KROMATOGRAFI

Materi III
KROMATOGRAFI
Kromatografi merupakan salah satu cara pemisahan dengan
dasar analisis menggunakan :

f.tetap (stationery) = fs
Dua fasa
f.gerak (mobile)  f.cair = fm

Pemisahan tergantung pada gerakan relatif dua fasa

Dari sifat-sifat kedua fasa  Kromatografi digolongkan :

Zat padat  krom serapan / Abs Chrom

f.tetap (fs)
Zat cair  krom partisi / Partition Chrom

Zat cair
f.gerak (fm)
Gas
 DIAGRAM METODA KROMATOGRAFI

SAMPEL

KOLOM DATAR

f.m CAIR f.s GAS f.m CAIR

Aliran Tekanan GLC PC / Kr Kertas TLC

Grav

P P Med P

Size Excl flash * HPLC

Chromt Chromt
 Klasifikasi kromatografi :
• 1. Tipe fase gerak/diam (k.gas; k.cair)
• 2. mekanisme terbentuknya distribusi fase =
k.adsorpsi (fase diam-padat;gerak-gas) dan
k.partisi (fase gerak dan diam = cair- cair)
• Fase diam : bbrp lapisan molekul zat cair yg
dilekatkan pada padatan sbg penyangga
• Distribusi zat terlarut dlm fase geark dan fase diam
berlangsung dengan mekanisme partisi
 Sistim Kromatografi Berdasar
Bentuk Fasa

Lapis Tipis TLC

1. fm Cair / fs Padat  Krom Serapan -----------

Penukar Ion IEC

2. fm Gas / fs Padat  Krom gas-padat GC

3.fm Cair / fs Cair  Krom Partisi / Krom Kertas

Krom gas – cair GLC

4.fm Gas / fs Cair ------------

Krom Kolom Kapiler

 Semua pemisahan dg kromatografi tergantung pada kenyataan bahwa
senyawa- senyawa yang dipisahkan tedistribusi sendiri diantara fasa
gerak dan tetap dalam perbandingan yang sangat berbeda satu sama
lain.
!
KROMATOGRAFI SERAPAN

Proses adsorbsi pada Kromatografi serapan antara lain : TLC (kromatografi lapis
tipis ) dan kromatografi penukar ion

fasa tetap (fs) berupa Zat padat berfungsi

sebagai adsorben
fasa gerak (fm) berupa Zat cair
 Permukaan partikel padat biasanya lebih aktif pada bagian dalam, dikenal
sebagai aktivitas permukaan “ Survace Activity”

Bila partikel dimasukkan dalam larutan 

permukaan partikel mempunyai daya tarik baik terhadap
zat larut atau pelarutnya.

Daya tarik / absorbsi dalam bentuk :

•Elektrostastik (Ionik)
•Daya tarik dua dipol
•Antara dipol dan dipol induksi
•Kekuatan Vander Waals

Partikel padat yang mempunyai aktivitas permukaan dalam kromatografi

dinamakan “Adsorben”.
 KESEIMBANGAN ADSORBSI
:Bila larutan mengalir melalui permukaan aktif terjadi proses adsorbsi dan
desorbsi.

Hubungan antara konsentrasi zat yang ada dalam larutan (Cm) dan yang
teradsorbsi (CS) terlukis sebagai berikut

Kurve A bentuk konveks,

A

karena adanya variasi aktivitas dari permukaan yang ada.

CS
Hubungan demikian sering dinamakan “Freunddlich Isotherm
yang terjadi umumnya pada sistem padat – cair.
Cm
 Kurve B isoterm garis lurus
B
Keadaan yang dikehendaki, permukaan tidak akan menjadi
Cs jenuh dengan zat yang diadsorbsi.

Kemiringan (slope) dari kurve isoterm garis lurus

merupakan koef distribusi dan tidak tergantung besarnya
Cm
konsentrasi.

Kurve C isoterm bentuk konkaf

Cs C
Dihasilkan dari reaksi yang terjadi sedemikian sehingga
menyebabkan mempercepat proses adsorbsi secara
keseluruhan.
Cm
 Ketiga macam perbedaan proses adsorbsi
menyebabkan terjadinya distorsi puncak

Respon
A B C

Konveks Lurus Konkaf

Puncak yang berbentuk condong (Tailing) biasanya diakibatkan adsorben terlalu

aktif.
Hal ini dapat dikurangi dengan menutup sisi aktif dengan zat lain atau dengan
menaikkan suhu, atau mengurangi banyaknya sampel yang akan dipisahkan.
 ADSORBEN

Alumina dan silika gel merupakan dua adsorben yang paling populair
penggunaannya.
Contoh : urutan absorben sesuai kemampuan adsorbsi

1. Alumina 5. Kalium Karbonat

2. Charcoal / Arang 6. Sukrosa
3. Silika Gel 7. Starch / Pati
4. Magnesia 8. Serbuk Selulosa

Aktivitas permukaan setiap adsorben berbeda.

Perlakuan pendahuluan menurut cara-cara yang ditentukan
dapat menghilangkan perbedaan aktivitas tersebut.
 Daya adsorbsi adsorben dapat diatur dg mengatur kandungan air
dinyatakan dalam skala “Brockmann”.

Contoh :
*Alumina berkadar air 3% mempunyai aktifitas yg umum digunakan.
Luas permukaan alumina 150 m2/g, kadar air cukup 5% utk pelapisannya.

*Silika gel memp luas permukaan lebih besar, 500 m 2/g tetapi
mempunyai aktivitas kimia lebih kecil dibanding Alumina

Banyak digunakan untuk pemisahan senyawa organik yang peka terhadap perubahan-perubahan karena aktivitas
permukaan yang mempunyai sifat katalik.

Hubungan skala Brockmann dan kadar air

Skala Brockmann % Kadar Air
I 1
II 3
III 6
IV 15
 ZAT PELARUT
Zat pelarut mempunyai peranan penting dalam Elusi yang dapat
menentukan baik-buruknya pemisahan

proses pemisahan solute

oleh eluen (fm)

Elusi terlalu cepat

Elusi terlalu lambat menyebabkan
tidak mampu memisahkan
waktu Retensi lama.
secara sempurna.

