Bismillah Kromato

KROMATOGRAFI
1
Sejarah kromatografi
2
Sejarah Kromatografi
1. Siapakah penemu kromatografi ?
2. Siapakah dia?
3. Kapan awal mula kromatografi ditemukan ?
4. Dalam bahasa Yunani apakah arti kata kromatografi ?
5. Dari mana asal nama kromatografi yang ditulis di publikasi
penemu kromatografi ?
6. Dalam bentuk apakah kromatografi yang pertama ditemukan?
7. Adsorben apakah yang digunakan pada penemuan awal
kromatografi?
8. Uraikan definisi kromatografi menggunakan bahasa Anda sendiri!
3
 Mikhail Semenovich Tsvett
 Memisahkan zat warna
tanaman (pigmen tanaman)
 Melewatkan/meneteskan
campuran melalui tabung
gelas yang berisi serbuk
Calcium Carbonate
 Pigmen / zat warna tetap
tinggal / tertahan pada
serbuk
 Derajat kekuatan yang
berbeda  Pita-pita zat
warna
4
Sejarah kromatografi
• Chromatography
(from Greek :chromatos -- color , "graphein" -- to
write)
• 1903 Tswett - plant pigments separated on chalk
columns
• 1931 Lederer & Kuhn - LC of carotenoids
• 1938 TLC and ion exchange
• 1950 Reverse phase LC
• 1954 Martin & Synge (Nobel Prize)
• 1959 Gel permeation
• 1965 instrumental LC (Waters)
5
Gambar Kromatografi yang
dipublikasikan oleh M.S. Tswet
6
Dasar Pemisahan Teknik Pemisahan
1. Penyaringan
2. Penukar Ion
3. Masking
4. Ekstraksi
5. Pengendapan
6. Destilasi
7. Sentrifugasi
8. Kromatografi
9. Dialisis
10. Sublimasi
11. Elektrodeposisi
12. Rekristalisasi
13. Kromatografi size-exclusion
14. Volatilisasi
7
Tujuan kromatografi
8
Tujuan Kromatografi
• Analitik- menentukan komposisi zat kimia
suatu sampel
• Preparatif – memurnikan dan mengumpulkan

/ isolasi satu atau lebih komponen dari suatu
sampel
9
Teori dasar kromatografi
10
KROMATOGRAFI <931>
• Teknik pemisahan kromatografi adalah
metode pemisahan multi tahap dimana
komponen suatu sampel didistribusikan
antara dua fase, yaitu fase diam dan fase
gerak.
FI V, 2014, hal 1531

11
Kromatografi
• Kromatografi didefinisikan sebagai
prosedur pemisahan zat terlarut oleh
suatu proses migrasi diferensial dinamis
dalam sistem yang terdiri dari dua fase
atau lebih, salah satu diantaranya
bergerak secara berkesinambungan
dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-
zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas
disebabkan adanya perbedaan dalam
adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap,
ukuran molekul atau kerapatan muatan
ion.
12
• Kromatografi  proses pemisahan yang
melibatkan interaksi antara satu atau lebih
solut dan dua fase.
• Kedua fase tersebut adalah fase diam dan
fase gerak
• Fase gerak : zat cair atau gas yang mengalir
/merambat melewati fase diam
• Fase diam : suatu zat padat atau zat cair
yang tidak bergerak
13
• Pada kromatografi, komponen-komponen dalam
campuran akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase
diam dan fase gerak.
• Fase diam akan menahan komponen campuran
sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen
campuran.
• Fase gerak membawa komponen (zat terlarut) melalui
media (fase diam), hingga terpisah dari komponen (zat
terlarut) lainnya.
• Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan
tertinggal, sedangkan komponen yang mudah larut dalam
fase gerak akan bergerak lebih cepat.
14
15
PRINSIP
“Like Attracts Like – Opposites are Not Attracted”
• Polars attracted to other polars (likes attract)
• Non-polars attracted to other non-polars (likes attract)
• Non-polars have no attraction to polars (opposites repel)
Chemicals are like People

(Friends and Enemies)
16
• Komponen yang memiliki
interaksi yang lebih kuat dengan
pendukung fase diam,akan
cenderung bergerak lebih lambat
melewati pendukung fase diam,
dibandingkan komponen yang
interaksinya lebih lemah dengan
fase diam.
• Dengan jalan ini, komponen-
komponen yang berbeda tipe
akan dapat dipisahkan satu
dengan yang lainnya sesuai
dengan pergerakannya melewati
material pendukung fase diam.
17
• Pemisahan kromatografi dapat dilakukan
dengan menggunakan beberapa pendukung
fase diam, misalnya :
1. silica yang dilapiskan pada plat gelas (thin
layer chromatography/TLC (Kromatografi
Lapis Tipis /KLT),
2. volatile gases (gas chromatography),
3. kertas (paper chromatography), dan
4. cairan yang dapat bergabung dengan molekul
hidrofilik, molekul yang tak larut (liquid
chromatography).
18
• Teknik kromatografi membutuhkan zat
terlarut terdistribusi diantara dua fase, satu
diantaranya diam (fase diam), yang lainnya
bergerak (fase gerak)
19
• Zat terlarut dibawa melewati media pemisah
oleh aliran suatu pelarut berbentuk cairan
atau gas yang disebut ELUEN
• Prosesnya disebut ELUSI
20
Mobile Phase / Fase Gerak / Eluen
• Gas (Gas Chromatography / GC)

• Water / air (Liquid Chromatography / LC)
• Pelarut Organik (Liquid Chromatography / LC)
• Supercritical fluid (Super Critical Fluid
Chromatography / SCFC)
21
Tipe/Jenis kromatografi
22
23
Klasifikasi Tipe Kromatografi
Dapat dilakukan dengan berdasar pada :
a. Keadaan fisik fase gerak dan fase diam
b. Metode kontak antara fase gerak dan fase
diam
c. Mekanisme fisika atau kimia yang
bertanggung jawab terhadap pemisahan
senyawa
24
The Classification of Chromatography
A. Berdasarkan Keadaan fisik fase gerak dan fase diam
25
A. Keadaan fisik fase gerak dan fase diam
• Liquid Solid Chromatography

• Liquid Liquid
Cair/Liquid Chromatography
• Gas Solid Chromatography

Gas • Gas Liquid Chromatography
26
Tipe Kromatografi
• Klasifikasi Berdasar Fase Gerak:
– Gas - Gas chromatography (GC)
• 1951 Martin and James (fatty acids)
– Liquid - Liquid chromatography (LC)
• 1964 Horvath (Yale) instrument
• 1966 Horvath and Lipsky (nucleic acid components)
– Supercritical fluid - Supercritical fluid
chromatography (SFC)
• 1958 Lovelock (Yale)
27
B. Metode kontak antara fase gerak dan fase
diam
1. Kromatografi Planar
2. Kromatografi Kolom
28
Liquid chromatography (LC)
Liquid chromatography (LC)
Column High performance Thin layer,

(gravity flow) (pressure flow) Paper
(adsorption)
29
Gas Chromatography
Gas Chromatography
Pyrolysis GC -
sampel padat dipanaskan
sampai 500 - 10000C
Gas - solid Gas - liquid sehingga akan berubah
menjadi gas
Fase Diam
Sampel HARUS bersifat volatil pada temperatur DI BAWAH 3500C

