Bahan dan metode

Isolasi, pemurnian dan pemeliharaan jamur endofit penghasil vinblastine

dan vincristine

Jamur endofit diisolasi dari daun Catharanthus roseus yang diperoleh dari berbagai daerah di Pune (CSIR-National
Chemical Laboratory and University of Pune, India); tidak ada izin khusus yang diperlukan untuk lokasi ini dan
studi lapangan tidak melibatkan spesies yang terancam punah atau dilindungi. Jamur endofit hasil isolasi Fusarium
oxysporum yang dipelihara pada media agar kentang dekstrosa (PDA) miring memiliki pertumbuhan optimum pada
pH 7,0 dan suhu 27°C. Subkultur dilakukan dengan interval bulanan untuk mempertahankan kultur stok dan
diawetkan pada suhu 15°C. Bahan awal untuk percobaan fermentasi diambil dari kultur stok yang tumbuh aktif,
yang disubkultur pada slant segar dan diinkubasi selama 7 hari pada pH 7,0 dan suhu 27°C.

Identifikasi jamur endofit penghasil vinblastine dan vincristine dengan

metode kultur, morfologi dan molekuler

Identitas kultur jamur endofit penghasil vinblastine dan vincristine ditetapkan dengan menggunakan pendekatan
kultur, morfologi dan molekuler. Untuk mempelajari karakter kultur dan morfologi jamur ditumbuhkan pada media
PDA. Karakter budaya seperti warna dan sifat pertumbuhan koloni ditentukan oleh pengamatan visual. Karakteristik
morfologi jamur seperti miselia, konidiofor dan konidia dipelajari secara mikroskopis (Carl Zeiss Axiovert 25
mikroskop terbalik). Miselium, konidiofor dan konidia yang dihasilkan jamur pada biakan diperiksa di bawah
mikroskop. DNA genom dari galur jamur endofit diekstraksi sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh Lodhi et al.
(1994) dengan sedikit modifikasi. Regio DNA genom jamur ITS diamplifikasi menggunakan
ITS1- TCCGTAGGTGAACCTGCGG (primer maju) dan ITS4- TCTCCGCTTATTGATATGC (primer
terbalik). Produk PCR murni yang diperoleh menggunakan ITS1 dan ITS4 diurutkan menggunakan metode
terminasi rantai dideoksinukleotida Sanger dan dilakukan di Chromous Biotech Pvt. Ltd. Bangalore, India. Sekuen
yang diperoleh selanjutnya dianalisis homologinya dengan menggunakan alat online nucleotide BLAST.