Sebaiknya zat pelarut

tidak tergantung dari kekuatan elusi.

Kekuatan zat elusi :

daya penyerapan pada zat penyerap
(zat pengisi) kolom.
!
 Alumina
kepolaran kekuatan penyerapan
Silika gel

Kekuatan penyerapan akan naik dengan menurunnya polaritas zat yang diserap

Menurut TRAPPE, kekuatan elusi dari deretan pelarut dalam kolom

menggunakan silika gel,

Heksan Dietil Eter

Sikloheksan Acetat
CCl4 Etil
Trikloretilen Aseton
Toluena Propanol
benzena Etanol
Metilenia Cl metanol
Kloroform Air Murni
 Menurut Williams
Pelarut-pelarut dalam kolom dengan
Adsorben “carbon aktif”

untuk pemisahan asam-asam amino dan sakarida

dalam larutan :
Air murni
Metanol
etanol
Kekuatan elusi menurun
Aseton
Propanol
Dietil Eter
Etil Asetat

Pelarut harus betul-betul murni.

 PENANGANAN CUPLIKAN

Memasukkan cuplikan dari atas kolom

merupakan hal yang sangat penting

 Cuplikan harus rata

!
 Dalam keadaan larutan yang sepekat mungkin
 Dicegah terjadinya endapan
 Dicegah terjadinya penggoncangan kolom

Untuk mendapatkan permukaan rata

 permukaan penyerap / bahan isian diberi kertas saring atau pasir yang bersih
hingga membentuk lapisan tipis.
 4 Langkah penanganan cuplikan
Pada kolom kromatografi

1.Pemasukan cuplikan melalui pipet kecil – ,

ujung pipet ditempelkan pada dinding kolom.

2.Selama zat cair lepas dari pipet, * ujung pipet digerakkan

berkeliling dalam kolom, * diupayakan ujung pipet tidak
menyentuh penyerap / bahan isian.

3.Cuplikan yang tertinggal dalam dinding kolom dicuci

dengan cara yang sama menggunakan pelarut murni.

4.Bila semua cuplikan telah turun ke bagian bahan penyerap,

bahan pelarut / ƒgerak dapat dimasukkan melalui corong
pisah.
 PENGISIAN DAN CARA KERJA KOLOM

Pengisian kolom harus dikerjakan dengan seragam.

*) Setelah adsorben dimasukkan, diseragamkan

kepadatannya dalam kolom dengan vibrator atau planger,
atau
*) adsorben dimasukkan ke dalam kolom dalam bentuk
bubur (slurry) dan partikelnya dibiarkan mengendap

** Pengisian tidak seragam menimbulkan rongga

di tengah-tengah kolom.
** Bagian dasar / bawah dan atas dari isian kolom diberi glasswool atau
sintered glass-disc untuk menyangga isian.
 Teknik Penanganan Cuplikan Tehnik kromatografi

Cad pelarut
sampel

Pipet
Kecepatan elusi
sebaiknya dibuat konstan

tergantung dari :
 Besarnya ukuran
Kertas Saring
partikel bahan isian
kolom
ben (f.padat)
 Dimensi kolom

Glass wool  Viskositas cairan

 Tekanan untuk
mengalirkan zat
pelarut
 Cair
Kromatografi Partisi
Cair

Dalam kromatografi ini

fasa tetap / stasioner tidak berupa zat padat tetapi cairan. Fasa geraknya
juga berupa cairan

~ HPLC
“High Performance Liquid Chromatography”.

Zat yang dilarutkan  terdistribusi dengan sendirinya

ƒm
diantara 2 fasa zat cair  sesuai dengan koefisien
ƒs
partisinya.
Perbedaan koef partisi dari berbagai komponen
campuran dapat dipisahkan.

Keuntungan kromatografi partisi dengan adsorbsi, :

•Daya ulangnya lebih baik

•dari data kelarutan, hasil dapat diramalkan

* Koef distribusi konstant dalam jangka konsentrasi yang agak

luas dapat menghasilkan puncak simetris lebih tajam
 Keunggulan “HPLC”

1. Dapat menangani senyawa-senyawa yang stabilitas terhadap suhu

terbatas, begitu juga volatilitasnya bila tanpa menggunakan derivatisasi.

Contoh : analisis beberapa jenis gula, dengan HPLC

tanpa derivatisasi

2. Waktu (t) pemisahan singkat  5 – 10 menit untuk (1) sampel

3. Untuk analisa Kuantitatif , presisi cukup tinggi

4. Merupakan teknik analisis yang peka, dengan resolusi

cukup baik untuk pemisahan senyawa serupa.
Efisiensi maksimal dapat dicapai dengan :
• mengatur kecepatan aliran fasa gerak
• Aliran fasa gerak kecil,  analisis memakan t yang lama.
Untuk menanggulangi hal ini perlu diperhatikan :

•Meningkatkan P aliran ƒ gerak

•Mengurangi jarak tempuh zat yang dianalisis
•Menggunakan bahan isian atau penyangga (Packing Material)

(Packing Material).
• Bahan isian sebagai penyangga harus inert
terhadap senyawa yang akan dipisahkan.

• Fasa tetap / stasioner berupa cairan yang

dilapiskan pada permukaan bahan penyangga

• Ikatan antara bahan penyangga dengan ƒ tetap dapat berupa ikatan

fisik maupun kimiawi.
 Dua tipe bahan isian yang ada dipasaran
Pellicular Beads dan Microporous Prarticle.

1.Pellicula Beads terdiri dari bagian dalam yang padat tidak berpori biasanya dari bahan
silika, dan kulit luar tipis bersifat porous, dengan ketebalan 1/30 – 1/40 dari  bagian
dalam.
Besar partikel keseluruhan  40 .m.
Kelemahan tipe ini  luar permukaan dari kulit yang berpori ,  1-25
m2/g  jarang dipakai

2. Microporous Particle / Mikropartikel

Ukuran antara 3-10 .m  memberikan luas permukaan besar antara
200-300 m2/g ,
 Efisiensi tinggi karena  plat teoritis dapat mencapai 10.000 dalam
kolom sepanjang 25 cm.

Kromatografi partisi cair = cair  ƒs dan ƒm harus tidak bercampur.