30
Jenis Kromatografi
Berdasarkan Jenis Fase Geraknya :

a. Kromatografi Cair
b. Kromatografi Gas
Berdasarkan Jenis Fase Diamnya :
a. Kromatografi Solid / Padat
b. Kromatografi Cair
Berdasarkan Bentuknya:
a. Kromatografi Planar
b. Kromatografi Kolom
31
Jenis-jenis kromatografi yang digunakan dalam
prosedur analisis kualitatif dan kuantitatif dalam
Farmakope :
• Kromatografi kolom
• Kromatografi gas
• Kromatografi kertas
• Kromatografi lapis tipis (termasuk
kromatografi lapis tipis kinerja tinggil KLTKT),
• Kromatografi cairan yang diberi tekanan atau
yang biasa dikenal dengan kromatografi cair
kinerja tinggi (KCKT).
32
Tipe kromatografi
33
34
Klasifikasi sistem kromatografi
35
Teknik Kromatografi
36
Tipe Kromatografi berdasar arah
solvent
• Radial chromatography
• Ascending chromatography
• Descending chromatography
37
Radial Chromatography
• Pada tipe kromatografi ini, misalnya pada
pemisahan zat warna, warna-warna yang
berbeda bergerak keluar
38
Kertas bentuk
lingkaran
Sampel
Arah solvent
sumbu
39
Radial Chromatogram
40
Ascending Chromatography
• Solvent bergerak naik
pada media pemisahan
41
Descending Chromatography
• Solvent bergerak turun
pada media pemisahan
42
Arah
Solvent
Arah
Solvent
TIPE KROMATOGRAFI
1
Dapat dilakukan dengan berdasar pada :
a. Keadaan fisik fase gerak dan fase diam
b. Metode kontak antara fase gerak dan fase
diam
c. Mekanisme fisika atau kimia yang
bertanggung jawab terhadap pemisahan
senyawa
2
Tipe Kromatografi Berdasarkan Mekanisme
Pemisahan
3
1. Kromatografi Adsorpsi
(Adsorption Chromatography)
Adsorption chromatography (kromatografi adsorpsi )
adalah tipe kromatografi yang paling tua. Seperti
yang dikerjakan Tswett.
Di sini digunakan fase gerak cairan atau gas yang
akan dapat diadsorpsi pada permukaan fase diam
padat.
Kesetimbangan diantara fase gerak dan fase diam
akan menentukan pemisahan solut yang berbeda-
beda.
4
Fase diam dalam kromatografi adsorpsi disebut
"Adsorben"
 Ketika cairan digunakan sebagai fase gerak maka
disebut "Liquid-Solid Chromatography (LSC)
contohnya TLC dan HPLC
Jika fase gerak berupa gas disebut "Gas-Solid
Chromatography (GSC) misal Gas Chromatography
(GC).
5
Sorption problems
ABsorption ADsorption
Different sorptions explained
6
Kromatografi Adsorpsi
7
Dalam kromatografi adsorpsi ada dua tipe
gaya:
1. Gaya tarik solut pada adsorben (Stationary

Phase).
2. Gaya yang bekerja untuk mengeluarkan solut
dari adsorben untuk bergerak bersama fase
gerak.
8
1. Gaya Tarik:
Dapat diklasifikasikan sebagai berikut sesuai dengan
kekuatannya :
 Dipole–dipole attraction: Ini adalah gaya tarik diantara
adsorben polar dan solut polar.
 Hydrogen bonding: Ini adalah tipe ikatan yang lebih
lemah dibanding ikatan kovalen. Ikatan Hidrogen
terbentuk diantara hidrogen gugus OH ( seperti pada
silica) dan atom electronegatif seperti Oksigen,
nitrogen dalam solut.
9
Ikatan Hidrogen
OH
Si O
R -C - OH
10
Polar Interactions: Dipole-Dipole Interactions
11
1. Gaya Tarik:
 Gaya Polarisabilitas (Dipole induce Dipole): Suatu
gaya yang muncul diantara adsorben polar dan
solut yang bisa dipolarisasi seperti pada molekul
aromatik.
 Ikatan Kovalen Lemah: Seperti yang terjadi selama
pembentukan kompleks
 Gaya Van der Waals: Gaya tarik Non polar muncul
diantara inti suatu atom dan elektron atom lain.
12
Polar Interactions: Dipole-Induced Dipole Interactions
13
2. Gaya yang menyebabkan bergeraknya solut:
 Elution: Kecenderungan solut untuk terlarut dan bergerak

bersama fase gerak.
Solven yang digunakan sebagai fase gerak harus cukup
mampu melarutkan solut agar bisa berkompetisi dengan
adsorpsi dari fase diam / adsorben. Jika solven yang
digunakan sangat kuat, maka solven akan mencuci (wash out)
semua solut bersama tanpa pemisahan. Solven yang sering
digunakan adalah Eter/ hidrokarbon / solven karbonil.
14
2. Gaya yang menyebabkan bergeraknya solut:
 Displacement: Molekul solven berkompetisi dengan solut

untuk berinteraksi dengan tempat adsorpsi pada fase diam
/ adsorben. Kompetisi ini akan mengakibatkan solut
bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga dapat
dipisahkan antara solut yang satu dengan solut yang lain.
15
Deret Eluotropik (Elutropic Series) Solven:
Solven disusun dalam suatu urutan

