Identifikasi Bakteri Asam Laktat Pada Pengolahan Plaa-Som, Produk

Fermentasi Ikan Tradisional Thailand

Abstrak
Plaa-som adalah produk fermentasi ikan ala Thai dari ikan utuh maupun filet yang
difermentasi dengan nasi, garam, dan bawang. 762 jumlah total bakteri asam laktat (BAL)
diisolasi dari kultur agar lempeng CaCO3-MRS selama fermentasi plaa-som. BAL disaring
dan dikelompokkan dengan analisa restriksi DNA ribosom (ARDRA), menghasilkan 6
kelompok berdasarkan DNA ribosom-nya yaitu Lactococcus garvieae, Streptococcus bovis,
Weissella cibaria, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, dan Lactobacillus
fermentum. Bahan segar yang dicampurkan mengandung populasi BAL rendah
(kurang dari 10 CFU / g) selama fermentasi dan populasi fermentasi akhir sekitar
107 CFU / g. Pada proses awal didominasi Lc. garvieae, S. bovis, and W. cibaria. Pada
fermentasi selama 48 jam terdapat W. cibaria, P. pentosaceus, and Lb. plantarum yang
didominasi Lb. Plantarum sampai fermentasi selesai. Campuran spesies-spesies BAL tersebut
dianggap spesies yang dapat dikembangkan sebagai kultur starter fermentasi Plaa-som.
1. Pendahuluan
Plaa-som adalah produk fermentasi ikan ala Thai dari ikan utuh maupun filet yang
difermentasi dengan nasi, garam, dan bawang sampai dihasilkan rasa asam yang dapat
diterima (TISI, 2005). Setelah fermentasi, ikan dimasak dengan deep frying atau dibakar
sebelum dikonsumsi. Sebagai produk fermentasi tradisional, resep pembuatannya berbedabeda menurut kerajaan-kerajaan Thailand, tergantung dengan konsumen lokal dan
ketersediaan bahan (Valyasevi and Rolle, 2002). Hasilnya mikrobiologi, karakteristik kimia
dan sensoriknya berbeda-beda. Proses produksi secara tradisional bergantung pada fermentasi
spontan yang ditandai dengan munculnya mikroorganisme alami, terutama bakteri asam
laktat (BAL), yang ditemukan dalam bahan, peralatan pengolahan, dan atmosfer lokal sebagai
starter alami (Khieokhachee et al., 1997; Valyasevi and Rolle, 2002; Visessanguan et al.,
2004). Selama fermentasi, BAL memanfaatkan substrat karbohidrat yang tersedia dalam
sistem fermentasi dan menghasilkan asam-asam organik, terutama asam laktat, sebagai
bagian dari metabolitnya (Kandler, 1983; Paludan-Mller et al., 2002a). Asam-asam tersebut
tidak hanya menghasilkan rasa, aroma, dan tektur tetapi juga mengakibatkan pH rendah yang
mana menjadi faktor kunci mutu dan keamanan (Owens and Mendoza, 1985; Paludan-