Pelarut lebih polar digunakan sebagai ƒS  sistem dinamakan

Kromatografi Fase Normal. !

Contoh :
Air sebagai ƒs yang melapisi silika gel secara tipis.
Air terads. 50% dari berat silika gel. kadang-kadang dipakai sistem buffer.

Untuk menghasilkan tr yang diharapkan jumlah fraksi terlarut dalam ƒm berkisar 0,05 –
0,5.

Bila ƒs dipakai senyawa non polar, dan ƒm polar

merupakan kebalikan fase normal. “Reverse Phase Chromatography”
!
Untuk ini penyangga padat yang non polar dapat digunakan bubuk karet dengan lapis
tipis benzen sebagai ƒs dan air sebagai ƒm.
 SUSUNAN PERALATAN

Pada HPLC dan GLC tidak jauh berbeda.

Komponen utama :
 Reservoir pelarut untuk fase mobile
Pompa untuk mengalirkan fase gerak / mobile dengan kecepatan
dan tekanan tetap
 Injector untuk memasukkan sampel
Ada 2 macam   On Coloum Injection / Langsung
 Holding Loop Injection / tidak langsung
 Kolom
 Detector :  D. Ultraviolet  D. Fluoresens
 D. Konduktivitas  D. Indeks Refraksi
 D. FID. “Flame Ionitation Detector”.
 Recorder
 Ilustrasi pemisahan kromatografi

Sampel A,B
A
B

detektor

t0 t1 t2 t3 t4
 Rekam sinyal pemisahan campuran

Signal

A B
t

t1

[ ]
A tn
B

B
A

Jarak Migrasi 
 KESEIMBANGAN DISTRIBUSI

Perbedaan migrasi merupakan hasil distribusi keseimbangan dari senyawa A, B, C,

… diantara fasa tetap dan fasa gerak.
Distribusi molekul cuplikan antara dua fasa dinyatakan dalam tetapan keseimbangan
dikenal sebagai koef distribusi atau partisi = K

Cs [A]s
1 K = ------- KD = ------- 1a
Cm [A]m

Cm
K = -------
Cs
Cm = kadar senyawa dalam fasa gerak (mobile)
Cs = kadar senyawa dalam fasa tetap (diam)

K meliputi berbagai macam mekanisme tergantung

sifat fasa-fasa dan interaksi cuplikan dengan setiap fasa.

* pertukaran ion harga K merupakan

Proses : * serapan populasi relatif senyawa
* partisi dalam 2 fasa

Cs
K = -------
Cm

K besar  populasi Cs > Cm  mol cuplikan akan tinggal

lebih lama di fasa statiner

 Migrasi Saat Seimbang 

BM AM BS  BM

AM  AS Kecepatan migrasi
ditentukan  mol dalam
fasa gerak

BS AS

Migrasi suatu senyawa dipengaruhi

Sus Fasa Tetap Suhu kolom

Sus Fasa Gerak

 Sebagai dasar retensi
Keseimbangan dinamik sebenarnya yang ada 
∑ mol dlm fgerak
Fraksi dalam f.gerak (R) = ------------------------
. ∑ mol total
2 C m . Vm
R = -------------------------------
Cm . Vm
Cs Vs
R = ------- -----------------
Cm.Vm 1 + ------.-----
∑ [Cm.Vm + Cs . Vs]
Cm Vm
K
K’ = faktor kapasitas 1
Vs R = ---------------------
3 2a
= K . ------- Vs
Vm 1 + K.------
Vm
 1
R = ------------------- 1
2a Vs R = ------- ---- 4
[ 1 + K’ ]
1 + K . -----
Vm

Ciri khas pemisahan kromatografi

!
openyebaran Mol  menyebabkan perbedaan puncak kromatogram.
oMolekul-molekul membentuk garis sempit  luas puncak awal.
 Proses diffusi pada kolom
A
Lebar
 Perbedaan aliran fs gerak dlm kolom 
Awal molekul cuplikan melewati jalan
1 2
3
4
berbeda, tergantung aliran yang diikuti.

5 6 7

8 9 10

B  Dalam waktu tertentu

- Lorong alir , kecep. alir  
3
1 2 4 Lebar jarak yang ditempuh molekul panjang.
Akhir
5 6 7
- Lorong alir , kecep. alir  
jarak yang ditempuh mol pendek.
8 9 10
  Perpindahan massa ƒm
berhubungan dengan perbedaan
kecepatan alir setiap bagian dari
suatu lorong.
C
 ƒm berdekatan dengan partikel, akan bergerak
lambat / tidak bergerak.
1
2

5
 ƒm ditengah aliran bergerak lebih cepat 
dalam rentang waktu tertentu :
Perpindahan Massa ƒm

~ molekul cuplikan dekat  partikel

menempuh jarak lebih pendek.

~ molekul cuplikan di tengah  aliran

menempuh jarak lebih
panjang.
 D

5 Partikel fasa diam yang berpori ƒm yang

masuk dalam pori tidak bergerak.

Molekul cuplikan bergerak keluar masuk pori

secara difusi
Perpindahan Massa ƒm yang
berhenti

 Setelah molekul berdifusi dalam pori dan

terikat dengan berbagai cara dalam fasa
E tetap / diam 
- Bila molekul cuplikan terikat
Perpindahan Massa
lama dalam ƒs karena difusi
ƒs terlalu dalam  menempuh
jarak ke bawah lebih pendek.
 TEORI KELAJUAN / KECEPATAN
Dikembangkan oleh “Van Deemter” orang Belanda 
Pers Van Deemter
Pers ini berguna untuk me  kan peranan kolom kromatografi  efisiensi kolom.

