POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI SUI WU’U

MAKANAN KHAS DARI KABUPATEN BAJAWA, INDONESIA UNTUK

MENGHASILKAN ASAM ɤ-AMINOBUTIRAT (GABA)
ABSTRAK
Tujuan: Tujuan dari studi ini adalah mengisolasi bakteri asam laktat (BAL) penghasil asam
ɤ-aminobutirat (GABA) dari sui wu’u makanan khas dari kabupaten Bajawa, Flores Provinsi
Nusa Tenggara Timur, yang tahan hingga bertahun-tahun masa penyimpanannya.
Bahan dan Metode: Sui wu’u yang telah disimpan selama 6 bulan diperoleh dari kabupaten
Bajawa, diisolasi pada media MRSA (Man de Rogosa Sharp Agar) + CaCO3 0,5%, uji
biokimia, uji toleransi terhadap pH, viabilitas terhadap suhu serta kadar NacL dan diuji
secara kualitatif produksi GABA menggunakan kromatografi lempeng tipis (KLT) kemudian
diidentifikasi berdasarkan gen 16S rRNA.
Hasil: Penelitian ini menunjukkan bahwa ada dua jumlah BAL yang dapat diisolasi dan
diidentifikasi berdasarkan gen 16S rRNA ada satu genera, yaitu Lactobacillus. Uji biokimia
menunjukkan bahwa toleransi isolat terhadap pH rendah (pH4) dapat tumbuh dan pH tinggi
(pH 9,6) tidak dapat tumbuh diuji selama 48 jam, dan isolat ini memiliki toleransi viabilitas
pada suhu 10℃, 45℃ dan 50℃ dan terhadap kadar NacL 4% dan 6,5%. Senyawa GABA
yang dihasilkan oleh isolat BAL dilihat dari nilai Retention factor (Rf) yang sama dengan
standar GABA (pregabalin) yaitu 0,60 dan MSG= 0,29, sedangkan nilai Rf isolat 2PKB=
0,58; 2PKT=0,57; 2KH: 0,51 ; 2ST: 0,51 dan 3SP=0,53 dan untuk perlakuan Non MSG
kelima isolat memiliki nilai Rf yang sama yaitu 0,51.
Kesimpulan: Berdasarkan hasil penelitian lima isolat BAL yang berhasil diisolasi dari sui
wu’u diduga berpotensi mampu menghasilkan senyawa GABA, namun dua dari lima yang
menunjukkan nilai Rf tertinggi yaitu, 2PKB dan 2PKT. Hasil penelitian menunjukkan bahwa
BAL dari makanan fermentasi sui wu’u memiliki sifat toleran terhadap tingkat keasaman,
NacL dan suhu dan teridentifikasi sebagai bakteri asam laktat yaitu sebagai Lactobacillus
fermentum strain HB dan Lactobacillus fermentum strain HT dengan nilai identifikasi 100%
dan query cover 98,93% dan 99,23%.
Keywords: Gamma-aminobutyric acid, Indonesian indigenous product, lactic acid bacteria,
Sui wu’u
Introduction
Sui wu’u merupakan daging babi yang pengolahannya dengan cara difermentasi spontan dan
merupakan makanan tradisional dari daerah Flores, terutama Kabupaten Bajawa, Nusa
Tenggara Timur. Sejarah dari makanan ini merupakan salah satu bentuk keterampilan para
nenek moyang zaman dahulu untuk mengawetkan daging babi. Pengawetan daging babi
dilakukan dengan mencampurkan tepung jagung dan garam di dalam tuku. Tuku dalam
bahasa Bajawa artinya adalah bambu (tuku) yang digunakan sebagai tempat penyimpanan.
Hal penting yang harus diperhatikan, yakni bambu tempat penyimpanan sui wu’u harus
benar-benar bersih dan ditutup rapat. Kemudian disimpan pada suhu kamar hingga 6 bulan,
masa penyimpanan yang tahan lama ini terjadi diduga karena adanya mikroba yang turut
berperan dalam proses penguraian senyawa selama proses fermentasi berlangsung.
