3.

1 Karakterisasi sampel dengan tanpa perlakuan dan dengan perlakuan penambahan

CR w/ Bacillus Cohni
3.1.1 Preparasi sampel
sampel dengan tanpa perlakuan dan dengan perlakuan penambahan CR
w/ Bacillus Cohni dikumpulkan dan disentrifugasi pada 8000 xg selama 10
menit dalam suhu 4oC untuk memisahkan biomassa sel dan partikel
tersuspensi lainnya. Senyawa induk dan metabolitnya diekstraksi dari
supernatan setelah metode ekstraksi cair-cair menggunakan etil asetat dan
sampel dengan volume yang sama (Bharagava et al., 2018). Ekstrak
dikeringkan di atas natrium sulfat anhidrat dan diuapkan sampai kering
dalam arotary evaporator (Rotavapor RE 120 Buchi, Flawil., Swedia) dan
digunakan dalam analisis FT-IR. Untuk analisis GC-MS, residu kering
dilarutkan dalam HPLC grade dichloromethane (DCM), disaring melalui filter
membran (0,22μm) (MilliporeLtd, Bedford., MA) sebelum diinjeksikan ke
dalam kolom.
3.1.2 Analisis FTIR
Sampel kering dicampur dengan 400 mg KBr murni dengan perbandingan
5:95, campuran ditumbuk halus dan dihaluskan menjadi pelet tipis yang
disiapkan dalam kondisi vakum dengan menggunakan mesin press hidrolik
PCI berkapasitas 15 ton dan difiksasi dalam wadah sampel selama analisis.
Sampel dianalisis dengan menggunakan NicoletTM6700 Thermo Scientific,
USA, Spektrofotometer di mid inframerah (IR) dengan range 400–4000 cm −1
dengan kecepatan pindai 16.
3.1.3 Analisis GC-MS
Ekstrak etilasetat (5μl) disuntikkan ke dalam kolom PE-5MS (diameter
0,18mm, panjang 20m, ketebalan film 0,18mm). Suhu kolom dijaga pada
80◦C (2 menit), 50–280◦C (10◦C min−1) dan waktu tahan (7 menit ). Gas helium
digunakan sebagai gas pembawa dan laju aliran diprogram pada 1,0 ml min -
1
. Suhu port injeksi dan jalur transfer MS ditetapkan masing-masing pada
280◦C dan 290◦C. Bahan kimia induk dan metabolitnya dikarakterisasi
berdasarkan RT (Waktu Retensi), pola fragmentasi, dan spektrum massa
dengan menggunakan Pustaka NIS (Lembaga Standar dan Teknologi
Nasional) (versi 1.10 beta, Shimadzu)
3.1.4 Penilaian toksisitas sampel dengan tanpa perlakuan dan dengan
perlakuan penambahan CR w/ Bacillus Cohni
3.1.5 toksisitas sampel dengan tanpa perlakuan dan dengan perlakuan
penambahan CR w/ Bacillus Cohni dievaluasi dalam hal parameter
perkecambahan biji dan pertumbuhan bibit menggunakan biji P. mungoL.
Untuk itu digunakan konsentrasi yang berbeda, 25, 50, 75 dan 100% (v/v)
dari sampel yang tidak diberi perlakuan dan yang diberiperlakuan disiapkan.
Air destilat digunakan sebagai kontrol. Sepuluh (10) benih sehat berukuran
seragam P. mungoL. dipilih, permukaan disterilkan dengan larutan HgCl 2
2,0% selama 2 menit untuk menghilangkan kontaminasi jamur dan dicuci
dengan air suling steril (Bharagava dan Chandra, 2010). Sepuluh benih
ditempatkan di setiap cawan petri steril di antara kertas saring Whatman
No. 1 (Whatman, Inggris) dan 5 ml dari setiap konsentrasi sampel dengan
tanpa perlakuan dan dengan perlakuan penambahan CR w/ Bacillus Cohni
digunakan untuk irigasi benih (Bharagava et al., 2018) dan diinkubasi pada
suhu 28◦C dalam inkubator BOD selama 7 hari. Persentase perkecambahan
biji dicatat setelah dua hari dan panjang akar dan tunas dihitung setelah
tujuh hari masa inkubasi. Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga.
Persentase perkecambahan biji dicatat dengan menggunakan rumus
berikut:

No of seeds germinated
Germination %= ×100 %
No of seed sowed