1.

Metode analisis yang digunakan memiliki prinsip mengubah asam lemak menjadi

turunannya, yaitu metil ester sehingga dapat terdeteksi oleh alat kromatografi. Gas

Chromatography (GC) memiliki prinsip kerja pemisahan antara gas dan lapisan tipis cairan

berdasarkan perbedaan jenis bahan (Fardiaz 1989). Hasil analisis akan terekam dalam suatu

lembaran yang terhubung dengan rekorder dan ditunjukkan melalui beberapa puncak pada waktu

retensi tertentu sesuai dengan karakter masing-masing asam lemak. Sebelum melakukan injeksi

metil ester, terlebih dahulu lemak diekstraksi dari bahan lalu dilakukan metilasi sehingga

terbentuk metil ester dari masing-masing asam lemak yang didapat.

a) Tahap ekstraksi

Lemak diperoleh dengan metode Soxhlet. Pada tahap ini diperoleh lemak dalam bentuk

minyak. Kemudian, dari sampel tersebut ditimbang lemak sebanyak 0,02-0,03 g untuk

dilanjutkan pada tahap metilasi.

b) Pembentukan metil ester (metilasi)

Tahap metilasi dimaksudkan untuk membentuk senyawa turunan dari asam lemak

menjadi metil esternya. Asam-asam lemak diubah menjadi ester-ester metil atau alkil yang

lainnya sebelum disuntikkan ke dalam kromatografi gas. Metilasi dilakukan dengan merefluks

lemak di atas penangas air dengan pereaksi berturut-turut NaOH-metanol 0,5 N, BF 3 dan n-

heksana. Sebanyak 0,02 g minyak dari sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan

ditambahkan 5 ml NaOH-metanol 0,5 N lalu dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit

pada suhu 80 oC. Larutan kemudian didinginkan. Sebanyak 5 ml BF3 ditambahkan ke dalam

tabung lalu tabung dipanaskan kembali pada waterbath dengan suhu 80 oC selama 20 menit dan

didinginkan. Kemudian ditambahkan 2 ml NaCl jenuh dan dikocok. Selanjutnya, ditambahkan 5

ml heksana, kemudian dikocok dengan baik. Larutan heksana di bagian atas larutan dipindahkan

dengan bantuan pipet tetes ke dalam tabung reaksi. Sebanyak 1 μl sampel lemak diinjeksikan ke

dalam gas chromatography. Asam lemak yang ada dalam metil ester akan diidentifikasi oleh

flame ionization detector (FID) atau detektor ionisasi nyala dan respon yang ada akan tercatat

melalui kromatogram (peak).

c) Identifikasi asam lemak

Identifikasi asam lemak dilakukan dengan menginjeksikan metil ester pada alat

kromatografi gas-spektroskopi massa Shimadzu QP 2010 dengan kondisi sebagai berikut : gas

yang digunakan sebagai fase bergerak adalah gas nitrogen dengan laju alir 30 mL/menit dan

sebagai gas pembakar adalah hidrogen dan oksigen, kolom yang digunakan adalah capilary

column merk Quadrex dengan diameter dalam 0,25 mm.

Prosedur Kerja Analisis Minyak Goreng dengan GC-MS

Prosedur kerja yang dilakukan terdiri dari dua tahapan yaitu persiapan sampel dan proses analisis

menggunakan kromatografi gas. Tahapan persiapan sampel adalah proses

Larutan uji hasil preparasi dipindahkan kedalam vial baru khusus injektor, lalu diletakkan pada

alat GC-MS untuk diinjeksikan secara otomatis. Alat GC-MS diatur pada kondisi suhu kolom

awal (oven) 120oC, suhu injeksi 250oC, tekanan kolom 117.6 KPa, total flow fase gerak gas

Helium sebesar 50.0 mL/menit, dan column flow 1.45 mL/menit. Mode ionisasi yang digunakan

adalah Electron Ionization (EI) dengan detektor electron multiplier sedangkan mass analyzer

yang digunakan adalah quadrupole mass analyzer. Kemudian syringe dibilas sebanyak 2 kali
dengan heksana (presolvent), lalu bilas dengan sampel sebanyak 3 kali. Larutan uji sebanyak 1

μL disuntikkan ke dalam alat GLC dengan sistem injeksi langsung spitless mode dan suhu

injektor 270oC. Suhu kolom diatur secara gradien, dengan suhu kolom awal 120 oC yang

dipertahankan selama 6 menit, kemudian dinaikkan hingga 230oC dengan laju peningkatan suhu

3.0oC/menit hingga 25 menit. GC-MS running selama 67 menit, lalu diperoleh hasil

kromatogram dan spektra massa dari 5 puncak terpilih.

Prosedur Kerja Penentuan Asam Lemak secara Kualitatif dengan GCMS

Penentuan asam lemak secara kualitatif dilakukan dengan membandingkan similiarity index dan

spektra massa dari asam lemak pada database GC-MS. Semakin tinggi angka similarity index

menandakan bahwa senyawa yang dianalisis makin mirip dengan database senyawa tertentu.

Spektra massa yang dibandingkan merupakan spektra massa dengan similarity index tertinggi.