B A = difusi Eddy / olakan

HETP = A + ----- + C.µ
µ B = difusi molokuler Longitudinal
fasa gerak (fm)
5
B
C = transfer massa
H = A + ----- + C.µ
µ panjg kolom (cm) kecepatan alir
µ = ------------------------- = fasa mobile dlm
t.Penahanan (dtk) kolom

H = A + C.µ Untuk LLC , B sangat kecil ± 105 lebih

kecil dari GLC
 Difussi Longitudinal / kurve VDT

Difusi Longitudinal
9 Kur ve V.DT

B
A  Cμ
6 μ
HETP Transfer
Massa
Hm in

Teori
3
B B Cm
μ C Dif. Eddy

A A
0 60
140 180

cm/dtk

Opt
 Hmin dan Opt diperoleh
dari turunan 1 Pers Van Deemter 

B dH B
H = A + ----- + C.µ ------ = ----- + C.
µ dµ µ2

dH
µopt  ----- = 0
dµ

B
Opt  6
C
 B
B B
Hmin A . C C
B B C
C C B
B B B Hmin = A + 2.C. ---- 7
A .C.  C. C
B C C

8 HETP = HLLC = A + C μ

trA A
tr
Signal
trB B
trC C
tm
W
t
o t
 Ciri Khas Kurve / Peak. Kromatogram

• Setiap senyawa meninggalkan kolom dalam bentuk simetri, sebagai kurve

gaus

• Setiap puncak keluar dalam waktu tertentu, yang dapat dipakai sebagai
identifikasi senyawa
tr = waktu retensi diukur mulai waktu injeksi cuplikan  waktu puncak
maksimum meninggalkan kolom

• Perbedaan waktu retensi berdekatan.

• Semakin besar ∆tr dari campuran semakin mudah dipisahkan

 Konsep Teori Lempeng / Plat

Teori lempeng plat, perlu untuk menerangkan proses terjadinya suatu

pemisahan secara kromatografi.

Karena proses yang terjadi pada kromatografi analog dengan proses

ekstraksi bertingkat yang dilakukan oleh Craig.

Dimana fasa diam dalam kromatografi dianggap terdiri dari sejumlah

ruang yang mempunyai ukuran sama dan tiap ruang mengandung
sejumlah fasa mobil dan fasa diam.
 Dengan teori ekspansi binomial, distribusi sampel dalam ruang dinyatakan dalam
rumus.

K.Vs Vm n

p+q n = --------------- + ---------------

K.Vs + Vm K.Vs + Vm

Distribusi sampel dalam ruang tersebut merupakan fungsi dari koefisien distribusi
(K). Perbandingan volume pelarut yang digunakan (Vs / Vm) dan jumlah
pemindahan atau transfer (n).

Teori plat dapat menggambarkan kecepatan migrasi secara kuantitatif tetapi tidak
dapat menerangkan bagaimana terjadinya pelebaran pik. Sehingga teori tersebut
dilengkapi dengan teori kinetik / teori kecepatan.
 Fraksi waktu tinggal dalam fasa mobil (bergerak),
sebagai dasar RETENSI  dinyatakan dengan persamaan

Vs
Cm . Vm
K’ = K . ------- 3
R = ------- ----------------- 2 Vm
∑ [Cm.Vm + Cs . Vs]

1
R = ------- ---- 4
[ 1 + K’]

Fraksi waktu tinggal dalam fasa mobil sama dengan jumlah molekul dalam fasa
mobil dibagi dengan jumlah total molekul dalam sampel.
 WAKTU RETENSI / waktu tinggal

Apabila kecepatan alir fm (μ, cm/dtk) diatur tetap, t tetap, perbandingan fasa diam
dan fasa mobil tetap,

 setiap komponen dalam suatu sampel akan mempunyai waktu tinggal yang
tetap, yaitu waktu yang diperlukan oleh suatu komponen untuk melintasi suatu
fasa diam dengan panjang L.(cm)

 waktu retensi (tr)

Bila kecepatan rata-rata cuplikan x = μx, maka μx akan tergantung dari μ dan R
(fraksi mol x dalam fm)
 µx = µ.R 1
8
R = ----------
1 + K’
µ 1
µx = --------- = µ . ----------------- 9
1 + K’ 1 + K. Vs / Vm

Hubungan u dengan tm dan panjang lintasan L(cm) 

tm = waktu yang diperlukan oleh fasa mobil itu sendiri (tanpa sampel) untuk keluar
dari fasa diam

L L
10 tm = ----- 11
tr = ---- ( 1 + K’ )
µ µ
tr – tm tr’
K’= --------- = --------
tr = tm ( 1 + K’ ) 12 13 tm tm
Retensi kadang-kadang diukur dengan satuan Volume
Vr = Vol total ƒm yang diperlukan untuk mengelusi puncak senyawa x.

Vr = tr x kcpt alir ƒm melalui kolom (a = ml/dtk)  Vr = tr.a

Vol total ƒm dalam kolom Vm = tm.a

Vr lebih disenangi dari tr karena tr berubah dengan berubahnya kecep alir (a, μ), sedang
Vr tidak tergantung pada (a, μ).

tr
14 Vr = Vm. (1 + K’) 15
Vr = Vm. ------
tm
 FAKTOR SELEKTIFITAS = 

Pemisahan 2 zat terlarut A, B  kromatografi 

perlu diketahui faktor selektivitas A, B

KB
α = -------
16
KA KB, KA adalah Koef Partisi A dan B

K’B
α = -------
17 K’ = Faktor Kapasitas
K’A

trB – tm t’rB
Dalam eksperimen  α = ----------- = -------- 18
trA – tm t’rA

t’r  t terkoreksi
 RESOLUSI KOLOM = Rs

A B
Rs = 0,75
0

A B
 Rs = 1,0
Detektor
Signal 0
tRB
tRA
∆Z
A B Rs = 1,5

tm W½ W½
0
WA WB
t

METODA LUAS PEAK ∆

 Resolusi = perub nyata antara dua spesies B, A
dalam kolom
Dari grafik resolusi terbaca 3 bentuk resolving power yang tidak sama.

Rs = 1,5 Memisahkan A dan B secara komplit, meskipun

masih ada over lap 0,3%. ~ Resolusi Base Line

Rs = 1,0 Daerah peak B masih mengandung A 4% - 2,5%

dan sebaliknya

Rs = 0,75 A dan B belum sama sekali terpisahkan

∆ tr 2 ∆ tr
RS = ------------------------ = --------------- 18
WA . ½ + W B . ½ W A + WB .

2 [trB - trA ]
RS = --------------- 19 ∆ tr harus positif
WA + WB
Untuk pemisahan yang baik R ≥ 1,5
Diharapkan pemisahan ≥ 99,7%

Pemisahan spesies dalam kromatografi erat hubungannya dengan faktor-faktor :

1. Efisiensi kolom
2. Efisiensi pelarut

Efisiensi kolom diukur sbg jumlah plat teoritis = N.