Pembuatan sui wu’u merupakan salah satu upaya pemanfaatan daging babi yang diberi garam
sebagai bahan baku. Pembuatannya dibuat secara tradisional yang pada umumnya
mengandalkan fermentasi spontan dengan mikroorganisme alami yang ada. Fermentasi
spontan adalah fermentasi bahan pangan dimana dalam pembuatannya tidak ditambahkan
mikroorganisme dalam bentuk starter atau ragi, tetapi mikroorganisme yang berperan aktif
dalam proses fermentasi berkembang baik secara spontan karena lingkungan hidupnya dibuat
sesuai untuk pertumbuhannya, dimana aktivitas dan pertumbuhan bakteri asam laktat
dirangsang karena adanya garam [1].
L. lactis ssp. cremoris, Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici , Lactobacillus
fermentum, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici adalah bakteri asam laktat
yang diisolasi dari berbagai makanan fermentasi tradisional Indonesia [2,3].
Konsumen bahan pangan daging dan produk-produk daging umumnya mengakui daging
sebagai sumber pangan yang baik, nilai biologis protein tinggi, kelompok vitamin B,
mineral-mineral dan elemen minor seperti beberapa senyawa bioaktif lainnya yang
bermanfaat bagi tubuh manusia [4,5].
Kesalahan pengolahan mempengaruhi senyawa-senyawa bioaktif pangan fungsional tersebut
dan kesan konsumen relatif negatif terhadap beberapa kadar zat dalam daging seperti lemak,
kolesterol, asam-asam lemak jenuh, garam dapur dan substansi lainnya, oleh karena itu, perlu
mengefektifkan penggunaan senyawa-senyawa bioaktif atau peptida-peptida bahan pangan
daging dan produknya yang aktif secara fisik [6].
Pengolahan daging terfermentasi secara tradisional dengan memasukkan atau
menggabungkan serat pangan dalam produk-produk daging, dan semua strategi ini untuk
menghasilkan daging dan produknya yang lebih sehat terutama dalam produksi metabolit
yang dapat digunakan sebagai bahan tambahan makanan atau pakan, seperti γ-aminobutyric
acid (GABA) serta senyawa fungsional seperti peptida dan oligosakarida bersama dengan
asam laktat diproduksi ketika BAL digunakan untuk memfermentasi makanan [7].
Penelitian mengenai bakteri asam laktat telah banyak dilakukan karena potensi komersialnya
sebagai starter pada produk fermentasi, kemampuannya dalam mengawetkan makanan dan
manfaatnya dalam bidang kesehatan, seperti mampu menjaga kestabilan mikroflora usus,
imunostatis dan antitumor [8], dan senyawa fungsional seperti GABA (asam amino non-
protein)[9]. GABA adalah salah satu komponen fungsional terpenting dalam makanan
fermentasi karena fungsi fisiologisnya seperti neurotransmiter dan aktivitas antihipertensi,
dan anti stres panas untuk ayam pedaging [9]. Meskipun demikian tidak banyak yang
diketahui tentang makanan fermentasi yang kaya akan senyawa GABA.
Produksi GABA oleh mikroba dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti pH awal, waktu
fermentasi, komposisi medium, konsentrasi glutamat, dan suhu [7]. Fermentasi spontan
masih dilakukan dalam pembuatan sui wu’u di Bajawa, belum ada penelitian yang dilakukan
untuk mengetahui keragaman populasi BAL dan potensinya dalam menghasilkan senyawa
bioaktif fungsional.
Materials and Methods
Sampling
Sampel sui wu’u yang telah difermentasi selama 6 bulan diperoleh dari Kabupaten Bajawa,
Flores Nusa Tenggara Timur, Indonesia. Kemudian proses isolasi BAL dilakukan di
Laboratorium secara aseptik untuk dianalisis lebih lanjut.
Isolasi BAL
Sampel diambil secara aseptik sebanyak 1 gram ditambahkan dengan NaCl steril 0,85%
sebanyak 9 mL [10]. Kemudian dilakukan pengenceran berseri 10- 1 hingga 10-7, diinokulasi
menggunakan media MRSA (Man de Rogosa Sharp Agar) + CaCO 3 0,5% [11], dalam petri
dengan metode sebaran (spread plate) diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam [10]. Koloni
yang tumbuh dengan membentuk zona bening dimurnikan pada media MRS agar kemudian
isolat dilakukan uji pewarnaan Gram [2].
Karakterisasi Morfologi BAL
Karakterisasi morfologi dilakukan secara makroskopis dengan menginokulasi kultur BAL
pada MRS Agar untuk melihat bentuk koloni, warna dan diameter isolat BAL [12].