Mller et al., 2002a; Visessanguan et al., 2006; Kopermsub and Yunchalard, 2008). Penelitian
untuk menentukan dan mengembangkan kultur starter BAL untuk produksi Plaa-som akan
memungkinkan proses yang lebih terkontrol dan menghasilkan produk dengan konsistensi
yang lebih besar dalam kualitas dan keamanan. Pembentukan starter seperti itu perlu
dikembangkan dari spesies utama BAL yang diinginkan selama proses fermentasi Plaa-som.
Penelitian ini bertujuan untuk menentukan spesies dominan BAL yang tumbuh selama proses
tradisional tapi diharapkan keberadaannya dalam fermentasi Plaa-som di wilayah timur laut
Thailand.
2. Materi dan Metode
2.1. Preparasi Plaa-som dan Sampling
Dua batch Plaa-som 10 kg produksi lokal terpilih dari Khon Kaen, sebuah provinsi di
wilayah timur laut Thailand dengan teknik tradisional dan resep produsen. Ikan air tawar
Thai, Barb Perak (Barbodes gonionotus), dengan nama lokal Plaa-ta-pien, masing-masing
sekitar 300 g sebagai bahan baku utama. Ikan disiangi, dihilangkan sisiknya, dibelah kedua
sisi, dicuci dengan air bersih selama 3-4 kali, direndam dalam air garam laut 25% (b/v)
selama kurang lebih 3 jam, kemudian dibilas dengan air bersih dan dikeringkan. Ikan yang
bersih dan kering kemudian dicampurkan dengan garam laut dan gula, masing-masing sekitar
150 g dan 50 g/10 kg ikan, diikuti dengan beras jasmine kukus dan bawang putih cincang
1000 g dan 50 g/10 kg ikan. Campuran bahan juga dimasukkan ke dalam perut ikan.
Tempatkan ikan dalam mangkok yang ditutupi dengan lembaran plastik dan disimpan pada
suhu 30C selama 6 jam untuk difermentasi. Kemudian ikan disimpan pada suhu -18C
selama 6 jam setelah masing-masing ikan dikemas dalam kantong plastik 1 kg. Udara
dikeluarkan dari kantong dengan menekannya kemudian diikat dengan karet gelang.
Fermentasikan pada suhu 30 C selama 144 jam (6 hari). Sampel Plaa-som dianalisa kimia
dan mikrobiologinya selama proses

produksi pada langkah-langkah dan waktu sebagai

berikut: Setelah pencampuran dan pengisian bahan ke dalam perut ikan, disebut sampel 1; 6
jam

setelah pencampuran disebut sampel 2, setelah dikemas dan disimpan dalam alat

pembekuan pada suhu -18C disebut sampel 3, dan setiap selang 24 jam selama fermentasi
pada suhu 30 C selama 144 jam disebut sampel 4 9.
2.2.

Isolasi Bakteri Asam Laktat

Satu Ikan utuh diambil sebagai sampel dengan aseptis dipotong kecil-kecil sebelum

dihomogenisasi dengan Stomacher 400 Lab Blender (Seward Ltd, Worthington, Inggris)
kecepatan tinggi selama 3 menit dan diencerkan dengan pengenceran desimal dalam air

garam pepton (0,1% (b/v) pepton dan 0,85% (b/v) NaCl dalam air suling) dan diinokulasikan
secara triplo untuk dihitung koloninya kemudian diisolasi dengan teknik lempeng spread
(Speck, 1984). BAL diisolasi menggunakan inkubator mikroaerob dalam candle jar pada
suhu 30C selama 3-5 hari dengan agar MRS (Man et al., 1960) dimodifikasi dengan
penambahan 1,0% (b / v) CaCO3. Asam yang diproduksi koloni bakteri diambil dari agar
lempeng. Kemungkinan lebih dari 100 isolat terambil dari tiap sampel. Semua isolat
dimurnikan dan dipastikan sebagai BAL setelah diketahui karakteristik biokimia dan
mikroskopiknya dengan menggunakan pewarnaan gram, uji katalase, dan uji fermentasi
glukosa O-F. Semua isolat BAL disimpan pada suhu -80 C dalam alat pembekuan (Gibson
dan Khoury, 1986) sampai dapat diidentifikasi dengan Analisis Restriksi DNA Ribosom
(Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA)) dan sekuensing DNA ribosom
(Ribosomal DNA Sequencing).
2.3.

Ekstraksi dan persiapan genom DNA dari isolat BAL

Isolat BAL dibiakkan selama 12 jam dalam 1,5 ml MRS broth pada suhu 30C dan

sel-sel disentrifus (pemisahan komponen-komponen sel) dengan kecepatan 5000 rpm selama
3 menit [Refrigerated

microcentrifuge (model: Sigma 3K15, SIGMA Laborzentrifugen

GmbH, Jerman)]. MRS broth dikeluarkan dari tabung dan genom DNA diekstraksi dari pelet
selnya (struktur-struktur lebih besar yang terkumpul di bagian bawah tabung sentrifuge),
menurut modifikasi metode Anderson dan McKay (1983) dan Wilson (1990). Genom DNA
diekstraksi dari setiap isolat BAL dengan elektroforesis gel horisontal [aparat gel horisontal
(GelMate GEP102, Toyobo Co, Ltd, Osaka, Jepang)] dengan 0,8% (b / v) agarosa yang
mengandung 0,5 mg / ml ethidium bromida di TBE 0.5x menggunakan 100 V selama 20
menit. Gel itu divisualisasikan menggunakan Image Master VDS