Ketinggian ekivalen terhadap plat teoritis = HETP = H

L = panjang kolom
L
HETP = H = ------- 20
N L
N = ------- 21
H N.H = L 22
 L2
2
N = ------ 24
dari pers. Gauss 
H = ------ 23 2
L

 stand deviasi pengamatan  Pers. Gauss

 = standard deviasi Peak Kromatografi

L    tr
µ = ------ 25  = ------ 26  = -------- = ----------- 27
tr L / tr L
µ

Daerah kurve Gauss maks, termasuk diperhitungkan ± 2 standard deviasi ± 2 

Shg dalam perhitungan intersep kurve maks diperhitungkan pula kira-kira ± 2 .
W = Lebar puncak yang diukur pada perpotongan tangen dan garis dasar
  tr  tr W L.W
W = 4. 
 = -------  = ------ = ------ = -------
L L 4 4. tr

L.W2 tr 2
H = --------- 28 N =16.---- 29
42. tr2 W

Catatan : tR, W diukur dengan satuan yang sama.

Cara lain untuk menghitung / memperkirakan N  dengan membandingkan terhadap
W ½ = Lebar ½ H.

H
tr 2

W ½ N =5,54. -------
30
W1/2

W
dasar ∆
 Hubungan Antara Rs dan Kolom
Hubungan matematis antara RS, kB, kA,  dan N.
Dengan asumsi WA ≈ WB ≈ W

2 [trB - trA ] 2 [trB - trA ] [trB - trA ] ∆tr

RS = ---------------- = ---------------- = -------------- RS = ------
WA + WB 2 W W W

tr 2 trB - trA ] √ N
N = 16 .----- RS = -------------. ------
29
W trB 4

K’B - K’A √N
RS = ----------------. ------
1+ K’B 4
 K’B - K’A √N Eliminasi KA’,
RS = ----------------. ------ substitusi α
1+ K’B 4

K’B
K’B √N [α -1]
α = -------
RS = -----------. ------ . ----------
K’A
1+ K’B 4 α

1 + K’B 2
α 2

N = 16. RS 2
---------- . --------
K’B [α – 1 ]

K B = KA K’B = K’A = K’ α =1

K’ √N
RS = --------. -------. [ α - 1 ]
1+ K’ 4
 2 [trB - trA ] 2 [trB - trA ] [trB - trA ]
Bila diasumsikan
W A = WB = W RS = ---------------- = --------------- = --------------
WA + W B 2.W W

1 + K’ 2
α 2

N = 16. RS2 . ---------- --------

K’ [α – 1 ]

L 1 L
µB = ----- µB = µ ----- N = -----
H
trB 1 + K’

NH.(1 + K’B) 16Rs2.H. α 2 1 + K’B 3

trB = ------------------- trB = ------------- . -------- ----------
µ µ α-1 (K’B)2
 1/1 1/4 1/16

Rs = 0,6

Rs = 0,8

Rs = 1,25

Rs = 1,0

Gambar Pemisahan Sebagai Fungsi RS dan Kadar Relatif

Dari penjabaran rumus, diketahui bahwa untuk mengatur resolusi 
K’ dan N berpengaruh, sedang α untuk mengatur Rs dengan merubah
α dan N ,K’ K2 KB
α = ----- = -----
K1 KA
 awal

k’
diubah

Plat N
Teori 


Faktor

Selektivitas

t

Perubahan K’, N,  terhadap Resolusi

 1 K’
Dari rumus RS = ---- (α – 1) .√ N . ---------
4 1 + K’
-------- ------ ---------
i ii iii
α N K’

Dari pers. RS terhadap , N, k’, ternyata faktor (i), (ii), dan (iii) tdk saling
bergantung, 
dapat dioptimalkan dulu faktor (i) baru (ii) dan (iii).

(i).Selektivitas pemisahan ditunjukkan faktor  yang berubah dengan

mengatur susunan ƒm dan ƒs

 Me    pergeseran satu puncak relatif terhadap lainnya.

 Waktu pemisahan dan tinggi dua puncak tidak begitu berubah
untuk perub  yang wajar.
(ii). Efisiensi pemisahan ditunjukkan faktor (ii) = N,

dengan mengubah L dan μ,  N suatu kolom di naikkan ,  menghasilkan

penyempitan dua puncak dan menaikkan tinggi puncak.

Waktu pemisahan tidak langsung dipengaruhi.

(iii). Faktor (iii), K’ berubah dengan mengubah kekuatan fasa gerak.

Perubahan K’ dapat berpengaruh besar pada pemisahan.

K’   perubahan jelek, tr pendek.

K’   terjadi kenaikan nyata resolusi, meskipun tinggi
puncak turun cepat dan waktu pemisahan naik.
 Pengaruh ∑ Cuplikan
a. Cuplikan sedikit,  tinggi puncak naik dg
bertambahnya cuplikan
 tr tidak dipengaruhi
a  RS tetap


b. Jumlah Cuplikan Kritis, - waktu retensi
b menurun

c c. d. Pe (+) cuplikan berlanjut,

 Terjadi penurunan nyata pada
*) pemisahan dan *) tr.
d
Untuk pemisahan analitik, lebih baik bekerja pada
daerah dimana k’ tetap, yaitu ∑ cuplikan harus
 Vol. Eluat
kurang dari kapasitas linear kolom.
 PUNCAK BEREKOR

Pada sistem Kromatografi yang baik, setiap puncak merupakan kurve GAUSS
SIMETRI.