Isolasi, pemurnian dan karakterisasi vinblastine dan vincristine dari

jamur endofit Fusarium oxysporum

Prosedur fermentasi dua tahap digunakan untuk isolasi vinblastine dan vincristine oleh Fusarium oxysporum. Pada
tahap pertama, labu Erlenmeyer 500 ml yang berisi media 100 ml (MGYP, (0,3%) ekstrak malt, (1,0%) glukosa,
(0,3%) ekstrak ragi dan (0,5%) pepton) diinokulasi dengan biakan berumur 7 hari dan diinkubasi pada suhu 28°C
pada rotary shaker (240 rpm) selama 4-5 hari, yang digunakan sebagai biakan benih (tahap I). Kemudian, 10 ml
biakan benih dipindahkan ke labu Erlenmeyer 500 ml yang berisi 100 ml media produksi yang disebut media vinca-
1 (Glukosa: 3%, Asam suksinat: 1%, Natrium benzoat: 100 mg, Pepton: 1%, Magnesium sulfat: 3,6 mg, Biotin: 1
mg, Thiamine: 1 mg, Pyridoxal: 1 mg, Calcium pentothenate: 1 mg, Buffer fosfat: 1 ml (pH 6,8), L-Tryptophan:
0,1%, Minyak geranium: 0,05%) yang merupakan diinkubasi pada suhu 28°C selama 20 hari sebagai kultur goyang
(tahap II), setelah itu dipanen dan digunakan untuk penelitian lebih lanjut. Filtrat kultur dan miselia dipisahkan
dengan bantuan kain muslin dan kemudian diliofilisasi. Filtrat kultur terliofilisasi diekstraksi menggunakan etil
asetat sebagai sistem pelarut. Lapisan organik dipisahkan dari lapisan air menggunakan corong pisah. Ekstraksi
diulang tiga kali dan pelarut dikeringkan menggunakan natrium sulfat anhidrat dan dipekatkan di bawah vakum
menggunakan rotavapour pada suhu 40°C untuk mendapatkan ekstrak kasar. Sejumlah kecil ekstrak kasar dilarutkan
dalam etil asetat dan dilakukan kromatografi lapis tipis (KLT) pada silika gel-G (ketebalan 0,5 mm) menggunakan
kloroform∶metanol (8∶2) sebagai sistem pelarut. Pelat KLT disemprot dengan reagen ceric amonium sulfat. Bintik-
bintik alkaloid vinca menghasilkan warna ungu cemerlang dan juga warna ungu dengan pereaksi penyemprotan di
atas. Pemurnian jamur vinblastine dan vincristine dilakukan dengan kromatografi kolom silika gel. Ekstrak mentah
dimuat pada kolom gel silika (ukuran 60-120 mesh, lebar 40 cm × 2 cm) pra-diseimbangkan dengan kloroform dan
dielusi dengan gradien kloroform∶metanol (100% kloroform, 9∶1, 8∶2 , 7∶3, 1∶1 dan 3∶7 dan 100% metanol).  Fraksi
yang mengandung senyawa dengan nilai Rf yang mirip dengan vinblastine dan vincristine standar dikumpulkan dan
dikenai KLT preparatif pada pelat silika setebal 0,5 mm (20 cm×20 cm) dan dikembangkan dalam sistem pelarut
kloroform∶metanol (8∶2). Pita diduga vinblastine dan vincristine jamur dikikis dan dielusi dengan metanol.

Pemurnian dan kuantifikasi vinblastine dan vincristine oleh HPLC

Kemurnian jamur vinblastine dan vincristine ditentukan oleh HPLC menggunakan kolom simetri C18
(Waters). Sampel (40 µg) diambil dalam 40 µl asetonitril, disuntikkan dalam kolom HPLC dan elusi gradien
dilakukan menggunakan asetonitril 5%–95% dalam air dengan asam trifluoroasetat 0,01% pada laju alir 0,5
ml/menit. Perekam panjang gelombang ganda yang ditetapkan pada 220 nm dan 254 nm digunakan untuk
mendeteksi senyawa yang terelusi dari kolom. Penyerapan maksimum senyawa murni ditentukan dengan
spektrofotometer Shimadzu PC 101. Sampel dilarutkan dalam metanol grade HPLC dan data spektral dikumpulkan
pada kisaran 200-700 nm. Konsentrasi 2 mg/ml larutan vinblastin dan vinkristin standar dibuat dalam asetonitril
grade HPLC. 50 µl larutan standar di atas (2 mg/ml) ditambah 950 µl asetonitril grade HPLC diambil untuk
membuat konsentrasi akhir 100 µg/ml. 10 µl larutan ini disuntikkan ke dalam HPLC dan dianalisis. Demikian pula,
untuk mengukur vinblastine dan vincristine yang ada dalam 1 liter filtrat kultur, filtrat kultur yang diperoleh setelah
20 hari diekstraksi dan dimurnikan dengan HPLC. Vinblastin dan vinkristin jamur murni yang diperoleh dilarutkan
dalam 1 ml asetonitril grade HPLC dan kemudian 10 µl masing-masing larutan murni ini disuntikkan ke dalam
HPLC dan dianalisis. Data puncak area vs konsentrasi standar yang diperoleh digunakan untuk memperkirakan
jumlah jamur vinblastine dan vincristine dalam satu liter kultur filtrat. untuk mengukur vinblastine dan vincristine
yang ada dalam 1 liter filtrat kultur, filtrat kultur yang diperoleh setelah 20 hari diekstraksi dan dimurnikan dengan
HPLC. Vinblastin dan vinkristin jamur murni yang diperoleh dilarutkan dalam 1 ml asetonitril grade HPLC dan
kemudian 10 µl masing-masing larutan murni ini disuntikkan ke dalam HPLC dan dianalisis. Data puncak area vs
konsentrasi standar yang diperoleh digunakan untuk memperkirakan jumlah jamur vinblastine dan vincristine dalam
satu liter kultur filtrat. untuk mengukur vinblastine dan vincristine yang ada dalam 1 liter filtrat kultur, filtrat kultur
yang diperoleh setelah 20 hari diekstraksi dan dimurnikan dengan HPLC. Vinblastin dan vinkristin jamur murni
yang diperoleh dilarutkan dalam 1 ml asetonitril grade HPLC dan kemudian 10 µl masing-masing larutan murni ini
disuntikkan ke dalam HPLC dan dianalisis. Data puncak area vs konsentrasi standar yang diperoleh digunakan untuk
memperkirakan jumlah jamur vinblastine dan vincristine dalam satu liter kultur filtrat. Vinblastin dan vinkristin
jamur murni yang diperoleh dilarutkan dalam 1 ml asetonitril grade HPLC dan kemudian 10 µl masing-masing
larutan murni ini disuntikkan ke dalam HPLC dan dianalisis. Data puncak area vs konsentrasi standar yang diperoleh
digunakan untuk memperkirakan jumlah jamur vinblastine dan vincristine dalam satu liter kultur filtrat. Vinblastin
dan vinkristin jamur murni yang diperoleh dilarutkan dalam 1 ml asetonitril grade HPLC dan kemudian 10 µl
masing-masing larutan murni ini disuntikkan ke dalam HPLC dan dianalisis. Data puncak area vs konsentrasi
standar yang diperoleh digunakan untuk memperkirakan jumlah jamur vinblastine dan vincristine dalam satu liter
kultur filtrat.