Prosedur Kerja

Prosedur kerja yang dilakukan terdiri dari dua tahapan yaitu persiapan sampel dan proses analisis

menggunakan kromatografi gas. Tahapan persiapan sampel adalah proses metilasi asam lemak

agar menjadi FAME yang bersifat volatil. Tahapan reaksi metilasi terdiri dari reaksi penyabunan

dimana 1,5 ml NaOH metanolik 0,5 N ditambahkan kepada sekitar 100 mg sampel minyak

goreng yang sebelumnya telah ditambahkan 1 ml standar internal (SI) pada tabung reaksi

bertutup. Pengadukan pada tahapan persiapan yang dilakukan terhadap campuran dengan vortex,

dilakukan dengan sebelumnya menambahkan terlebih dahulu gas N2. Setelah itu, campuran

dipanaskan dalam penangas bersuhu 80-90oC selama 5 menit. Kemudian didinginkan. Setelah

itu, dilanjutkan dengan penambahan 2 ml BF3, dilakukan pengadukan dengan vortex, lalu

dipanaskan pada penangas air bersuhu sama dengan sebelumnya selama 30 menit untuk
mempercepat terjadinya reaksi pembentukan FAME dari sabun asam lemak. Setelah

didinginkan, ke dalam tabung reaksi ditambahkan 1 ml heksan untuk mengekstrak FAME dari

sampel dan alkohol, serta ditambahkan 3 ml larutan NaCl jenuh untuk memperjelas bidang

pemisahan antara ekstrak dan alkoholnya. Bagian heksan dibagian atas dipindahkan ke dalam

vial, kemudian ditambahan Na2SO4 anhidrous untuk memerangkap air sehingga mencegah

adanya air di dalam bahan uji. Setelah itu, sampel dimasukkan ke dalam vial kedua dengan hati-

hati agar Na2SO4 anhidrous tidak ikut terbawa ke dalam vial kedua. Sampel lalu dianalisis

Persiapan Sampel Tahu dan Tempe Sampel tahu dan tempe yang diperoleh dari pasar telaga

dicuci sebanyak dua kali dengan aquadest. Kemudian dipotong kecil-kecil yang selanjutnya

dikeringkan dalam oven pada suhu 650C. Setelah sampel kering dilanjutkan dengan

menghaluskan masing-masing sampel dengan blender sehingga terbentuk serbuk.

Ekstraksi Minyak Tahu dan Tempe dengan Metode Soxhletasi Sebanyak 200 g serbuk tahu

dan tempe masing-masing diekstraksi menggunakan ekstraktor soxhlet menggunakan pelarut n-

heksana. Ekstrak n-heksana kemudian dipekatkan dalam rotary evaporator pada temperatur 50 0C

sehingga diperoleh minyak tahu dan tempe pekat. Kemudian minyak tahu dan tempe yang

diperoleh masing-masing dihitung rendemennya dengan rumus dibawah ini:

Tahap Hidrolisis Minyak Tahu dan Tempe Sebanyak 25 g minyak tahu dimasukkan kedalam

labu leher tiga. Kemudian ditambahkan 50 mL metanol dan 50 mL larutan KOH 12%. Campuran

direfluks dengan pengadukan pada temperatur 600C selama 90 menit. Hasil refluks dimasukkan

kedalam corong pisah dan ditambahkan dengan 125 mL aquades serta 31,25 mL n-heksana.

Larutan dikocok dengan kuat dan didiamkan sampai terbentuk dua lapisan yaitu lapisan air dan

lapisan organik. Lapisan air dipisahkan dari lapisan organik. Lapisan air ditambahkan dengan

asam sulfat 1 M sampai pH 1. Asam lemak bebas dipisahkan dari lapisan air. Adapun minyak
tempe juga menggunakan prosedur yang sama.

Tahap Esterifikasi Asam Lemak Bebas Minyak Tahu dan Tempe Sebanyak 10 g asam lemak

tahu dan tempe masing-masing dimasukkan kedalam labu leher tiga yang dilengkapi dengan

termometer. Selanjutnya ditambahkan 8,7 mL metanol dan 0,087 mL (87 µL) H2SO4 pekat.

Kemudian campuran tersebut direfluks selama 1 jam pada temperatur 50 0C. Campuran hasil

refluks selanjutnya didinginkan dan dimasukkan dalam corong pisah. Selanjutnya ditambahkan

20 mL aquades dan dilanjutkan dengan penambahan larutan NaHCO 3 tetes demi tetes sambil

dikocok dan diukur pH dengan indikator universal hingga netral. Setelah itu dilakukan salting

out dengan menambahkan 5 mL larutan NaCl jenuh hingga campuran terpisah sempurna.

Larutan dikocok dengan kuat dan didiamkan hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan organik

ditambahkan magnesium sulfat anhidrat.

Identifikasi Asam Lemak Identifikasi asam lemak dilakukan dengan menginjeksikan metil ester

minyak tahu dan tempe pada alat kromatografi gas-spektroskopi massa Shimadzu QP 2010.

Dengan demikian spektrum yang terdeteksi oleh KG-SM merupakan spektrum dari metil ester

asam lemak. Analsis dilakukan menggunakan kromatografi gas-spektroskopi massa model

Shimadzu QP 2010 pada kondisi berikut ini: Temperatur oven kolom 80 0C, temperatur injeksi

3100C, tekanan 10,9 kPa, total aliran 72,5 mL/menit, laju alir 24,8 cm/detik dan aliran kolom 0,3

mL/menit.