Puncak berekor kadang-kadang muncul dalam kromatogram,

dengan 4 bentuk kemungkinan :

• Terjadi karena ketidak cocokan antara cuplikan

dengan ƒm atau ƒs
Ditandai dengan lambat kembali ekor puncak
pada garis dasar
A
• Pemisahan terhadap puncak berikutnya jadi jelek

Berekor Kimia • Jika terjadi puncak berekor tipe ini, perlu dicoba
ƒm, ƒs yang lain atau dicoba metoda lain
  Akibat dari puncak pelarut cuplikan

 Penggunaan cuplikan sesedikit mungkin

B
 atau menaikkan RS
Berekor Pelarut

 Terjadi karena kolom kurang efisien, efisiensi kolom

rendah ( )
C  Jarang terjadi pada kromatografi cairan

Poisson

 Puncak sedikit kurang simetri

D
 biasa terjadi pada semua kromatografi
Eksponansial Normal
 KROMATOGRAFI PLANAR

Dua tipe Kromatografi Planar

Thin Layer Chrom Paper Chrom

TLC/KLT Kromatografi kertas

Thin Layer Chromatography ≈ TLC ≈ KLT.

Teknik ini dikembangkan oleh “EGON STAHL” dengan menghamparkan
penyerap pada lempeng gelas sehingga merupakan lapisan tipis.
 Kromatografi Serapan

Kromatografi Partisi,
KLT / TLC krn fs padat telah dilapisi H2O dari udara

KLT cepat populair karena memberikan banyak keuntungan :

•Peralatan sederhana
•Murah
•Waktu Analisis cepat
•Daya pisah cukup

•Sebagian besar teori kolom dapat diterapkan pada KLT.

• Pemisahan dilakukan oleh keseimbangan berturutan
cuplikan terhadap dua fasa, satu diantaranya bergerak
terhadap yang lain.
 Derajat retensi pada KLT dinyatakan sebagai :
dR jarak yang ditempuh senyawa terlarut
----- = Rf = --------------------------------------------------------
dM jarak yang ditempuh pelarut
Jarak yang telah ditempuh pelarut dapat diukur dengan mudah dan jarak tempuh
cuplikan diukur pada pusat kerapatan maksimum.
Cs
KD = ------ , tetap berlaku , hubungan KD dengan Rf
Cm
∑ mol senyawa terlarut dlm fm Cm. Am
Rf = ----------------------------------------------------------------------- Rf = -------------------
∑ mol total senyawa terlarut dlm dua fasa (fm & fs)
Cm Am + Cs. As
Am Am
Rf = -------------------- = --------------- Am , As luas penampang melintang
dua fasa tegak lurus lempeng
Cs. As Am + K.As
Am + -------
 Luas penampang melintang sukar diukur  persamaan di atas kurang praktis, Rƒ
merupakan bentuk modifikasi dari tetapan keseimbangan.

Rƒ terbentuk dari macam adsorben, ketebalan, metoda arah pengembangan, kadar

dan jumlah cuplikan, serta jarak yang ditempuh / noda.

Dengan melihat ketergantungan harga Rƒ

akan lebih mudah dan tepat menggunakan harga Rƒ relataif atau
R standard.

Dimana suatu senyawa standard di (+) ke cuplikan. Harga Rstd adalah angka banding
jarak tempuh dua bercak tersebut dalam waktu pengembangan yang sama.
 dM

dg Batas akhir pelarut

2
W

1
WA WB

Batas awal

Ditektor
  Gambar rekaman kromatografi dengan
A B densitometri scan
Sinyal

 Jarak migrasi
 FAKTOR KAPASITAS

Persamaan-persamaan yang telah dijabarkan dapat diadaptasi pada TLC.

* tr, * tM  waktu yang dibutuhkan senyawa bergerak dalam fs ,
* dr  jarak yang ditempuh fm maupun solute.
Bila μ kecepatan linier
Rs = Resolusi
dm dr
tm = ---- tr = ---- 2. ∆Z 2[(dr)A - (dr)B]
µ µ Rs = ------------- = ----------------------

WA + WB WA + W B
dr
N a-1 K’
1 - ----- Rs = √ ----- -------- ---------
dm - dr dm 1 - Rf
4 α 1 + K’
K’ = ------- = ----------- = -----------
dr dr Rf K’B dm – drB drA
------ α = ----- = ------------- x --------
dm K’A dm – drA drB
Semua prosedur kromatografi, kondisi optimum untuk suatu pemisahan
merupakan kecocokan antara fs dan fm.
KLT / TLC fasa tetap berupa lapis tipis, pada umumnya digunakan silika gel.
Untuk penggunaan dalam suatu tipe pemisahan perbedaan fasa tetap terletak pada
:
* Struktur * Pori-pori * Struktur lubang

Silika gel perdagangan :

 Ukuran 10 - 40μ  berpengaruh pada μ dan pemisahan
 Ukuran pori  20 – 1500A 80 – 150 = pori besar
 Luas permukaan 300 – 1000m2/g
 Kelembaban relatif 45 – 75% mengikat air 7 – 20%
 Sangat higroskopis
 Deaktivasi ditentukan kelembaban relatif kamar dan lempeng silika gel
disimpan  perlu diperhatikan
 Macam-macam gel di perdagangan :

1. Silika gel dengan pengikat = silika gel G

Sebagai pengikat - CaSO4 [5-15%]
- PATI  silika gel S

2. Silika gel dengan pengikat dan indikator flourisense

 Silika gel GF atau GF 24
Berflourisens kehijauan jika dilihat dengan sinar UV  pendek.
Indikator yang digunakan timah kadmium sulfida atau mangan- timah
silikat aktif.

3. Silika gel tanpa pengikat

Silika gel H atau silika gel N.
Lebih stabil dibanding bentuk 1.
4. Silika gel tanpa pengikat dengan indikator flourisense.

