isolasi bakteri dilakukan dengan metode cawan tuang (pour plate method)

pada media agar (NA) yang mengandung 10% minyak zaitun dan 0,1 % Rhodamine-

B. Selanjutnya kultur dituangkan pada cawan petri steril dengan penambahan media

agar yang mengandung Rhodamine-B, kemudian diinkubasi pada suhu 55º C

sampai tumbuh koloni bakteri. Aktifitas lipolitik diidentifikasi dengan terbentuknya

Parlan
240120190501
Enzim dan Mikrobial
warna orange yang berpendar pada permukaan koloni bakteri dan dari pengukuran

lebar diameter koloni. Selesai diinkubasi dan didapatkan bakteri lipolitik, koloni yang

tumbuh diamati dengan melihat morfologinya meliputi tipe, bentuk, warna dan

diameter koloni. Berdasarkan diameter koloni bakteri yang terbentuk, maka dipilih

dua isolat bakteri yang mempunyai aktivitas lipolitik tertinggi sebagai sumber untuk

produksi enzim. Diagram proses dapat dilihat pada gambar 5.

2. Produksi Enzim Lipase

Enzim lipase diperoleh dengan cara mengambil 1 ml strain dari penyimpanan dan

diinokulasikan ke dalam Erlenmeyer yang berisi 99 ml media NB yang mengandung

10% minyak zaitun, kemudian diinkubasi pada suhu 55ºC sampai mencapai fase

eksponensial. Enzim lipase kasar pada Erlenmeyer dipanen dari biakan dengan cara

sentrifugasi dengan kecepatan 5.000 rpm selama 15 menit. Setelah itu supernatan

yang terbentuk diambil dan dipindahkan ke Erlenmeyer lain, untuk selanjutnya

dilakukan uji aktivitas enzim. Diagram proses dapat dilihat pada gambar 5.

3. Uji Aktivitas Lipase

Pengujian aktivitas lipase dilakukan dengan mencampur 2 mL

minyak zaitun, 4 ml larutan buffer phosphate (pH (5,7,9), 1 ml

larutan enzim kasar (supernatan). Campuran dikultivasi pada suhu

60 ºC, 70 ºC, 80 ºC selama 30 menit. Setelah waktu kultivasi habis,

campuran substrat enzim diinaktifkan dengan penambahan larutan

aseton : ethanol (1:1) sebanyak 10 ml, lalu dilakukan titrasi dengan

NaOH 0,05 M dengan menambah 2-3 tetes phenolphtalien 1%

Parlan
240120190501
Enzim dan Mikrobial
sebagai indikatornya. Titrasi dihentikan jika sudah terbentuk warna

merah jambu. Diagram proses dapat dilihat pada gambar 6.

Parlan
240120190501
Enzim dan Mikrobial

Gambar 5. Isolasi bakteri dan ektraksi enzim kasar Lipase

Parlan
240120190501
Enzim dan Mikrobial

Gambar 6. Pengujian aktivitas Lipase