(Amersham Plc.,

Buckinghamshire, Inggris). Konsentrasi dan kemurnian DNA juga ditentukan dengan

menggunakan metode spektrofotometri (Spektrofotometer UV-VIS, Shimadzu Corp, Kyoto,
Jepang) berdasarkan Maniatis dkk. (1982). Preparasi DNA disimpan dalam 40 l air bebasnuklease pada suhu -20C sampai digunakan.
2.4.

Amplifikasi rDNA 16S isolat BAL

DNA dari stok yang disimpan dalam suhu -20C diencerkan antara 10 pg dan 1 g/50

ml menggunakan air suling bebas ganda-nuklease. Fragmen rDNA 16S diamplifikasi dengan
PCR menggunakan universal primer set dari 27-f (5'-AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3 ')
dan 1490-r (5'-GTT ACC TTG TTA CGA CTT C-3 ') menurut Chen et al. (2005)
menggunakan Cycler iCyclerThermal (Bio-Rad Laboratories Inc, Hercules, USA). Semua
reagen yang digunakan dalam amplifikasi PCR dibeli dari di Fermentas International Inc,

Ontario, Kanada. Amplifikasi ini dilakukan dengan 50 l volume reaksi seperti yang
dijelaskan oleh Hoefel et al. (2005). Setiap Reaksi PCR terdiri dari 200 M setiap dNTP, 1.0
pM primer masing-masing, 2.5 mM MgCl2, 1X PCR buffer, 2.5 U Taq polimerase DNA, dan
1 l DNA template. Siklus termal yang terjadi meliputi denaturasi tahap awal pada 95C
selama 10 menit, 30 siklus dari tahap denaturasi padasuhu 95C selama 30 detik, tahap anil
pada suhu 50C selama 1 menit, tahap ektensi pada suhu 72C selama 2 menit, dan ekstensi
terakhir pada suhu 72C selama 10 menit. Produk PCR diperiksa menggunakan 0,8% (b / v)
elektroforesis agarose gel. Gel divisualisasikan dengan menggunakan Image Master VDS.
2.5. Analisis Pembatasan produk PCR rDNA 16S
Produk PCR rDNA 16S dari masing-masing isolat BAL dipotong dengan individual
tetrameric restriction endonuclease enzyme: Acc II (CG / CG) atau Hae III (GG / CC)
menurut Sato et al. (2000) dan Chen et al. (2005), mengikuti prosedur yang diuraikan oleh
Fermentas International Inc, Ontario, Kanada. Campuran reaksi pembatasan endonuklease
dicampur dengan lembut dan diputar menurun selama beberapa detik. Campuran reaksi
kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 3 jam. Pola pembatasan atau profil ARDRA
diperiksa dengan menggunakan 3,0% (b / v) gel agarosa di 0.5x penyangga TBE pada 100 V
selama