5. Silika gel untuk pemisahan preparatif. Silika gel PF254 + 366

6. Alumina dengan pH 9, 7, 4 , dengan pengikat CuSO4

7. Selulosa, sebagai fasa diam KLT  diperoleh mekanisme sama pada

krom. Kertas

Selulosa untuk KLT ada 2 bentuk : - serat asli

- Monokristal

Pemilihan fasa gerak pada KLT dengan silika gel / alumina sebagai fs,
mengikuti aturan kromatografi serapan.
 PELARUT SEMI MIKROSTOP

kenaikan sifat Hidrofob

 Kloroform biasanya distabilkan dengan Etanol

) Air n. Anil Alkohol
Formanida Etil Asetat
Metanol Eter
Asam Asetat n. Butil Asetat
Etanol Kloroform
Isopropanol )) Benzena

Aseton Siklo Heksan

n. Propanol Eter Petroleum
Tert-butanol Petroleum
Fenol m. Parafin
n. Butanol
) Untuk pemisahan senyawa Hidrofil

)) Untuk pemisahan senyawa Lipofil

 METODOLOGI
1. Pembuata Lempeng Lapis Tipis
Ukuran lempeng gelas yang biasa digunakan :
20 x 20, 20 x 10, 20 x 5 cm

 Pencucian : - Air (+) deterjen

- Keringkan
- Aseton – keringkan

 Pelapisan : - 30 g bahan pelapis dibuat bubur

dengan air atau pelarut lain
- Pindahkan dengan segera dalam alat perata.
- Ratakan bubur pada lempeng dengan
ketebalan 0,25mm
Untuk pemisahan preparatif tebal lapisan 0,5 – 2,0 mm.
Pindahkan lempeng pada rak dengan hati-hati, diamkan ± 30 menit

Keringkan pada t 100 – 1200C ± 1 jam

 Simpan dalam Desikator
Perbandingan bahan dan pelarut untuk lempeng
Jenis bahan Berat bahan Jumlah air
( gram ) ( mL )
Silika gel 1 1,5
Silka gel G /GF 1 2
Alumina 1 1
Alumina Oksida G 1 2
Selulosa MN 300 1 5
Selulosa MN 300 G 1 6
Poliamida 1 9
Kloroforma-Metanol 2 3
 PENOTOLAN CUPLIKAN

 Lempeng lapis tipis konvensional (20 x 20, 20 x 10, 20 x 5) dengan tebal

0,2 mm.
Cuplikan ditotolkan sbg bercak bulat dg diameter 3 – 6 mm ,
atau berupa garis; 1,5 – 2 cm dari tepi bawah.

Tepi atas

 3 – 6 mm
Tepi bawah 1,5 – 2 cm
Lempeng
KLT
lempeng noda Berupa garis
 • Penotolan dg mikro pipet atau microsyringe diperlukan 1 – 20 μL.
• Kelebihan bahan totolan menyebabkan bercak asimetri dan perubahan harga
Rƒ.
• HETP pada KLT biasanya 10 x 10, 10 x 20 cm. diperlukan cuplikan dalam
nano  pikogram setiap bercak. Diameter bercak harus tidak lebih 1,0 – 1,5
mm dan vol cuplikan ± 0,2 μL.

PENGEMBANGAN KROMATOGRAM

Teknik naik linier (ascending)

Teknik turun atau horisontal (descending)

Kromatogram biasanya dikembangkan dlm bejana pengembang gelas atau logam

yg tertutup dan jenuh dengan uap pelarut.
 Teknik Perbaikan Pemisahan

• Pengembangan Berkelanjutan
ƒ gerak dialirkan pada bagian atas lempeng pengembang. Teknik ini digunakan
untuk senyawa dengan Rƒ 0,05 – 0,2 setelah pengembangan pertama.

• Pengembangan Dua Dimensi

Cuplikan ditotolkan di salah satu pojok kemudian dikembangkan seperti biasa.

Kemudian diputar 900 sehingga pita pemisahan I terletak pada bagian bawah
lempeng .
dilakukan pengembangan II sehingga terjadi pemisahan berbeda pada arah kedua.

Teknik ini berguna untuk cuplikan yang mengandung banyak penyusun atau
untuk mengetahui kemurnian.
• Pengembangan Serkuler
Fasa gerak dialirkan dengan sumbu atau pompa melalui pipa kapiler ditengah
lapisan / tetap.
Senyawa terlarut bergerak dari tengah penotolan menghasilkan lingkaran-
lingkaran sempit.

• Pengembangan Beberapa Kali

Fasa gerak biasanya mudah menguap, diuapkan setelah terjadi pengembangan.
Lempeng dikembangkan lagi dengan ƒm yang sama atau berbeda.
 METODA IDENTIFIKASI

Untuk melihat senyawa tidak berwarna pada lempeng pengembang, biasanya dilakukan
metoda sebagai berikut :

1. Dengan UV (254 – 366 mm)

a. Pada lapisan berfluorisensi (S GF254) bercak muncul
sebagai bercak hitam.
b. Senyawa berfluorisensi, pada lapisan biasa
bercak akan terlihat berfluorisensi.
2. Disemprot pereaksi yang menghasilkan warna / berfluorisensi.
Digunakan untuk deteksi asam sulfat, (H2SO4 p, 50% H2SO4,
50% H2SO4 dalam Metanol).

Reaksi ini terbentuk dalam keadaan dingin atau dengan pemanasan

100 -1200C
- tidak dapat digunakan pada ft organik atau bahan pendukung “pati”
- Pereaksi lain yang banyak digunakan uap iodium
 Uap pelarut
Chamber pengembang
pelarut

cuplikan

A B

Permukaan
Pelarut

C D
Pelarut 2
 Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam KLT yang juga

berpengaruh terhadap Rƒ

1. Struktur kimia senyawa yang dipisahkan.

2. Sifat adsorben dan derajat aktivitasnya.

Aktivitas di  kan dg memanaskan dalam oven.

3. Tebal dan kerataan lapisan penyerap / adsorben

4. Pelarut & [o kemurnian] f gerak.

- Kemurnian pelarut sangat penting
- Perbandingan campr pelarut perlu perhatian

5. Derajat kejenuhan uap dlm bejana pengembang

6. ∑ cuplikan yang digunakan
Tetesan cuplikan    Tendensi penyebaran noda
Kesalahan harga Rƒ   Terbentuknya ekor
 Efek kesetimbangan lain

7. Suhu, pemisahan sebaiknya pada suhu tetap

Hal ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi
pelarut karena penguapan, perubahan fasa.

8. Kesetimbangan
Kesetimbangan dalam KLT lebih penting dalam krom. kertas  perlu
diupayakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut.

