FENOLIK

& FLAVONOID
 PRAKTIKUM 11
PENETAPAN KADAR FENOL DAN FLAVONOID
TOTAL DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI
Tujuan Praktikum
Setelah mengikuti praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat
melakukan pengujian kuantitatif penetapan kadar senyawa fenolik dan
flavonoid total dari ekstrak menggunakan metode spektrofotomteri
(Perhitungan pembuatan larutan stok, pengenceran)
(Perhitungan pembuatan larutan seri konsentrasi)
(Perhitungan penentuan kadar)
 PROSEDUR KERJA
1. Persiapan Bahan
Daun segar Sauropus androgynus (L.) Merr. dikeringkan selama beberapa hari
dengan cara dijemur dibawah sinar matahari tidak langsung (ditutupi kain hitam).

Dikeringkan, diserbuk
dengan ayakan mesh no.40
Daun segar Sauropus androgynus (L.) Merr.)

Sumber pustaka: ‘The Effect of Ethanol Concentrations as The Extraction Solvent on Antioxidant Activity of Katuk (Sauropus androgynus
(L.) Merr.) Leaves Extracts’, Ni putu ermi dkk (2020), IOP Conf. Series: Earth and Environmental Science 755 (2021) 012060
2. Proses Ekstraksi
Ekstraksi serbuk daun katuk kering (150,0 g) dilakukan dengan metode maserasi dingin
mengikuti Farmakope Herbal Indonesia. Pelarut yang digunakan adalah etanol dengan
konsentrasi 96%. Proses ekstraksi dilakukan selama 24 jam. Filtrat dipisahkan dari residu
menggunakan kertas saring Whatmann. Residu dimaserasi ulang sebanyak 3 kali. Filtrat
dipekatkan menggunakan rotary evaporator N-1200 BS series dari EYELA (Shanghai, China)
pada suhu 50 °C dan menggunakan penangas air pada suhu 50 °C hingga diperoleh ekstrak
kental (Kementerian Kesehatan Republik Indonesia). Indonesia, 2008).
3. Skrining kandungan fenolik pada ekstrak
Contoh hasil

Bagaimana seharusnya hasil positif dari pengujian

dengan penambahan FeCl3 tersebut?
4. PENENTUAN KADAR FENOLIK TOTAL
1. Pembuatan Larutan Uji Konsentrasi 10.000ppm

2. Pembuatan Larutan Na2CO3 7,5%

Sebanyak 7,5 g Na2CO3 ditambah 80 ml air suling, kemudian didihkan

sampai serbuk Na2CO3 larut sempurna. Setelah itu diamkan selama 24
jam, disaring dan diencerkan dengan air suling sampai volume 100 ml
(Alfian dan Susanti 2012).
3. Pembuatan Larutan Stok Asam Galat

4. Pembuatan Larutan Folin-Ciocalteu

Sebanyak 1 ml Folin-Ciocalteu diambil dan dilarutkan dengan aquadest

10 ml (1:10) kocok hingga homogen.
5. Penentuan Panjang Gelombang
Maksimum Asam Galat
Sebanyak 300 µL dari larutan asam galat
(1000 ppm) dipipetkan kemudian dicukupkan
kedalam labu ukur 10 ml dengan aquadest
dan kocok ad homogeny (30 ppm). Larutan
30 ppm diambil 500 µl dan tambahkan
larutan reagen Folin Ciocalteu sebanyak 1 ml,
homogenkan, kemudian diamkan selama 3
menit. Larutan tersebut ditambahkan
larutan Na2CO3 7,5 % sebanyak 1,5 ml dan
homogenkan. Absorbansi diukur pada
panjang gelombang antara 400-800 nm
dengan menggunakan spektrofotometer UV-
VIS

Larutan asam galat yang dipipet dari larutan induk untuk menghasilkan larutan
asam galat 30 ppm adalah 300 µL
Contoh Panjang
Gelombang
maksimum asam
galat diukur pada
panjang gelombang
400-850 nm
6. Penentuan Operating Time
Penentuan Operating Time pada konsentrasi asam galat yaitu 30 ppm diukur dalam
rentang waktu 0-60 menit pada panjang gelombang maksimum yang telah
diperoleh (765 nm).

7. Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Galat

Diambil 160, 290, 420, 550, 680 µl Dibuat larutan asam galat dengan konsentrasi 8
ppm, 14,5 ppm, 21 ppm, 27,5 ppm, 34 ppm. Menggunakan mikropipet dimasukan
kedalam tabung reaksi. Ditambahkan 1 mL larutan Folin-Ciocalteu. Kemudian
dihomogenkan selama 1 menit. Larutan ditambahkan 1,5 ml Na2CO3 7,5%.
Kemudian larutan diinkubasi selama operating time yaitu 60 menit. Diukur
absorbansinya pada panjang gelombang maksimum dan didapat kurva kalibrasi
asam galat serta persamaan garis linear y = ax + b.
Pembuatan kurva kalibrasi
larutan baku asam galat dibuat
menjadi beberapa konsentrasi
dengan rumus, sebagai berikut:
Panjang gelombang maksimum asam galat = 765 nm
Absorbansi = 0,7018 µg/ml
A =a.b.c
0,7018 = a. 1 cm. 30 ppm
a = 0.024
keterangan:
A = absorbansi panjang gelombang
a = tetapan absorptivitas
b = tebal kuvet (1 cm)
c = konsentrasi (ppm)
Pembuatan Kurva Baku Asam Galat