Selanjutnya, karakterisasi morfologi dilanjutkan secara mikroskopis melalui pewarnaan
Gram, dengan melihat keseragaman bentuk sel (batang, bulat, koma) pada mikroskop dan uji
biokimia terdiri dari uji katalase, produksi gas, suhu, dan garam. Karakterisasi fenotip
berdasarkan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology [12,10,14,15].
Penentuan Panjang Gelombang Pregabalin
Panjang gelombang yang sesuai untuk penentuan pregabalin dengan cara pemindaian
panjang gelombang pada rentang 200-700 nm dengan UV 3000+ UV/VIS
Spectrophotometer. Setelah didapat panjang gelombang pregabalin yaitu 425 nm dengan
nilai absorbansi tertinggi akan digunakan dalam mengukur absorbansi senyawa GABA pada
supernatan BAL.
Pembuatan Inokulum Produksi Senyawa GABA
Peremajaan isolat dilakukan untuk meregenerasi sel-sel baru. Hasil peremajaan diambil
sebanyak 2 ose dan dimasukkan ke dalam 5 mL medium MRS cair dan diinkubasi selama 24
jam pada suhu 37ºC sebagai aktivasi pertama. Hasil dari aktivasi pertama dipipet masing-
masing 1 mL dan dimasukan ke dalam 5 mL medium MRS cair sebagai aktivasi kedua dan
kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC. OD diukur pada kultur aktivasi kedua
dengan λ 600 nm untuk didapatkan nilai absorbansi yang sama dengan hasil kurva
pertumbuhan. Hal tersebut dimaksudkan untuk menyelaraskan jumlah sel/mL dari kurva
baku dengan nilai absorbansi pada kurva pertumbuh. Kemudian dipipet sebanyak 1ml dari
aktivasi kedua dan dimasukkan ke dalam 100 mL medium MRS cair yang ditambah 1%
MSG [16].

Proses Fermentasi dan Produksi GABA

Masing-masing inokulum isolat BAL yang diperoleh diinokulasikan pada medium produksi.
Medium produksi berupa 100 mL MRS cair yang mengandung monosodium glutamate atau
MSG 1%. Proses fermentasi dimulai ketika medium produksi yang mengandung inokulum,
diinkubasi di dalam inkubator selama 37 jam pada suhu 37ºC [16].
Identifikasi produksi GABA
Identifikasi produksi GABA oleh kultur BAL dilakukan dengan metode Kromatografi Lapis
Tipis dengan menggunakan larutan MSG dan Pregabalin sebagai penanda. Inokulum BAL
dalam medium MRS cair hasil fermentasi dipindahkan kemasing-masing botol sentrifugasi.
Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 6000 rpm dengan suhu 4ºC selama 15 menit.
Supernatan yang dihasilkan dipindah ke dalam botol kaca. Supernatan sebanyak 10 mL
disaring menggunakan kertas saring (filter steril) dengan ukuran pori-pori 0,20 µm.
Lempeng KLT yang berukuran 10x20 cm diberi garis menggunakan pensil sebagai penanda
awal. Garis dari tepi lempeng KLT berjarak 1,5 cm. Garis penanda awal diberi tanda titik
dengan jarak 1 cm menggunakan pensil untuk tempat spotting sampel. Setiap titik diberi
tanda berupa angka dan huruf.
Konsentrasi larutan MSG dibuat dengan cara mengencerkan sebanyak 0,10 g MSG ke dalam
10 mL akuades untuk didapatkan konsentrasi 1% MSG. Sebanyak 10 µl konsentrasi MSG,
pregabalin, supernatan isolat bakteri uji dispotkan atau diteteskan pada lempeng KLT
alumunium (Silica gel F254, Merck, Mumbai India) secara berurutan pada lempeng KLT.
Running KLT selama 1 jam. KLT dilakukan menggunakan larutan pengembang (eluen)
yang terdiri dari campuran n-butanol:asam asetat:akuades dengan perbandingan 4:1:3 [17].
Setelah selesai, lempeng KLT disemprot menggunakan larutan ninhydrin 0,5% (w/v) dan
kemudian dipanaskan pada suhu 110ºC selama 10 menit. Senyawa GABA yang dihasilkan
oleh isolat BAL dapat dilihat dari nilai Retention factor (Rf) yang sama dengan standar
GABA yang digunakan.