Gejala atm. bejana ≠ jenuh  pengembangan dengan permukaan pelarut

cekung, fasa gerak bergerak lebih berat di bagian tepi  .. harus
dihindarkan.
 KROMATOGRAFI KERTAS
 Prinsip sama KLT, fasa tetap digunakan kertas bukan lempengan.
Pelarut bergerak melalui serat-serat kertas oleh gaya kapiler, dan menggerakkan
komponen cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut.

d pelarut

C
drC
B
drB
A
drA

Awal
 jarak perpindahan noda komponen
Rf = -----------------------------------------------------
jarak gerak permukaan pelarut
drA
Rf = -----
drm

Karakteristik Kertas Kromatografi whatmann

Jenis sifat
kertas cepat sedang lambat
tipis No. 4 7 2
54 1 20
540 - -
tebal 31 3 -
17 3 -
 Pelarut untuk kromatografi kertas
Pemisahan zat Jenis pelarut Jumlah perbandingan

Asam amino Fenol - air larutan jenuh

n.butanol-cuka-air 4 : 1 : 5
n,butanol-cuka-air 12 : 3 : 5
n.butanol- piridin-air 1 ; 1 :1

F , Cl, Br , I piridin - air 90 - 10

(sbg garam Na)

Hg, Pb, Cu, Cd, Bi n.butanol – 3 M HCl larutan jenuh

(sbg garam Clorida)
 BEBERAPA FAKTOR PENENTU Rƒ

1 Pelarut  pentingnya koefisien partisi

2. Suhu  perubahan suhu merubah koefisien partisi dan kecepatan

alir

3. Ukuran bejana  vol. bejana mempengaruhi homogenitas

atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan
penguapan komponen pelarut.

4. Kertas  sesuai jenis berpengaruh terhadap keseimbangan partisi.

5. Sifat campuran.
 APLIKASI DATA ANALISIS
1. Substan A dan B mempunyai waktu retensi
trA = 16,40 trB = 17,63 menit pd kolom 30 cm
Lebar dasar puncak kromatogram : senyawa A = 1,11 mnt & senyawa
B = 1,21 mnt

Pembahasan diskusi data :

a. Bagaimana RS resolusi kolom
b. Prediksi kan :
*) plat rata-rata  N = ∑ rata-rata plate dalam kolom
*) H = tinggi plate orisinil
c. Untuk menghasilkan RS = 1,5,apa yang harus anda lakukan terhadap panjang
kolom
d. Untuk mengelusi B dari kolom (c) Berapa waktu yang dibutuhkan
e. Untuk RS = 1,5 pada kolom orisinil 30 cm dan waktu orisinil
Berapa prediksi kebutuhan tinggi plate .
 Penyelesaian :
tRB - tRA (17,63 – 16,40)
a) Menggunakan rumus Rs = 2.-------------
WA + W B Rs = 2.--------------------- = 1,06
1,11 + 1,21
tr 2
16,40 2

b) NA = 16 x .------ = 16 x --------- = 3,493

W 1,11
tr 2
17,63 2

NB = 16 x .------ = 16 x --------- = 3,397

3,493 W + 3,397 1,21
NAB = .--------------------- = 3,3445
2

L 30
c).HETP = H = ------ = ----------- = 8,7 cm
d.) K’ dan  tidak berubah dengan kenaikan N ataupun L 
substitusikan N1 dan N2 pada persamaan :

√N K’
Rs = ----- ( α – 1 ) ----------
4 (1 + K’)

Rs.1 √ N1 Rs.1 √ 3,493

------- = --------  ------- = ------------ = ± 1,06  Rs
Rs.2 √ N2 Rs.2 √ 3,397
Rs = 1,06 √ N = 3,345 Rs harapan = 1,5

Rs 1,06 √ 3,445 1,5 2

---- = ------ = ----------  N = 3,445 ------- = 6,9
Rsh 1,5 √N 1,06

L = NH = 6,9 x 8,7 = 60 cm
Dengan rumus :

tr1 [Rs1]2 [ 17,63 ] 2

e) . ----- = --------- = ------------  tr2 = 35 menit
tr2 [Rs2]2 [ 1,5 ] 2
Elusi senyawa B dalam kolom awal dengan Rs = 1,5 membutuhkan
waktu 35 menit.

Dari pers (e), H1 dan H2 disubstitusikan 

tr1 [Rs1]2 H1 [ 1,06 ] 2 H1 1,06 2

f) . ----- = --------- . -------  ------------- = -------  H2 = ------- x 8,7
tr2 [Rs2]2 H2 [ 1,5 ] 2 H2 1,5

= 4,3 cm.
H1  H orisinil
H2  H baru untuk mencapai Rs = 1,5 , dengan L
dan tr kondisi orisinil
2. KLT dipakai untuk memisahkan campuran :
3 carbamate insektisida

1) Carbofuran , 2) Carbaryl , 3) Metalkamate

Sampel 5 μL larutan mengandung 1 mg/mL setiap komponen dalam

CHCl3

Fasa gerak , toluen : isoprophyl ether dengan perbandingan 70% /

30%.

KLT yang digunakan berukuran 20 x 20 cm

 Cuplikan ditotolkan sebelah kanan KLT

 Standard dari 3 komponen sebelah kiri KLT
Dari pengamatan dengan ukuran cm diperoleh data :
dm = 9,8

dr)1 = 1,7 W1 = 0,57

dr)2 = 2,5 W2 = 0,54

dr)3 = 3,9 W3 = 0,75

Prediksikan :

a). Rf untuk ketiga Carbamat

b) Jumlah plat utk setiap spot noda

c) jumlah plat rerata pada KLT

Diskusikan dengan Klp anda…

 Pada KLT, jarak noda hasil elusi dg fm , dicirikan dengan besaran Rf
dr1 1,7 dr2 2,5
Rf1 = ---- = ------ = 0,1735 Rf2 = ---- = ------ = 0,2551
dr
dm 9,8 dm 9,8
Rf = ----
dr1 3,9
dm
Rf3 = ---- = ------ = 0,3980
dm 9,8
Pada KLT, lapis tipis sbg fasa stationer dapat digambar kan sebagai susunan
beberapa plat yang dicirikan dengan besaran N,
tr1 2 1,7 2
tr 2 N1 = 16 .----- = 16.------ = 142,3
W 0,57
N = 16 ---- tr2 2 2,5 2 ∑ N1,2,3
W N2 = 16 .----- = 16.------ = 342,94 N = ------------ = 305,96
W 0,54 3
tr3 2 3,9 2
N3 = 16 .----- = 16.------ = 432,64
W 0,75