berdasarkan kekuatannya dengan urutan yang
meningkat (ke atas) dari yang paling lemah ke
yang paling kuat.
16
Deret eluotropik
17
Deret Eluotropik
Arrangement of polar groups Elutropic series of solvents
according to their binding to adsorbent (increasing strength)
-COOH carboxylic Light petroleum & Hexanes
-OH hydroxyl Cyclohexane
-NH2 amines Carbon tetrachloride
-CHO aldehydes Trichloro ethylene
-C=O ketones Toluene
-COOR esters Benzene
-OCH3 ethers Dichloromethane
-C=C- olifens Chloroform
Ethyl ether
Ethyl acetate
Acetone
n-Propanol
Ethanol
Methanol
Water
18
19
20
Jenis Adsorben : ( Fase Diam)
Adsorben yang ideal harus memenuhi persyaratan
berikut :
 Tidak larut / Insoluble dalam fase gerak.
 Inert terhadap solut.
 Tidak berwarna terutama ketika bekerja
dengan campuran sampel yang berwarna.
 Memiliki ukuran partikel yang sesuai untuk
memberikan pemisahan yang baik dengan
kecepatan alir yang masih memungkinkan..
21
Contoh-contoh adsorben:
1. Silica gel - Silica - Silica acid:
 Adalah adsorben yang paling luas penggunaannya
baik pada kromatografi kolom maupun KLT.
 Silica gel disiapkan dengan asidifikasi Natrium silikat
menggunakan asam sulfat yang diikuti dengan
pencucian menggunakan air dan pengeringan.
 Sisi aktif dari silika gel adalah gugus hidroksil yang
terikat pada atom silikon “Gugus Silanol / Silanol
groups". Gugus ini sejauh 5 0A dan membentuk
ikatan hidrogen dengan solut.
22
 Silica gel mencapai daya maksimumnya ketika
dipanaskan anatar 150 -250 0C untuk
menghilangkan molekul air.
 Jika silica gel mengandung molekul air, maka
akan terjadi partisi dan bukan adsorpsi.
 Pengecilan ukuran partikel akan
meningkatkan luas area dan akan
meningkatkan daya pemisahan.
23
Gugus Silanol pada Silica Gel
OH OH
Si---------O-------Si
24
Derivat silica gel:
Semua berbasis pada reaksi dengan gugus Si – OH ( Gugus
Silanol)
1- Reversed untuk
phase menutup
silica gel ( RP): gugus ini
In this type a straight chain aliphatic groups are attached to the
OH of silica gel by silylation. RP silica gel are named according to
the length of the carbon chains.
C4 (RP4) C8 (RP8) C18 (RP18)
Si-O-Si–(CH2)3 –CH3 Si-O-Si-(CH2)7-CH3 Si-O-Si-(CH2)17-CH3
OKTADESIL
25
Reversed Phase Silica Gel (RP).
Pada deriva silica ini, gugus alifatik lurus diikatkan pada OH silica gel
melalui sililasi. RP silica gel dinamai tergantung panjangnya rantai
karbon
C4(RP4)
Si-O-Si-(CH2)3-CH3
C8 (RP8)
Si-O-Si-(CH2)7-CH3
C18 (RP18) atau Oktadesil
Si-O-Si-(CH2)17-CH3
26
Reverse phase chromatography
Silica is alkylated with long chain hydrocarbon groups, using 18
carbons long. This is usually referred to as C-18 silica.
CH3
CH2
CH3 17 CH3
Si
CH2 SiCH3)3 CH3
17 CH3
SiCH3)3
SiCH3)3
O
Si O
CH3 O
O
O Si
Si O
Si O
Si O O
Si O O
O O
O O
O Si
Si O
Si O
Si O O
Si O O
O O
O O
O
Si
Si O
O
O O
O
27
Derivat silica gel:
2- Cyano silica gel:
O
Si-O–Si –(CH2)3-CN
Si
28
2. Alumina:
• Aluminum oksida (Al2O3). Alumina diaktifkan
dengan memanaskan pada 400 0C semalaman.
29
Keuntungan alumina:
1. Kapasitas besar
2. Insoluble
3. Relatif inert
4. Mudah diperoleh
5. Proses Adsorpsi berbeda dari silica gel
disebabkan oleh muatan positif Al+++ dan
pengaruh sisi basa yang dengan mudah
mempengaruhi polarisasi senyawa. Baik untuk
pemisahan senyawa aromatik dari olefin.
30
Kerugian :
1. Tidak sesuai untuk senyawa basa yang labil
2. Menyebabkan penataan ulang /
rearrangement dan ekspansi cincin pada
molekul tak jenuh
3. Bereaksi secara kimia dengan senyawa
asam
31
Jenis – jenis alumina :
1. Alumina Netral pH 7– 7.5.
2. Alumina Asam pH 4. Dibuat dengan mencuci
aluminum oksida dengan 2N HCl kemudian
dengan akuadestilata.
3. Alumina Basa pH 10. Tipe ini dibuat dengan
mencuci dengan NaOH kemudian dengan
akuadestilata.
32
3. Charcoal:
Ada dua tipe charcoal berdasarkan temperatur
untuk aktivasi:
a. Charcoal Non–polar disiapkan dengan
aktivasi pada 1000 0C dan aksinya dengan
adsorpsi melalui ikatan hidrogen dan gaya
elektrostatik
b. Charcoal Polar disiapkan pada
temperatur rendah dan mengandung
molekul air sehingga aksinya melalui
mekanisme partisi
33
4. Kieselguhr (Diatomaceous earth / tanah
diatomae):
 Memiliki daya adsorpsi yang relatif rendah
34
2. Kromatografi Partisi
(Partition Chromatography)
 Dikenal juga sebagai Liquid-Liquid Chromatography

(LLC).
 Jika fase geraknya berupa gas maka disebut Gas-
liquid Chromatography (GLC).
35
Dalam LLC kedua fase (fase diam & fase gerak)
adalah cair.
Kedua cairan harus immiscible (tidak saling
campur).
Fase diam cair berupa lapisan tipis pada padatan
pendukung inert dan biasanya merupakan cairan
yang lebih polar (fase aqueous).
Pemisahan terjadi karena perbedaan koefisien
partisi solut diantara kedua zat cair tersebut.
36
2. Kromatografi Partisi (Partition
Chromatography)
Bentuk kromatografi ini berdasarkan pada
suatu fase diam cair yang dilapiskan tipis
pada suatu permukaan pendukung zat
padat.
Solut akan berkesetimbangan (terbagi)
diantara fase gerak dan fase diam cair.
37
Contoh zat padat pendukung:
1. Kertas Kromatografi
2. Serbuk Selulosa.
3. Kieselguhr .
4. Silica gel.
• Pendukung ini mendukung fase diam
aqueous dengan ikatan hidrogen
38
Reversed phase (RP) Chromatography:
 Pada RP, pendukung dimodifikasi untuk menahan
fase diam yang non polar dan fase gerak yang lebih
polar.
 Reversed phase silica gel adalah suatu contoh fase
diam jenis ini seperti RP18 (C18) / RP 8 (C8).
 Kromatografi Partisi lebih baik dalam pemisahan
solut yang lebih polar yang mana solut polar tidak
mudah dielusi pada kromatografi berbasis
mekanisme adsorpsi.
39
Kromatografi Partisi
40
3. Kromatografi Penukar Ion
(Ion Exchange Chromatography)
• Pada tipe kromatografi ini, resin (fase diam)
digunakan untuk secara kovalen diikatkan
anion atau kation kepadanya.
• Solut (ion) yang muatannya berlawanan di
dalam fase gerak akan tertarik dan berikatan
kepada resin (fase diam) dengan gaya
elektrostatik.
41
Kromatografi Penukar Ion
42
• Pemisahan molekul berdasarkan pada muatan
• Fase gerak
– Umumnya cair
• Fase diam
– Ion yang bermuatan terikat pada matriks yang
inert dan tidak larut.
• Elusi protein
– Tambahkan garam untuk berkompetisi dengan
ikatan sampel dengan fase diam.
– Rubah pH (mengubah muatan protein).
43
Structure of Ion-Exchangers
44
45
Anion exchangers are positively charged exchangers
and have negatively charged counter labile-ions
(anions) available for exchange.
Cation exchangers are negatively charged
exchangers and have positively charged counter
labile-ions (cations) available for exchange.
46
Ion exchange process
47
Kromatografi
Penukar Ion
48
Contoh Fase Diam Pada
H2
C O
CH3 C
cellulose
H2C
H2 H
O-
C N CH3
C C
cellulose H2 H2 carboxymethyl (CM)
diethylaminoethyl (DEAE) (Cation exchange)
(Anion exchange)
49
Low salt High salt