Jarak yang ditempuh subtansi

Rf =
Jarak yang ditempuholeh pelarut
Identifikasi Molekuler
Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan metode chelex [18]. Amplikasi gen 16S rRNA
dilakukan menggunakan dua primer universal bakteri yaitu primer forward 27F (5’-
TACGGYTACCTTGTTACGACTT- 3’) dan primer reverse 1492R (5’-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’).
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan alat Thermal Cycler Chain Reaction (PCR )
dengan kondisi PCR sebagai berikut denaturasi awal 950C selama 1 menit, selanjutnya diikuti
dengan 35 siklus PCR yang terdiri dari denaturasi pada suhu 950C selama 15 detik,
annealing pada suhu 550C selama 15 detik, elongation pada suhu 720C selama 4 menit dan
final elongation pada suhu 720C selama 4 menit.
Cocktail PCR mix untuk 16S rRNA terdiri atas 25 µL MyTaq HS Red Mix (ready use), 1 µL
primer 27F dan primer 1492R, 19 µL ddH2O dan 4 µL DNA template, sehingga total volume
cocktail PCR masing-masing sampel bakteri adalah 50 µL.
Hasil PCR divisualisasi melalui elektroforesis dengan gel agarosa 1%. Hasil PCR DNA
genom sampel isolat BAL selanjutnya disekuensing dengan menggunakan jasa perusahaan
Biologi Molekuler PT. Genetika Science Indonesia yang selanjutnya dikirim ke laboratorium
1stBASE Asia.
Hasil sekuensing DNA sampel BAL potensial disejajarkan menggunakan program MEGA X
lalu dianalisis lebih lanjut kesamaan sekuennya dengan data yang ada di GenBank
menggunakan BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) yang diakses melalui situs
www.ncbi.nlm.nih.gov untuk mengetahui spesies isolat bakteri asam laktat potensial.
Analisis filogenetik dan konstruksi pohon filogenetik menggunakan program multiple
alignment Clustal W. Konstruksi jarak kekerabatan genetik menggunakan metode Neighbor
joining dengan derajat kepercayaan (value of confidence? Link
https://www.researchgate.net/post/What_is_a_bootstrap_value ) menggunakan bootstrap value
pada program NJ plot [19].
Results
Isolation and Karakterisasi Morfologi BAL
Lima koloni yang dikategorikan BAL dengan zona bening disekitar koloni dengan warna
permukaan putih kekuningan, bentuk sel bacil, coccus dan non-motil, bakteri Gram positive,
dan negatif terhadap katalase serta toleransi terhadap pH rendah (pH4) dan isolat ini
memiliki toleransi viabilitas pada suhu 10℃, 45℃ dan 50℃ (Table-1).
Identifikasi produksi GABA
Identifikasi GABA dengan menggunakan metode KLT (Silica gel F254, Merck) dengan dua
perlakuan, yaitu dengan pemberian MSG 1% dan tanpa MSG. KLT dilakukan menggunakan
larutan pengembang (eluen) yang terdiri dari campuran n-butanol:asam asetat:akuades
dengan perbandingan 4:1:3 [17]. Lima isolat masing-masing teridentifikasi menunjukkan
adanya GABA dengan terbentuknya spot warna yang sama dengan standar GABA
(Pregabalin). Nilai Rf standar GABA (Pregabalin). : 0,60 dan MSG: 0,29, sedangkan BAL
dengan pemberian MSG1% masing-masing yaitu 2PKB:0,58 ; 2PKT:0,57 ; 2KH:0,51 ;
2ST:0,51 ; 3SP: 0,53 dan nilai Rf tanpa pemberian MSG yaitu 2PKB: 0,51; 2PKT:0,51;
2KH: 0,51; 2ST: 0,51; 3SP: 0,51 (Tabel-2).
Molecular identification
Dua isolat BAL menghasilkan nilai Rf yang tinggi dan dipilih untuk diidentifikasi sekuens
gen 16 rRNA dan analisis filogenetik. Gen pengkode 16S rRNA dapat digunakan untuk
menentukan taksonomi, filogeni (hubungan evolusi) serta memperkirakan jarak keragaman
antar spesies (rates of species divergence) bakteri. Metode ekstraksi DNA yang digunakan
dalam penelitian ini adalah metode Chelex 100 [18].