Spektrometri massa ionisasi elektrospray (ESI-MS) dan analisis

spektrometri massa Tandem (MS-MS)

Massa molekul senyawa yang dimurnikan ditentukan dengan spektrofotometer massa Biosystems APIQSTAR
pulsar (ESI-MS) yang diterapkan M/S. Sampel untuk analisis dilarutkan dalam metanol kelas HPLC, air, asam asetat
dengan perbandingan 50∶50∶0,1. Sampel kemudian dianalisis dengan metode infus (disuntikkan ke dalam MS)
dengan laju aliran 5 µl/menit dan pada tegangan IS 3800 V dalam mode TOF. Spektrum dari kisaran m/z 100–1400
Dalton diperoleh. Fragmentasi molekul yang diinginkan diperoleh dengan memperoleh spektrum ion produk
menggunakan MS-MS dengan parameter yang sama seperti yang digunakan untuk ESI-MS. Spektrum dari kisaran
m/z 100–900 Dalton diperoleh. Ion molekuler dari vinblastine dan vincristine standar juga diperoleh untuk
perbandingan.

Analisis Resonansi Magnetik Nuklir ( 1 H NMR).

 H NMR dilakukan pada spektrometer Bruker AV 400 FT yang beroperasi pada 400 MHz selama 1 H.
Analisis vinblastine 1

Sampel dilarutkan dalam CDCl 3 dan diukur dengan lebar spektral ∼8200 Hz, waktu akuisisi 1,82 detik dan
penundaan relaksasi dari 1,0 s diterapkan menggunakan sudut flip 30 derajat. 256 dan 124 transien dikumpulkan
masing-masing untuk A dan B. Demikian pula, analisis vincristine 1 H NMR dilakukan pada spektrometer Bruker
AV 400 FT yang beroperasi pada 500 MHz selama 1 H. Sampel kemudian dilarutkan dalam CD 3OD dan diukur
dengan lebar spektral ∼8200 Hz, waktu akuisisi 1,82 detik dan penundaan relaksasi 1,0 detik diterapkan
menggunakan sudut balik 30 derajat. 256 dan 256 transien dikumpulkan masing-masing untuk A dan B.