50
4. Kromatografi eksklusi molekul
(Molecular Exclusion Chromatography)
 Dikenal juga dengan gel permeation (permeasi gel)
atau gel filtration (filtrasi gel)
 Tipe kromatografi ini melibatkan sedikit kekuatan
interaksi antara fase diam dan solut.
 Fase gerak cairan atau gas dilewatkan melalui gel
berpori yang akan memisahkan molekul sesuai
dengan ukurannya.
 Pori biasanya kecil, sehingga molekul yang besar
tidak akan masuk, sedangkan molekul yang lebih
kecil akan masuk ke dalam pori gel.
 Hal ini menyebabkan molekul yang lebih besar
akan melewati kolom lebih cepat dibandingkan
molekul yang lebih kecil.
51
Kromatografi eksklusi molekul
52
53
54
55
56
Pemisahan molekul
berdasarkan pada ukuran.
Molekul besar keluar
pertama.
Fase gerak
– Cair
Fase Diam
– Tidak larut (Insoluble),
butiran karbohidrat
berpori
57
Contoh aplikasi : Size
exclusion
chromatography
analysis of papain-
cleaved monoclonal
antibody using
Superdex™ 200
Increase Columns
58
59
5. Kromatografi Afinitas
(Affinity Chromatography)
 Tipe kromatografi ini adalah yang paling selektif.
Adanya interaksi yang spesifik antara molekul solut
dan molekul kedua yang dilapiskan pada fase diam.
Sebagai contoh, molekul yang dilapiskan pada fase
diam adalah antibodi untuk beberapa protein
spesifik.
 Ketika solut yang mengandung campuran protein
melewati molekul ini, hanya protein spesifik saja
yang bereaksi dengan antibodi, terikat pada
antibodi yang ada melapisi fase diam.
 Protein ini kemudian diekstraksi/ dilepaskan dari
ikatannya dari fase diam dengan merubah
kekuatan ionik atau pH fase gerak.
60
Kromatografi Afinitas
61
62
Kromatografi
Afinitas
Fase gerak
– Biasanya cair
Fase diam
– Reseptor yang terikat
pada butiran
pendukung
Immunoaffinity column
63
glutathione
GST tag
64
65
66
Kromatografi Afinitas dapat digunakan untuk:
1.) Memurnikan atau memekatkan molekul dari
campuran menjadi larutan dalam suatu
buffer.
2.) Menurunkan jumlah molekul dalam suatu
campuran.
3.) Menentukan komponen yang terikat pada
molekul tertentu, misalnya obat.
67
68
69
KROMATOGRAFI KERTAS
1
Penggunaan Kromatografi
Kertas
Dapat digunakan untuk:
 Pengujian kemurnian suatu senyawa,
 Identifikasi senyawa, dan
 Penentuan banyaknya senyawa dalam sampel.
• Analyze
Separate • Identify
• Purify
• Quantify
Mixture Components
2
Keuntungan Kromatografi
Kertas
Kromatografi ini memiliki keuntungan :
 merupakan tehnik yang relatif cepat
 membutuhkan sejumlah kecil sampel
untuk dianalisis
3
Fase diam
 Fase diam biasanya merupakan suatu kertas saring
dengan kualitas tinggi.
 Kertas tersebut memiliki bentuk dan ketebalan yang
sesuai
 Kertas tersebut dapat berperan sebagai fase diam atau
hanya menjadi pendukung.
 Jika pada permukaan kertas ada molekul air, maka
molekul air tersebut yang berperan sebagai fase diam.
4
Fase Gerak
• Biasanya campuran pelarut (organik atau
aqueous)
• Contohnya:
Toluen P : Etil Asetat P (90 : 10) v/v
Artinya jika kita menyiapkan 100 ml fase
gerak maka kita mencampurkan 90 ml Toluen
P dan 10 ml Etil Asetat P.
Jika kita menyiapkan 10 ml fase gerak maka
kita mencampurkan 9 ml Toluen P dan 1 ml
Etil Asetat P. 5
 Senyawa yang dipisahkan akan terdistribusi
diantara fase diam dan fase gerak.
 Jika kertas sebagai fase diam, komponen dari
sampel akan terpisah pada fase diam tergantung
seberapa kuat komponen tersebut teradsorbsi
pada fase diam dibandingkan dengan seberapa
terlarutnya komponen tersebut di dalam fase
gerak
 Ilustrasinya dapat Anda lihat pada slide berikut
ini: (slide no 5)
6
Ilustrasi Kromatografi Kertas
Stationary Phase
Separation
Mobile Phase
Mixture Components
Components Affinity to Stationary Phase Affinity to Mobile Phase
Blue ---------------- Insoluble in Mobile Phase
Black  
Red  
Yellow           7
Penjelasan slide di atas
Components Affinity to Stationary Phase Affinity to Mobile Phase
Blue ---------------- Insoluble in Mobile Phase
Black  
Red  
Yellow          
Komponen/ zat yang berwarna biru teradsorbsi pada

fase diam paling kuat, dan kelarutannya dalam
fase gerak paling rendah. Akibatnya zat tersebut
akan berada paling bawah karena bergerak paling
lambat selama eluasi.
Sebaliknya,
Komponen/ zat yang berwarna kuning teradsorbsi
pada fase diam paling lemah, dan kelarutannya
dalam fase gerak paling tinggi. Akibatnya zat
tersebut akan berada paling atas karena bergerak
8
paling cepat selama eluasi.
Fase gerak dapat bergerak sepanjang kertas, dapat
dijelaskan dengan gaya:
Gaya Kapiler – gerakan cairan solven diantara material