Hasil amplikasi DNA menunjukan pita DNA sampel BAL potensial kode isolat 2PKB dan
2PKT berukuran sekitar 1500 bp (base pair) (Gambar 2). Kemudian dianalisis dengan
program BLAST yang diakses melalui situs NCBI. Hasil analisis sekuen 16S rRNA
menggunakan program BLAST menunjukan isolat 2PKB memiliki kemiripan dengan
Lactobacillus fermentum strain HB dengan kesamaan homologi sebesar 98% dan isolat
2PKT memiliki kemiripan dengan Lactobacillus fermentum strain HT dengan kesamaan
homologi sebesar 99%, dengan query cover 100%. E value dari kedua sampel penelitian
menunjukan nilai 0. Berdasarkan hasil BLAST yang diperoleh selanjutnya diperkuat dengan
rekonstruksi pohon filogenetik metode Neighbor Joining untuk mengetahui hubungan
kekerabatan antar spesies berdasarkan pada kemiripan dan perbedaan karateristik fisik atau
genetik. Pohon filogenetik dalam penelitian ini dibuat menggunakan aplikasi Molecular
Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 10) (Gambar-4).
Discussion
Isolation and Karakterisasi Morfologi BAL
Lima bakteri asam laktat yang berhasil diisolasi dan dianalisis lebih lanjut berdasarkan
perbedaan karakteristik secara morfologi makroskopis dan mikroskopis. BAL diisolasi
dengan menggunakan media MRSA dan ditambahkan dengan CaCO3 sebagai indikator suatu
koloni bakteri mampu menghasilkan asam.
Asam yang disekresikan keluar dari koloni selanjutnya akan bereaksi dengan CaCO3 yang
ada di dalam medium MRS agar sehingga akan terbentuk zona bening di sekitar koloni.
Koloni ini diprediksi sebagai koloni bakteri asam laktat. Uji biokimia dilakukan untuk
Setelah karakterisasi didapat lima
memastikan sebagai bakteri asam laktat.
koloni yang dikategorikan BAL dengan warna permukaan
putih kekuningan, bentuk sel bacil, coccus dan non-motil,
bakteri Gram positive, dan negatif terhadap katalase serta
toleransi terhadap pH rendah (pH4) dan tidak dapat tumbuh
pada pH tinggi (pH 9,6) yang diuji selama 48 jam, dan isolat
ini memiliki toleransi viabilitas pada suhu 10℃, 45℃ dan
50℃.
Titik please: Bakteri gram positif. BAL diuji selama 48 jam
dan menunjukan reaksi negatif terhadap katalase, toleran
terhadap pH (pH 4) rendah dan tidak dapat tumbuh pada pH
tinggi (pH 9,6). Isolat memiliki toleransi viabilitas pada suhu
10 ℃, 45 ℃ dan 50 ℃.
Identifikasi produksi GABA
Hasil identifikasi menggunakan metode KLT dengan larutan pengembang (eluen) yang
terdiri dari campuran n-butanol:asam asetat:akuades dengan perbandingan 4:1:3. Proses
perendaman lempeng KLT hingga eluen mencapai garis batas dibutuhkan waktu selama 1
jam. Senyawa GABA dapat ditentukan secara kualitatif dengan metode KLT menggunakan
lempeng alumunium yang direndam pada larutan pengembang (eluen) dan disemprot dengan
larutan ninhydrin 0,5% sebagai reagen pewarna dan akan terbentuk spot berwarna yang
ditunjukan pada (Gambar-2). KLT merupakan metode pemisahan komponen dengan prinsip
kerjanya (nya dihapus aja, subjeknya kan KLT) memisahkan sampel berdasarkan perbedaan
kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Pemilihan eluen berdasarkan
polaritas senyawa dan biasanya merupakan campuran beberapa cairan yang berbeda
polaritas, sehingga didapat perbandingan tertentu [28]. Lima isolat masing-masing (kalo
masingmasing diganti yang) teridentifikasi menunjukkan adanya GABA dengan
terbentuknya spot warna yang sama dengan standar GABA (Pregabalin).