40

menit

[aparat

gel

horisontal

(GelMate

GEP102,

Toyobo

Co, Ltd, Osaka, Jepang)] dengan tangga DNA (GeneRuler 100 bp DNA tangga). Gel itu
divisualisasikan menggunakan Image Master VDS.
2.6. Sequencing rDNA 16S
Masing-masing pola kelompok ARDRA secara acak dipilih untuk analisis sekuens.
Analisis sekuens DNA dilakukan sesuai dengan metode dideoksi-dimediasi rantai terminasi
(Sanger et al., 1977) menggunakan MegaBACE 1000 automated DNA sequencer (Pharmacia
Biotech, Swedia) di laboratorium khusus sekuensing DNA Departemen Biokimia, Fakultas
Kedokteran, Khon Kaen University. Pencarian homologi rDNA 16S diurutkan dengan
GenBank dengan program BlastN.
3. Hasil
Sebanyak 762 isolat BAL yang ditemukan dan dimurnikan dari sampel 1 sampai 9.
Semua isolat dipastikan termasuk kelompok BAL berdasarkan Gram-positif, tidak ada
aktivitas katalase, dan hasil positif untuk kemampuan fermentasi glukosa (data tidak
ditampilkan). Dari semuanya, hanya dua isolat BAL yang ditemukan dari sampel 1. Seratus
isolat BAL masing-masing ditemukan dari sampel 2 sampai 8, dan 60 Isolat BAL yang
ditemukan dari sampel 9 seperti yang tercantum dalam Tabel 2.

Ditemukan bahwa dua primer terpilih mampu memperkuat fragmen rDNA 16S setiap
isolat BAL yang mengakibatkan amplikon dari sekitar ukuran 1463 bp (data tidak
ditampilkan). Kedua enzim tetramerik dipilih (baik Acc II atau III Hae) untuk pembatasan
amplikon sehingga mampu membedakan semua 762 isolat BAL menjadi 6 pola pembatasan.
Pola-pola ini, atau profil ARDRA, tertulis A, B, C, D, E, dan F seperti ditunjukkan pada
Gambar. 1 dan tercantum dalam Tabel 1. Isolat yang mewakili setiap profil dianalisis untuk
urutan rDNA 16S. Pencarian homologi urutannya melampirkan (dengan 99-100% homologi)
profil yang A milik Lactococcus garvieae, profil B milik Streptococcus bovis, profil C milik
Weissella cibaria, Profil D milik Pediococcus pentosaceus, profil E milik Lactobacillus
plantarum, dan profil F milik Lactobacillus fermentum. Urutan tersebut disetorkan ke

GenBank Database. Nomor aksesi urutannya ditunjukkan pada Tabel 1. Frekuensi isolasi
setiap spesies dari 100 isolat yang diambil pada setiap waktu sampel tercantum dalam Tabel
2.

Hanya dua isolat BAL (Lc. garvieae dan S. bovis) ditemukan dari bahan baku setelah
pencampuran (sampel 1). Selanjutnya, sebanyak 37 isolat dari 762 isolat BAL yang
ditemukan adalah S. bovis (9 dan 28 isolat dari sampel 2 sampai 3 diambil selama tahap awal
fermentasi). Dengan demikian, hanya 38 isolat yang diambil dari sampel 1 sampai 3
diidentifikasi sebagai S. bovis. Lc. garvieae yang tumbuh selama penyimpanan 6 jam
berikutnya dengan bahan tambahan yang dicampurkan dan mewakili 88% isolat BAL. Pada
isolasi tahap ini terdapat sedikit S. bovis dan W. cibaria. Lc. garvieae juga dominan (56%) di
campuran setelah pembekuan, diikuti oleh S. bovis (28%) dan W. cibaria (16%). Selama
fermentasi, Lc. garvieae semakin menghilang dari sampel 4 sampai 7 dan masing-masing 13,
13, 2, serta 4% dari isolat. W. cibaria pertama ditemukan dari sampel 2 sebesar 3% kemudian
mengalami peningkatan pada sampel 3.
W. cibaria ditemukan sebagai spesies dominan dalam sampel 4, mewakili 85% dari
isolat. Namun, kemudian menurun selama fermentasi (sampel 5 sampai 9), dan hanya 1,6%
pada sampel 9. P. pentosaceus dan Lb. plantarum pertama kali diisolasi pada frekuensi 1%
pada sampel 4 kemudian menjadi dominan dalam sampel 5 dan 6 pada masing-masing
frekuensi 30%, 29% dan 29%, 57%. Setelah itu, P. pentosaceus menurun menjadi sekitar 8%
pada sampel 9. Tahap akhir fermentasi didominasi dengan Lb. plantarum yang memberikan
frekuensi isolasi sama tingginya 70-90% pada sampel 7 sampai 9. Lb. fermentum kadangkadang ditemukan dari sampel 6 sampai 8, tapi pada frekuensi yang rendah (sekitar 1%).