berpori disebabkan oleh gaya adesi, kohesi dan surface
tension. Solven cairan dapat bergerak naik sepanjang
kertas saring sebab gaya tarik pada dirinya lebih kuat
daripada gaya gravitasi
Solut dapat terbawa dan bergerak sepanjang kertas, dapat
dijelaskan dengan ini:
Solubility/ Kelarutan – derajat yang menunjukkan suatu
material (solut) terlarut pada suatu solven. Solut terlarut
pada solven yang memiliki sifat yang mirip (Like dissolves
like).
9
Peralatan
Peralatan untuk kromatografi kertas sangat sederhana
antara lain:
• Bejana kromatografi
• Rak berfungsi sebagai pendukung untuk
palung pelarut
• Batang untuk gantungan kentas kromatografi.
• Mikropipet atau pipa kapiler
• Kertas kromatografi
10
1. Penyiapan Bejana Pengembang
(Chamber)
 Pilih bejana pengembang yang dapat ditutup rapat.
 Bejana pengembang harus cukup besar untuk
menampung kertas yang akan dikembangkan.
 Bejana pengembang harus bersih dan kering
sebelum digunakan.
 Masukkan fase gerak ke dalam bejana sehingga
kedalaman fase gerak dalam bejana sekitar 2 cm.
 Tutup rapat bejana dan dibiarkan selama semalam
jika memungkinakan.
 Semakin besar ukuran bejana pengembang,
semakin lama harus dibiarkan.
11
Jenuhkan bejana dengan uap fase gerak
dengan meletakkan kertas saring yang telah
dibasahi fase gerak sepanjang dinding bagian
dalam bejana.
Kertas saring
Fase
gerak
12
2. Penyiapan Fase Diam
• Potong segi empat kertas saring berkualitas tinggi
dengan ukuran sesuai dengan bejana pengembang.
• Dengan menggunakan pensil, gambarkan garis lurus
sekitar 2-3 cm dari batas bawah kertas.
13
3. Penotolan Sampel
• Zat atau campuran zat yang akan diuji
dilarutkan dalam pelarut yang sesuai.
• Larutan biasanya mengandung 1 - 20
µg senyawa,
• Dengan menggunakan mikropipet
yang sesuai (atau pipa kapiler),
ditotolkan dalam bentuk titik 6 - 10
mm
• Antar totolan diberi jarak sehingga
tidak saling overlap/ tumpang tindih.
• Jika jumlah sampel yang lebih besar
diperlukan untuk percobaan sekali
aplikasi, maka penotolan dilakukan
berulang-ulang. 14
15
Dalam satu kertas
yang akan dieluasi/
dikembangkan,
dapat ditotolkan
beberapa larutan
(sampel uji dan
baku pembanding)
Ket:
Ser Std. = Standar Serine
Phe Std. = Standar
Phenilalanin
Lys Std. = Standar Lysine Penotolan sampel uji
dan standar untuk
identifikasi asam amino 16
4. Pengembangan Kromatogram
17
Arah elusi pada kromatografi
kertas
a. Menurun
Fase gerak merambat dengan bantuan gaya
gravitasi.
b. Menaik
Fase gerak dibawa oleh kertas melalui gaya
kapiler
c. Radial
d. Dua dimensi (Two dimensional technique)
18
a. Eluasi Menurun
19
Prosedur Kromatografi Kertas
Eluasi Menurun:
1. Kertas kromatografi yang telah ditotolkan larutan uji,
dimasukkan ke dalam bejana, digantung menggunakan
batang untuk memegang ujung atas kertas dalam
palung pelarut. [Catatan Pastikan posisi kertas yang
menggantung tidak menyentuh rak, dinding bejana
kromatografi, ataupun larutan dalam bejana
kromatografi.]
2. Bejana kromatografi ditutup rapat, masukkan fase gerak
melalu inlet, biarkan sampai bejana kromatografi jenuh
dengan uap fase gerak.
20
3. Kelebihan tekanan dapat dikurangi bila diperlukan,
tutup inlet dan biarkan fase gerak merambat pada
kertas secara menurun sesuai dengart jarak yang telah
ditentukan.
4. Keluarkan kertas dari bejana kromatografi.
5. Tandai batas rambat dan keringkan kertas.
6. Amati kromatogram dengan penampak bercak atau
sinar UV.
21
b. Eluasi Menaik
22
Prosedur Kromatografi Kertas
Eluasi Menaik
1. Masukkan fase gerak ke dalam bejana kromatografi.
2. Tutup rapat bejana kromatografi hingga jenuh dengan
uap fase gerak. Kelebihan tekanan dapat dikurangi bila
diperlukan.
3. Celupkan kertas kromatografi ke dalam fase gerak.
4. Ketika eluasi sampai pada batas yang telah ditentukan,
keluarkan kertas kromatografi dan keringkan.
5. Amati kromatogram dengan penainpak bercak atau
sinar UV.
23
c. Eluasi Radial
24
Prosedur Kromatografi Kertas Eluasi
Radial:
1. Masukkan fase gerak ke dalam bejana kromatografi.
2. Tutup rapat bejana kromatografi hingga jenuh dengan uap
fase gerak. Kelebihan tekanan dapat dikurangi bila
diperlukan.
3. Pada kertas yang berbentuk lingkaran, di bagian tengah
diberi sumbu kertas.
4. Celupkan kertas kromatografi ke dalam fase gerak.
5. Fase gerak akan bergerak ke semua arah secara radial
(membentuk lingkaran)
6. Ketika eluasi sampai pada batas yang telah ditentukan,
keluarkan kertas kromatografi dan keringkan.
7. Amati kromatogram dengan penainpak bercak atau sinar
25
UV.
d. Eluasi Dua
Dimensi
(Two Dimensional Technique)
26
Prosedur Kromatografi Kertas Eluasi Dua
Dimensi (Two Dimensional Technique) :
• Eluasi dua dimensi dilakukan dengan tahapan:
a. Elusi tahap pertama
b. Setelah selesai, kertas diangkat dan dikeringanginkan
c. Disiapkan chamber yang diisi dengan fase gerak yang
berbeda dengan eluasi pertama
d. Kertas dari poin b (yang sudah dikeringanginkan)
dimasukkan ke dalam chamber dengan arah diputar 90o
dari posisi kertas pada eluasi pertama.
e. Setelah eluasi kedua selesai, kertas diangkat dan
dikeringanginkan
27
4. Pengembangan Kromatogram
 Hati-hati memegang kertas. Pegang pada tepinya, dan
jangan membiarkan bejana terbuka terlalu lama.
 Mula-mula, kertas digantungkan ke dalam bejana tanpa
menyentuh solven.
 Untuk menggantungkan kertas menggunakan benang dan
paper clip. Ikat / lekatkan benang pada bagian luar bejana
agar kertas kromatografi bisa ditahan pada tempatnya.
 Kertas harus digantung dalam bejana pengembang
semalam, jika memungkinkan.
 Setelah kertas digantung di dalam bejana, rendam batas
bawah kertas ke dalam larutan pengembang (fase gerak)
 Biarkan kertas kromatografi menjadi kering (keringanginkan)
28
 Pengembangan
kertas kromatografi
seperti gambar di
samping ini.
 Apakah menurut
anda akan
menghasilkan hasil
yang baik ?
29
• Setelah kertas
diangkat dari
bejana
pengembang, dan
dikeringaninkan.
• Apa yang lupa /
tidak dilakukan ?
30
5. Mengidentifikasi Bercak
(Spot)
 Jika bercak dapat dilihat, beri tanda di sekeliling bercak
(biasanya bentuknya lingkaran) dengan menggunakan
pensil
 Jika bercak tidak jelas terlihat / tidak tampak, tehnik
visualisasi bercak yang umum adalah dengan
meletakkan kertas di bawah lampu ultraviolet (Lampu
UV) (Peringatan: Jangan melihat langsung pada lampu
UV). Banyak senyawa organik dapat dilihat dengan
tehnik ini.
 Beri tanda di sekeliling bercak dengan menggunakan
pensil.
31
UV-Lamp Cabinet
32
6. Interpretasi Data
• Setelah bercak ditandai, selanjutnya menghitung nilai Rf

masing-masing bercak.
• Rf bisa berarti"ratio of fronts" atau “Retention Factor”
• Nilai Rf karakteristik untuk tiap-tiap senyawa.
• Oleh karena itu, nilai Rf senyawa yang sudah diketahui
(zat baku pembanding / referen) dapat dibandingkan
dengan nilai Rf senyawa yang tidak diketahui untuk
membantu identifikasi senyawa tak diketahui tersebut.
33
Cara menghitung nilai Rf
senyawa
Rf = jarak tempuh bercak dari titik penotolan

Jarak Tempuh Solven dari titik penotolan 34
Berikut adalah
contoh cara
menghitung
nilai Rf.
35
Baku Pembanding Untuk Identifikasi
Senyawa
• Nilai Rf dapat dipengaruhi oleh kertas
temperatur, solven, dan tipe
kertas yang digunakan dalam
percobaan;
• Identifikasi suatu senyawa dalam
sampel dilakukan dengan
menotolkan senyawa yang
diketahui (sebagai baku
pembanding) pada kertas
kromatografi yang sama.
• Misalnya: Untuk identifikasi
antibiotik gentamisin dalam S P
sediaan injeksi secara
S = Sampel
kromatografi kertas, maka pada
kertas ditotolkan sampel injeksi P = Pembanding
36
dan pembanding gentamisin.
Kromatografi Untuk Uji
Kemurnian Sampel
 Kemurnian suatu sampel dapat diperkirakan dari
kromatogram yang diperoleh.
 Suatu sampel yang tidak murni, hasil
pengembangan satu totolan sampel akan
menghasilkan dua atau lebih bercak, sedangkan
suatu sampel yang murni akan hanya
menghasilkan satu bercak dari pengembangan
satu totolan sampel.
37
Skema pemisahan tinta warna hitamg dengan
kromatografi kertas
38
Hitunglah nilai
Rf untuk bercak
berwana kuning
dan bercak
berwarna biru !
39
Hitunglah nilai Rf untuk bercak berwana
kuning dan bercak berwarna biru !
40
HRf
Rumus berikut digunakan untuk menghitung nilai