Kalo pake yang jadinya the five identified isolates were (each of 5 itu aneh lho)
Spot warna menunjukkan adanya senyawa kimia yang terseparasi oleh fase gerak eluen dan
terwarnai oleh larutan pewarna [16]. Menurut Kook dan Cho, (2013), spot dari GABA dan
MSG dapat secara mudah dikonfirmasi dengan larutan standar GABA karena GABA dan
MSG terdeteksi dengan titik (spot) warna merah ketika disemprot dengan larutan ninhydrin.
GABA mempunyai struktur kimia yang hampir sama dengan glutamate [25]. Telah
dilaporkan bahwa bakteri asam laktat yang diisolasi dari berbagai macam makanan
fermentasi seperti kimchi dan makanan laut (seafood) mampu memproduksi GABA
menggunakan substrat asam glutamat. Pharma Food company (Japan) telah memproduksi
GABA dengan mengubah monosodium glutamate menggunakan bakteri asam laktat yang
diisolasi dari kimchi dan dipasarkan sebagai bahan makanan fungsional dan telah dilaporkan
untuk memproduksi 6,3 mM GABA dengan menginokulasikan Lactobacillus brevis IFO
12005 yang diisolasi dari kimchi untuk Soju jugemi yang dibuat dari beras [26, 27], 302 mM
GABA dengan penambahan fosfat piridoksal sebagai koenzim dari GAD oleh Lb. paracasei
NFRI7415 yang diisolasi dari makanan fermentasi tradisional Jepang funasushi [21].
Nilai Rf dengan pemberian MSG1% dan nilai Rf tanpa pemberian MSG terdapat perbedaan
hasil nilai Rf (Tabel-2). Penambahan MSG 1% cukup berpengaruh saat fermentasi produksi
GABA, nilai Rf dari kultur bakteri asam laktat yang diberi penambahan MSG lebih tinggi
dibandingkan dengan kultur bakteri tanpa pemberian MSG. Hal ini diperkuat oleh Harnentis
(2019) yang menyatakan bahwa produksi senyawa GABA oleh BAL juga dipengaruhi oleh
pH, suhu, konsentrasi asam glutamate, ekstrak ragi, sumber nitrogen, glukosa, dan waktu
inkubasi [7]. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang
rendah, begitu juga sebaliknya. Fase diam bersifat polar dan senyawa yang lebih polar akan
tertahan kuat pada fase diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. Berdasarkan hasil
penelitian nilai Rf dengan pemberian MSG1% dan tanpa MSG sesuai dengan pernyataan dari
bahwa Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2-0,8 jika Rf terlalu tinggi, yang harus
dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan sebaliknya [28].
Kepolaran eluen sangat berpengaruh terhadap nilai Rf ( retention factor) yang diperoleh.
Nilai Rf didefinisikan sebagai perbandingan jarak yang ditempuh oleh senyawa pada
permukaan fase diam dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut sebagai fase gerak.
Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa
tersebut pada plat kromatografi lapis tipis saat membandingkan dua sampel yang berbeda di
bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang
polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis nilai Rf
sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu [28]. Hal tersebut dapat
digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel.
Perbedaan nilai RF dari hasil penelitian dikarenakan adanya perbedaan perlakuan terhadap
bakteri uji dengan penambahan MSG yang dapat mengkatalis senyawa GABA. Hal ini sesuai
dengan pernyataan Wu & Shah (2015) bahwa GABA merupakan suatu asam amino non-
protein hasil dekarboksilasi glutamat yang dikatalis oleh enzim glutamat dekarboksilase
(GAD) dapat dihasilkan oleh BAL karena BAL memiliki aktivitas enzim GAD dalam selnya.
GAD, enzim intraseluler BAL ini dapat mengkonversi GABA dari substratnya berupa
glutamat atau garamnya, beberapa peneliti telah melaporkan bahwa penambahan glutamat
atau garamnya dapat meningkatkan kandungan GABA pada berbagai media kultur [20].
Umumnya, BAL menghasilkan GABA secara maksimum pada akhir fase stasioner, hal ini
mendasari konsentrasi GABA tertinggi diperoleh pada jam ke 72 dimana keasaman dan
kekurangan nutrisi akan mempengaruhi aktivitas metabolik BAL, kondisi asam ini
mengaktifkan enzim GAD [20]. Selain waktu inkubasi, konsentrasi MSG juga
mempengaruhi produksi GABA disebabkan oleh peningkatan substrat di sekitar sitosolik
enzim GAD [21, 22].