4. Pembahasan
Dalam memproduksi makanan berfermentasi, matriks awal makanan menyajikan
kondisi abiotik dan biotik yang dipilih untuk pertumbuhan koloni mikroba tertentu (Giraffa,
2004). Pada Plaa-som, konsentrasi awal garam (1,43% b/b) dan gula (0,5% b/b) dengan
pengaruh antimikroba dari bawang putih terpilih bertujuan untuk menumbuhkan bakteri asam
laktat yang berkembang dari populasi awal sangat rendah sampai lebih besar dari 107 CFU/g.
Akibatnya, pH produk menurun dari sekitar 6,5 menjadi sekitar 4,5. Penemuan ini konsisten
dengan penelitian sebelumnya dengan produk yang sama (Tanasupawat dan Komagata, 1995;
Paludan-Mller et al, 1999.; Kopermsub dan Yunchalard, 2008).
Dalam penelitian ini, ARDRA melakukan penyaringan dan identifikasi dalam
jumlah besar (762) isolat BAL yang diperoleh dari fermentasi Plaa-som. Berdasarkan
penyaringan ini, isolat dikategorikan menjadi enam kelompok berbeda yang diurutkan
menjadi enam spesies (Tabel 1). Peneliti lain juga melaporkan kegunaan ARDRA untuk
pengelompokan cepat dan identifikasi isolat BAL (Sato et al, 2000.; Vaneechoutte dan
Heyndrickx, 2001; Chen et al, 2005, 2006). Bakteri asam laktat dari campuran bahan baku
segar dan bisa disebabkan proses higienis yang diadopsi oleh tempat produksi lokal. Tahap
pembersihan dan pencucian sebelum bahan baku dan bahan-bahan tambahan dicampurkan
menghasilkan BAL kurang dari 10 CFU / g. Namun, pada penyimpanan berikutnya dari
campuran bahan (sampel 2) menghasilkan pertumbuhan BAL yang didominasi Lc. garvieae,
S. bovis, dan W. cibaria dan jumlah total ditemukan meningkat menjadi 104 CFU / g.
Uniknya proses pembekuan digunakan dalam proses ini diperlukan untuk membuat tekstur
ikan padat dan juga, memungkinkan penyimpanan jangka panjang dalam produksi Plaa-som
skala besar. Proses pembekuan dan pelelehan menyebabkan pengurangan jumlah total
populasi BAL yang kecil sampai sekitar 5 103 CFU / g. Namun demikian, spesies BAL
yang ditemukan dari tahap awal seperti Lc. garvieae, S. bovis, dan W. cibaria masih ada dan
ditemukan dari sampel 3 setelah pembekuan dan pelelehan.
S. bovis ditemukan pada tahap awal produksi dan konsisten menghasilkan amilase
yang mungkin berperan dalam degradasi pati nasi, yang menjadi bahan kunci dari Plaa-som
(Cotta, 1988;. Narita et al, 2004). Monosakarida dan disakarida yang dihasilkan oleh
aktivitasnya akan menyediakan karbohidrat untuk BAL lain dalam melakukan proses
fermentasi dan menghasilkan asam laktat (Kandler, 1983) yang memberikan rasa asam yang
diinginkan dan flavor Plaa-som. S. bovis dilaporkan terkait dengan mikroba di hewan dan
sebelumnya diisolasi dari perut babi (Fuller et al., 1978). Oleh karena itu, ditemukannya S.
bovis dari tahap awal proses bisa disebabkan oleh kontaminasi dari lingkungan pedesaan

yang berdekatan dengan peternakan hewan dan pengolahan daging babi dalam pembuatan
produk lainnya