HRf dari nilai Rf
HRf = Jarak tempuh bercak dari titik penotolan x 100

Jarak Tempuh Solven dari titik penotolan
Nilai Rf berkisar dari 0 - 1

Nilai HRf berkisar dari 0 - 100
41
Link
https://www.youtube.com/watch?v=mz_xcNrTK_U
https://www.youtube.com/watch?v=FAN6kyZVQXo
42
Kromatografi Lapis Tipis/KLT
(Thin Layer Chromatography/TLC)
1
KLT
 KLT merupakan bentuk kromatografi
planar, selain kromatografi kertas
2
Berikut beberapa contoh
aplikasi KLT
3
Beberapa Contoh Penggunaan KLT
a. Untuk menentukan berapa banyak komponen

yang terkandung dalam suatu campuran
b. Untuk identifikasi senyawa
c. Untuk menentukan kondisi solven terbaik untuk
pemisahan pada kromatografi kolom
d. Untuk memonitor fraksi yang dikumpulkan pada
kromatografi kolom
e. Untuk memonitor perjalanan / progress reaksi
(sintesis)
4
Contoh Aplikasi KLT
(poin e: Untuk memonitor perjalanan /
progress reaksi (sintesis)
KLT dapat digunakan untuk memantau reaksi kimia. Pada

plat KLT kita totolkan starting material (atau reagen),
campuran reaksi, dan produk. 5
Berikut adalah kelebihan KLT
dibandingkan Kromatografi Kertas dan
Kromatografi Kolom:
• Peralatan sederhana
• Waktu eluasi atau pengembangan singkat
• Tersedia fase gerak yang beragam
• Perolehan kembali senyawa yang dipisahkan dapat
cepat dilakukan
• Pemisahan yang lebih baik
• Visualisasi senyawa yang sudah dipisahkan lebih mudah
• Batas Deteksi yang lebih rendah
• Tersedia Plat lapis tipis dengan ketebalan yang
bervariasi
• Fase diam yang inert
6
• Dapat digunakan untuk trace analysis
 Permukaan plat KLT tersusun oleh lapisan yang sangat tipis
misalnya dari silica pada pendukung plastik/gelas atau aluminium.
 Silica bersifat sangat polar.
 Senyawa non polar akan terikat lemah pada plat KLT (fase diam)
silica dan akan akan lebih kuat berinteraksi dengan fase gerak.
Sehingga senyawa ini akan bergerak lebih cepat pada plat dan
akan muncul pada bagian atas plat KLT.
 Senyawa Polar akan terikat kuat pada plat KLT silica dan akan
berinteraksi lemah dengan fase gerak sehingga akan muncul lebih
di bawah pada plat KLT.
 Komponen sampel akan terpisah pada fase diam menurut

seberapa banyak diadsorbsi pada fase diam versus seberapa
banyak komponen terlarut dalam fase gerak. 7
Polaritas & Gaya Tarik Intermolekuler adalah dua faktor
yang dapat menentukan pemisahan komponen-
komponen campuran Prediksi:
Contoh : Pemisahan campuran butil amin dan
Cycloheksana akan
cycloheksana menggunakan KLT
terelusi pertama /
Pertimbangkan :
lebih cepat
1. Polaritas tiap komponen dalam campuran
melewati fase diam
sampel
Butil amin akan
Butil amin bersifat polar; cycloheksana bersifat
terelusi terakhir /
non polar
lebih lambat
2. Polaritas fase diam H2
Silica gel (atau alumina) bersifat polar - dapat sikloheksan C
H2C CH2
diprediksi bahwa butil amin akan berinteraksi H2C CH2
C
lebih kuat dengan fase diam H2
3. Polaritas Fase gerak – Solven yang digunakan -
O O
harus memiliki kemampuan untuk melarutkan +
+ Si
keduanya dengan tingkat ke;arutan yang - H
N silika
berbeda 8
butilamin H
Penjerap/ Fase Diam KLT
Penjerap Mekanisme Contoh Penggunaan
sorpsi
Silika gel Adsorpsi Asam amino, hidrokarbon,
vitamin, alkaloid
Silika yang Partisi Senyawa-senyawa non polar
dimodifikasi dengan termodifikasi
hidrokarbon
Serbuk selulosa Partisi Asam amino, nukleotida,
karbohidrat
Alumina Adsorpsi Hidrokarbon, ion logam, pewarna
makanan, alkaloid
Kieselguhr (tanah Partisi Gula, asam-asam lemak
diatomae)
Selulosa penukar ion Pertukaran ion Asam nukleat, nukleotida, halida
dan ion-ion logam
Gel sephadex Eksklusi Polimer, protein, kompleks logam
-siklodekstrin Interaksi adsorpsi Campuran enansiomer
9
stereospesifik
Silika gel
OH
OH
OH
OH
OH Si
Si O
Si O
Si O O
Si O O
O O
O O
O Si Si
O O
Si
Si O O O
Si O O
O
O O
O
Si
Si O
O
O O
O
Daya pisah dan efisiensi pemisahan tergantung pada ukuran dan

distribusi ukuran partikel.
Daya pisah meningkat seiring dengan semakin seragam dan
kecilnya ukuran partikel
KLT – 10 µm HPTLC = High Perforfance Thin Layer 10
HPTLC – 5 – 6 µm Chromatography
Silika gel
• Di pasaran, tersedia Lempeng KLT silika gel yang
mengandung indikator fluoresen (bahan yang
berfluoresensi atau berpendar), yang biasanya berupa
seng silikat atau fosfor yang diaktivasi oleng mangan
(Mn),
• Indikator fluoeresen pada lempeng ini akan
mengemisikan suatu fluoresensi hijau ketika
diradiasi/disinari dengan lampu UV pada panjang
gelombang 254 nm.
11
Diamati di bawah sinar UV
Senyawa yang
mampu menyerap
sinar UV
Senyawa-senyawa yang mampu menyerap sinar UV