Hasil yang sama juga diperoleh oleh Villegas et al., (2016), L. brevis CRL 1942 (apa yang
ditumbuhkan?) yang ditumbuhkan dalam media berisi MSG tidak menunjukkan fase
pertumbuhan yang berbeda dengan medium tanpa MSG [23]. Dengan demikian, dapat
disimpulkan bahwa penambahan MSG dalam media pertumbuhan BAL tidak mempengaruhi
pertumbuhan BAL tersebut. Hal ini dapat dikarenakan proses dekarboksilasi MSG menjadi
GABA oleh enzim GAD yang dapat mengurangi keasaman intraselular sel sehingga dapat
menjaga viabilitas sel selama kondisi asam.
Analisa Urutan Gen 16S rRNA sui wu’u Penghasil GABA dengan nilai Rf Tertinggi
Berdasarkan hasil identifikasi GABA pada plat KLT terhadap lima kultur BAL-sui wu’u
penghasil GABA, dua isolat yaitu 2PKB dan 2PKT dipilih sebagai isolat BAL penghasil
GABA (ini masuknya noun phrase, bacanya dari belakang. Isolat BAL penghasil GABA
jadinya: GABA producer LAB isolate. Cuman fyi aja bukan koreksi) yang memiliki nilai Rf
GABA tertinggi. Isolat ini kemudian dianalisa urutan basanya (kurangi pake nya kalo bikin
nulis inggris, susah soalnya. Kebanyakan nya itu jadi its sedangkan kalo pasif kayaknya
jarang pake its) dengan gen 16S rRNA. Kultur murni 2PKB dan 2PKT disiapkan untuk
dijadikan template pada PCR koloni. Sebagaimana terlihat hasil elektroforesis produk PCR
murni (Gambar-3). Isolat 2PKB dan 2PKT muncul dengan panjang fragmen antara 1000-
1500 bp. Berdasarkan penelusuran primer BLAST pada halaman NCBI, fragmen DNA
sebesar 1000-1500 bp yang muncul dengan dua pasang primer universal yang digunakan
dalam penelitian ini merupakan Lactobacillus sp. Hal ini sesuai (jujur saya agak ragu kalo
soal ini karena di jurnal contoh g ada, tapi kayaknya si udah bener soalnya sampai saat ini
masih fakta) dengan hasil analisis urutan gen 16S rRNA, isolat 2PKB dan 2PKT
teridentifikasi sebagai Lactobacillus fermentum strain HB (nomor akses MN589591.1)
dengan nilai identifikasi dan query cover 100% dan 98,93% dan Lactobacillus fermentum
strain HT (nomor akses MN589592.1) dengan nilai identifikasi dan query cover 100% dan
99,23%. Untuk melihat kekerabatannya, pohon filogenetik isolat 2PKB dan 2PKT dianalisa
menggunakan metode neighbor joining (Gambar-4).
Wu dan Shah (2016), melaporkan bahwa L. fermentum merupakan salah satu spesies yang
telah ditemukan gen pengkode enzim GAD dalam selnya [29]. Hal serupa juga dilaporkan
oleh Woraharn et al., (2014) yang menyebutkan L. fermentum merupakan BAL penghasil
enzim GAD sehingga pada kondisi yang sesuai dapat mengkatalis pembentukan GABA dari
glutamat atau garamnya [30]. Hal ini disebabkan adanya enzim GAD pada L. fermentum.
Enzim GAD pada L. fermentum bahkan telah dikloning, dipurifikasi, diimobilisasi dan
digunakan untuk mengkonversi glutamat menjadi GABA [31], dan mengevaluasi BAL
penghasil GABA dari paocai tradisional, keju dan produk susu, ikan fermentasi tradisional,
usus ikan dan produk kimchi [33,34].
Conclusion
Lima isolat BAL yang berhasil diisolasi dari sui wu’u berpotensi mampu menghasilkan
senyawa GABA, dua isolat menunjukkan nilai Rf tertinggi yaitu, 2PKB= 0,58 dan 2PKT=
0,57. Dua isolat tersebut berhasil diidentifikasi sebagai bakteri asam laktat yaitu sebagai
Lactobacillus fermentum strain HB (nomor akses MN589591.1) dan Lactobacillus
fermentum strain HT (nomor akses MN589592.1) dengan nilai identifikasi 100% dan query
cover 99,23%.