Contoh

Konsentrasi dan Absorbansi Larutan Asam Galat

8. Penetapan Kadar Fenol Total
Larutan Uji 10.000 ppm ekstrak yang telah
diperoleh kemudian dipipet sebanyak 1 ml dalam
labu ukur 10 mL dan dicukupkan dengan aquadest
(1000 ppm). Larutan 1000 ppm diambil 0.5 ml dan
direaksikan 1 ml reagen Folin-Ciocalteu, inkubasi Keterangan :
selama operating time yaitu 60 menit. Kemudian F : Kadar Fenol
ditambahkan 1,5 ml Na2CO3 7.5%. Absorbansi X
Fp
: Konsentrasi asam galat (µg/ml)
: Faktor pengenceran
larutan ekstrak diukur dengan spektrofotometer v : Volume sampel (mL)
UV-VIS pada panjang gelombang 765nm. m : Berat sampel (g)
Contoh perhitungan
kadar fenolik dalam
sampel
5. PENENTUAN KADAR FLAVONOID TOTAL
Skrining kandungan flavonoid pada ekstrak

Contoh hasil
Bagaimana seharusnya hasil positif dari pengujian dengan
penambahan Serbuk Mg dan HCl pekat tersebut?

Sebutkan pengujian lain untuk skrining flavonoid selain

menggunakan Mg dan HCl pekat?
1. Pembuatan larutan baku primer kuersetin

2. Pembuatan larutan baku sekunder kuersetin

Dari larutan baku induk dipipet sebanyak 1 mL masukan dalam labu ukur 10 mL
selanjutnya cukupkan volumenya sampai 10 mL dengan metanol p.a sehingga
diperoleh konsentrasi 100 ppm (Asmorowati & Lindawati, 2019).
V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 1000 ppm = 10 mL . 100 ppm
V1 = 1 mL
3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (ƛ maks)
Larutan baku sekunder kuersetin 100 ppm diambil sebanyak 0,5 mL masukan dalam
labu ukur 5 mL ditambahkan 1,5 mL metanol p.a, 0,1 mL AlCl3 10%, 0,1 mL kalium
asetat 1M dan aquadest 2,8 mL. Biarkan bereaksi selama waktu operating time
yang didapat pada suhu ruang Lakukan pembacaan dengan spektrofotometri Uv-Vis
pada panjang gelombang 400 - 800 nm (Hanani, 2015). Hasil panjang gelombang
maksimum tersebut digunakan untuk mengukur serapan dari sampel ekstrak etanol
96% daun katuk.

4. Penentuan Operating Time

Penentuan Operating Time pada konsentrasi kuersetin yaitu 100 ppm dibiarkan
bereaksi selama 30 menit, absorbansi di ukur pada rentan waktu 0-90 menit dan
absorbansinya pada panjang gelombang maksimum teoritis 415 nm.
5. Pembuatan Kurva Kalibrasi Kuersetin

Hasil yang di peroleh digunakan untuk

memperoleh kurva kalibrasi dan persamaan
regresi linear antara hubungan konsentrasi
kuersetin dengan absorbansi. Rumus regresi
linear diuraikan sebagai berikut
(Yanlinastuti & Fatimah, 2016):
Y = bx ± a

keterangan:
Y = Absorbansi
x = konsentrasi
a = intercept
b = slope
 Contoh

Hasil Konsentrasi dan Absorbansi Kurva Standar Kuersetin

7. Pembuatan Larutan sampel (10.000 ppm)

8. Penetapan kadar Flavonoid

Pengenceran 5000 ppm dibuat dari larutan induk dengan cara pipet larutan sampel
sebanyak 5 mL dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL cukupkan dengan metanol
sampai tanda batas. Selanjutnya pipet dari larutan sekunder sebanyak 0,5 mL
ditambahkan 1,5 mL metanol p.a, 0,1 mL AlCl3 10%, 0,1 mL kalium asetat 1M dan
aquadest 2,8 mL. selanjutnya inkubasi pada suhu kamar selama 30 menit,
absorbansi campuran diukur dengan spektrofotometer UV-VIS pada panjang
gelombang maksimum. Lakukan sebanyak tiga kali pengulangan.
 ֍LATIHAN 1
Hitunglah nilai a, b dan R dari table berikut menggunakan kalkulator !
 ֍LATIHAN 2
Pada penetapan kadar flavonoid, diperoleh kurva kalibrasi larutan
kuersetin sebagai berikut:

Diketahui absorbansi (y) = 0,451. Berapakah konsentrasi kuersetin dalam larutan ?

֍LATIHAN 3
Larutan Uji 10.000 ppm ekstrak dipipet sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 ml
reagen Folin-Ciocalteu, inkubasi selama operating time yaitu 60 menit. Kemudian
ditambahkan 4 ml Na2CO3 7.5% dan cukupkan dengan air sampai volume 10 ml.
Absorbansi larutan ekstrak diukur dengan spektrofotometer UV-VIS pada panjang
gelombang 765nm. Berapa Fp ?
֍LATIHAN 4
Larutan sampel uji dibuat dengan menimbang fraksi etil asetat ekstrak methanol
daun lada sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan dalam 10 ml metanol. Larutan
fraksi tersebut dipipet sebanyak 0,5 ml, dicampur dengan 2 ml reagen Folin-
ciocalteu dan diinkubasi selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 4 ml larutan
Na2CO3 7,5%, kemudian diamkan selama operating time dan dibaca pada panjang
gelombang 753nm. Berapakah Faktor pengencerannya ?

Jawab :
1. Perhatikan kalimatnya, bahwa larutan stok 10 mg dalam 10 ml langsung
dipipet sebanyak 0,5ml untuk direaksikan dengan reagen Folin Ciocalteu,
diinkubasi, ditambah Na2CO3 dan diukur panjang gelombangnya.
2. Artinya, tidak ada pembuatan larutan sekunder maka proses pengenceran
tidak dilakukan. Sehingga Faktor pengencerannya sama dengan 1.
SEKIAN