akan muncul sebagai bercak-bercak hitam terhadap
dasar yang berfluoresensi hijau disebabkan oleh adanya
peredaman fluoresensi
12
Berikut adalah beberapa tatanama terkait lempeng KLT
Simbol / Makna
singkatan
“Sil” Suatu produk yang mengandung silika gel seperti Anasil dari
pabrik Analabs
G Pengikat (lapisan halus) gipsum (CaSO4.1/2 H2O)
O Pengikat organik seperti polimetakrilat atau polikarboksilat.
Lapisan-lapisan ini bersifat keras dan tahan terhadap abrasi
H atau N “No foreign binder” (tidak ada pengikat luar). Produk dengan
kode ini juga dapat mengandung berbagai macam penjerap
yang berbeda seperti silika gel hidrat atau asam silikat
koloidal untuk meningkatkan stabilitas lapisan
HL Hard Layer (lapisan keras), merupakan lapisan yang tahan
terhdap abrasi yang mengandung pengeras anorganik
HR “Highly refined”
P Lapisan untuk preparatif
P + CaSO4 Lapisan preparatif yang mengandung pengikat kalsium sulfat
13
Simbol / Makna
singkatan
F atau UV Ditambah bahan yang berfluoresensi seperti seng silikat teraktivasi
mangan
254 dan 366 Digunakan setelah simbol F atau UV, untuk menunjukkan panjang
gelombang eksitasi senyawa berfosforesensi yang ditambahkan
60 Silika gel (dari E. Merck) yang mempunyai ukuran pori 60 Ao (10 Ao = 1
nm). Ukuran pori yang lain ditandai 40, 80 dan 100
D Lempeng dibagi ke dalam serangkaian saluran (channel) yang paralel
K Simbol yang digunakan oleh semua produk Whatman
RP “Reversed phase”; RP18 atau RP-C18 menunjukkan bahwa gugus
oktadesilsilan diikatkan secara kimia ke dalam silika gel
4,7,9 Bilangan yang dicantumkan setelah nama penjerap dan menunjukkan
pH bubur penjerap
14
Fase gerak
• Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari
pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-
coba atau melakukan optimasi beberapa fase
gerak, kemudian ditentukan fase gerak mana
yang terbaik.
• Sistem fase gerak yang paling sederhana ialah
dengan menggunakan campuran 2 pelarut
organik.
15
Beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase
gerak:
 Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat
tinggi
 Daya elusi fase gerak diatur sedemikian rupa sehinga Rf
solut terletak antara 0,2 – 0,8 untuk memaksimalkan
pemisahan.
 Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar
seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan
kecepatan migrasi solut yang berarti menentukan nilai Rf
 Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik
digunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya
seperti campuran air-metanol dengan perbandingan
tertentu 16
Berikut adalah peralatan
sederhana untuk KLT
• Bejana Pengembang
• Lempeng KLT
• Kertas Saring
• Pensil
• Pipa Kapiler atau
mikropipet
• Solven
17
1. Penyiapan Bejana
• Ke dalam bejana yang dapat ditutup rapat, tuangkan
sejumlah tertentu solven yang sesuai sehingga
kedalaman solven sekitar 0,5 – 1 cm di dalam bejana.
• Kemudian, letakkan sepotong kertas saring ke dalam
bejana sehingga menempel pada dinding dan
tercelup ke dalam solven. Kenapa?
• Tutup bejana dengan rapat, dan biarkan bejana
sekitar 30 menit sehingga atmosfer di dalam bejana
menjadi dijenuhi dengan solven.
18
Berikut adalah beberapa contoh
bejana KLT
19
1. Bejana ini sudah
dibiarkan selama 30
menit. Apakah
bejana ini sudah
siap untuk
digunakan pada
percobaan KLT ?
20
Kelembaban
relatif atmosfir
bejana
Contoh: Pengaruh kelembaban relatif. Ketika kelembaban relatif

bejana sebesar 18% tampak bahwa pemisahan senyawa tidak
sempurna (yaitu bercak yang merah dan biru tidak terpisah),
sedangkan ketika kelembaban relatif bejana dibuat menjadi 75%
tampak bahwa pemisahan yang dihasilkan lebih baik (senyawa
merah dan bitu terpisah sempurna)
21
2. Penyiapan Plat untuk
Pengembangan
• Dengan pensil, buatlah tanda/goresan kecil pada
adsorben sekitar 2 cm dari batas bawah plat.
• Goresan kecil tersebut harus pada pinggir plat dan
tiap goresan berjarak sama dari batas bawah plat.
• Goresan pada plat tersebut harus lebih jauh / lebih
tinggi daripada kedalaman solven pada bejana.
• Dengan menggunakan pipa kapiler atau mikropipet,
totolkan sampel pada plat KLT sehingga totolan yang
dihasilkan sejajar dengan titik goresan yang dibuat
tadi.
22
Aplikasi (Penotolan) sampel
• Pemisahan pada KLT yang optimal akan
diperoleh jika menotolkan sampel dengan
ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin
• Jika sampel yang ditotolkan terlalu banyak
maka akan menurunkan resolusi
23
Penotolan (aplikasi) sampel dapat dilakukan
sebagai suatu bercak, pita, atau dalam bentuk
zig-zag
24
Penotol sampel Otomatis
Penotolan
sampel pada
lempeng KLT
dapat juga
dengan alat ini.
1. Sampel 4.Motor stepper

2. Syringe analitik 5. Kontrol motor stepper
3. Aksi kontrol mekanik 6. Lempeng KLT 25
Berikut adalah contoh KLT yang
menggunakan alat penotolan sampel
otomatis. Anda lihat, totolan lebih rapi dan
seragam, ukuran serta jaraknya
Ini KLT yang penotolannya

menggunakan pipa kapiler/
mikro pipet 26
2. Apakah ada
masalah pada plat
KLT tersebut?
Jelaskan
27
3. Pengembangan Plat KLT
• Setelah penyiapan bejana pengembang dan
penotolan sampel, plat KLT telah siap untuk
pengembangan.
• Hati-hati memegang plat KLT, yaitu hanya pada
bagian tepi plat dan usahakan bejana pengembang
jangan dibuka terlalu lama.
• Ketika plat KLT diangkat dari bejana, segera tandai
garis depan solven (jarak terjauh solven pada plat
KLT) dengan menggunakan pensil.
28
Pengembangan
Ada beberapa teknik pengembangan pada KLT &
KLTKT/HPTLC:
a. Konvensional
b. Pengembangan 2 dimensi
c. Pengembangan Kontinyu
d. Pengembangan gradien
Kita bahas di slide berikutnya
Catatan: KLTKT = Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi 29

HPTLC = High Performance Thin Layer Chromatography
a. Konvensional Sama seperti yang kita bahas di
kromatografi kertas
30
b. Pengembangan 2 dimensi
• KLT 2 Dimensi
Pemisahan 2 tahap
Fase diam diputar 90o,
digunakan dua jenis fase
gerak
• KLT 2 dimensi bertujuan
untuk meningkatkan resolusi
sampel ketika solut-solut
mempunyai karakteristik
kimia yang hampir sama,
sehingga nilai Rf hampir sama
31
Sama seperti yang kita bahas di kromatografi kertas
c. Pengembangan Kontinyu
• Pada pengembangan ini, dilakukan

dengan cara mengalirkan fase gerak
secara terus menerus pada lempeng KLT
melalui suatu wadah (biasanya alas
tangki) melalui suatu lapisan, dan dibuang
dengan cara tertentu pada ujung lapisan
32
d. Pengembangan gradien
• Pengembangan ini dilakukan dengan