di

lokasi produksi. Meskipun BAL umumnya

dikenal

sebagai

mikroorganisme yang aman, ada beberapa kekhawatiran tentang patogenisitas S. bovis dan
Lc. garvieae (Collins et al, 1983;. Cai et al, 1999;. De Herdt et al, 1992;. Vendrell et al, 2006).
Lc. garvieae yang biasanya telah diperkenalkan ke produk makanan dari ternak dan ikan dan
sering dikenal sebagai ternak atau ikan patogen (Collins et al., 1983; Vendrell et al, 2006).
Namun, Lc. garvieae juga dapat diisolasi dari spesies dominan dari usus ikan yang sehat (Cai
et al., 1999). Selain itu, Lc. garvieae telah ditemukan dalam sosis dan ikan fermentasi
(Paludan-Mller et al, 2002a; Ammor et al, 2005). Meskipun S. bovis umumnya menghuni
saluran pencernaan ruminansia, terkadang ditemukan sebagai penyebab penyakit manusia
(De Herdt et al, 1992;. Whitehead dan Cotta, 2000). Namun, itu bukan masalah kesehatan
yang serius karena ditemukan juga dalam produk susu seperti susu fermentasi dan keju
(Randazzo et al, 2002;.. Rashid et al, 2007). Terlepas dari masalah kesehatan, strain S.
boviswas disarankan sebagai starter probiotik dalam fermentasi makanan sehari-hari karena
dapat menghasilkan angiotensin tinggi, mengubah senyawa enzimpenghambat yang
bermanfaat untuk menurunkan tekanan darah tinggi manusia dan hewan (Rasyid dkk., 2007).
Adanya W. cibaria pada tahap awal produk pengasaman fermentasi sesuai dengan Ampe et al.
(1999), yang melaporkan spesies dari kelompok Leuconostoc-Weissella selalu ada pada tahap
awal fermentasi sayuran dan pozol yang berkontribusi dalam pengasaman produk. Selain itu,
W. cibaria juga ditemukan dan terisolasi dari Plaa-som dalam penelitian sebelumnya
ditemukan dapat menghasilkan zat antimikroba yang disebut Weissellicin 110 (Srionnual et
al., 2007).
Setelah melalui proses pembekuan dan pelelehan, Plaa-som mengalami fermentasi
BAL yang kuat yang ditandai dengan pergeseran ekologi dari spesies yang terlibat. Dari
sampel 4 sampai 9, tiga-langkah suksesi BAL diamati. Pertama, spesies heterofermentatif
dominan W. cibaria memberi jalan untuk BAL yang mendominasi lain dari spesies
heterofermentatif

W. cibaria, dan Lb. plantarum, dan spesies homofermentatif, P.

pentosaceus. Hal ini akhirnya memberi jalan untuk Lb. Plantarum sebagai spesies dominan.
Keunggulan Spesies ini konsisten dengan ditemukannya pada produk fermentasi ikan
Thailand lainnya (Tanasupawat dan Daengsubha, 1983; Paludan-Mller et al, 1999, 2002a,
b;. Srionnual et al, 2007). Lb. plantarum, ditemukan dalam tahap akhir fermentasi Plaa-som,
disebutkan pula sebagai varietas dalam fermentasi sayuran (McDonald et al, 1990;. Brauman
et al, 1996.). Penelitian ini secara khusus hanya menyelidiki spesies BAL untuk fermentasi
Plaa-som karena pentingnya BAL dalam memproduksi produk dengan karakteristik yang

diinginkan. Bakteri lain serta ragi mungkin juga terlibat, dan penelitian lebih lanjut
diperlukan untuk menyelidiki kemungkinan ini.
5. Kesimpulan
Hasil yang diperoleh dari penelitian ini adalah menetapkan distribusi dan suksesi
spesies BAL yang dominan selama fermentasi Plaa-som. Spesies BAL yang dominan adalah
Lc. garvieae, S. bovis, W. cibaria, P. pentosaceus, dan Lb. plantarum. Ini menjadi informasi
berguna yang diperlukan lebih lanjut untuk mengembangkana starter BAL yang diinginkan
sehingga proses fermentasi Plaa-som lebih terkendali dan akan memberikan kualitas produk
yang lebih sesuai. Kultur starter Plaa-som yang sesuai berisi campuran dari semua atau
sebagian spesies BAL dominan yang saat ini perlu dipertimbangkan.