menggunakan komposisi fase gerak yang
berbeda-beda
• Lempeng yang berisi analit dapat dimasukkan
ke dalam bejana kromatografi yang berisi fase
gerak tertentu lalu komponen fase gerak
selanjutnya ditambahkan sedikit demi sedikit ke
dalam bejana dan diaduk sampai homogen.
• Tujuan utama sistem ini adalah untuk mengubah
polaritas fase gerak
• Kelemahan: sulit memperoleh komposisi fase
gerak yang reprodusibel 33
Tambahan penjelasan
pengembangan gradien
• Dimisalkan di awal pengembangan, kita
menggunakan fase gerak : n heksan : etil
asetat (1 : 1) atau (50 : 50).
• Kemudian pada saat lempeng KLT sudah
mulai dicelupkan, kita menambahkan etil
asetat.
• Akibat penambahan ini maka polaritas
fase gerak akan berubah karena jumlah
etil asetat menjadi bertambah banyak.
34
3. Apakah yang akan
terjadi ketika plat
KLT ini
dikembangkan di
dalam bejana
tersebut pada
gambar di
samping?
35
Catatan Penting
Pastikan untuk mengangkat plat KLT dari bejana
pengembang jika teramati solven pada garis depan tidak
lagi bergerak naik
Alasan : solven akan mengalami penguapan ketika

bergerak naik pada plat KLT
Maka : Jika kita tidak mengangkat plat KLT dari bejana,

semua bercak akan tampak mendekati batas atas plat
KLT. Ini bukan hasil yang baik dan akan mempersulit
deteksi dan interpretasi hasil.
36
4. Deteksi Bercak (Spot)
Berikut adalah ringkasan teknik deteksi bercak pada KLT
In situ detection and identification methods 37

4. Deteksi Bercak (Spot)
• Jika bercak terlihat dengan sinar tampak, tandai di
sekeliling bercak dengan pensil (biasanya berbentuk
lingkaran)
• Jika bercak / spot tidak tampak ketika diamati
menggunakan sinar tampak, maka harus
menggunakan visualisasi / penampak bercak.
• Visualisasi adalah suatu metode yang dapat
digunakan untuk menampakkan bercak pada KLT
agar terlihat dan dapat diidentifikasi.
38
a. Metode Deteksi Secara
Fisika
• Visual Detection
• Photometric Detection by TLC Scanners
• Photometric Detection by Video
Technology
39
a.1. Visual Detection
 Mengamati lempeng di bawah lampu UV yang
dipasang pada  emisi 254 atau 366 nm untuk
menampakkan solut sebagai bercak yang gelap atau
bercak yang berfluoresensi terang pada dasar yang
berfluoresensi seragam.
 Lempeng yang diperdagangkan dapat dibeli dalam
bentuk lempeng yang sudah diberi dengan senyawa
fluoresen yang tidak larut yang dimasukkan ke
dalam fase diam untuk memberikan dasar
fluoresensi.
40
41
Visualisasi Bercak
Plat KLT Plat KLT yang sama

Setelah pengembangan dilihat di bawah lampu UV
Dilihat pada lampu biasa Catatan : amati adanya
bercak yang bertambah
42
a.2. Deteksi bercak secara
Fotometrik dengan TLC Scanners
 Melakukan scanning pada permukaan
lempeng dengan densitometer (yaitu suatu
instrumen yang dapat mengukur intensitas
radiasi yang direfleksikan dari permukaan
lempeng ketika disinari dengan lampu UV
atau lampu sinar tampak).
 Solut-solut yang mampu menyerap sinar
akan dicatat sebagai puncak (peak) dalam
pencatat (recorder)
43
Densitometri
• Densitometri merupakan metode analisis
instrumental yang mendasarkan pada
interaksi radiasi elektromagnetik dengan
analit yang merupakan bercak pada KLT
• Densitometri lebih dititikberatkan untuk
analisis kuantitatif analit-analit dengan
kadar kecil, yang mana diperlukan
pemisahan terlebih dahulu dengan KLT
44
Densitometri
• Bercak di-scanning dengan sumber sinar dalam
bentuk celah (slit) yang dapat dipilih baik
panjangnya maupun lebarnya.
• Sinar yang dipantulkan diukur dengan sensor
cahaya (fotosensor).
• Perbedaan antara signal optik daerah yang tidak
mengandung bercak dengan daerah yang
mengandung bercak dihubungkan dengan
banyaknya analit yang ada melalui kurva
kalibrasi/kurva baku yang telah disiapkan dalam
lempeng yang sama.
45
Densitometer / TLC Scanners
Pada TLC Scanner dapat digunakan salah
satu dari kedua mode ini:
1. Transmission
2. Reflectance
Pada mode Reflectance, kita dapat mengukur

Absorbansi atau Fluoresensi.
Kisaran UV rendah (190 – 300 nm)
merupakan daerah yang paling berguna 46
Berikut adalah contoh densitogram ekstrak tanaman
Bercak baku pembanding,
hanya ada 1 puncak
Bercak sampel, ada

lebih dari 1 puncak
Densitogram KLT ekstrak metanol daun Agave americana

leaf, dan standar hecogenin, discan pada  430 nm
47
a.3. Deteksi Bercak secara
Fotometrik dengan Teknologi Video
CAMAG Reprostar 3 with cabinet cover, camera bellows,

camera support, and 3-CCD camera with zoom
objective. 48
Contoh aplikasi deteksi Bercak secara
Fotometrik dengan Teknologi Video
49
50
b. Metode Deteksi Secara
Mikrokimia
Ada dua cara, yaitu:
• Prechromatographic Derivatization
• Postchromatographic Derivatization
Prechromatographic Derivatization = derivatisasi atau
mereaksikan dengan reagen tertentu sebelum (pre)
pengembangan
Postchromatographic Derivatization = derivatisasi atau

mereaksikan dengan reagen tertentu setelah (post)
pengembangan
51
Postchromatographic
Derivatization
Ada beberapa cara ketika kita melakukan
derivatisasi menggunakan reagen :
• Immersion (merendam lempeng dalam reagen)
• Exposure to Vapor (lempeng KLT diuapi
dengan uap reagen)
• Spraying (lempeng KLT disemprot dengan
reagen)
Heating (pemanasan)  terkadang dibutuhkan
tahap memanaskan lempeng setelah direaksikan
dengan reagen.
52
Postchromatographic Derivatization
Contoh visualisasi bercak dapat dilakukan dengan cara:
1. Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang
akan bereaksi secara kimia dengan seluruh solut yang
mengandung gugus fungsional tertentu sehingga bercak
menjadi berwarna. Kadang lempeng perlu dipanaskan
terlebih dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan
warna dan untuk meningkatkan intensitas warna
2. Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam
nitrat pekat diikuti pemanasan untuk mengoksidasi solut-
solut organik yang akan tampak sebagai bercak hitam
sampai kecoklatan
3. Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber
tertutup.
53
Contoh gambar peralatan untuk
derivatisasi secara mikrokimia
CAMAG TLC plate heater.

CAMAG TLC sprayer.
54
Contoh gambar peralatan untuk
55
Reagen Umum & Selektif untuk
• Reagen umum  reagen yang berlaku
untuk hampir semua senyawa organik
Metode Deteksi Warna Penggunaan
bercak solut
Asam fosfomolibdat + Biru gelap Beberapa
pamanasan senyawa organik
Asam sulfat pekat + Hitam Semua senyawa
pemanasan kecoklatan organik
Uap Iodium Coklat Beberapa
senyawa organik
56
Reagen Umum & Selektif
• Reagen selektif  reagen hanya mendeteksi jenis atau
golongan senyawa tertentu
Metode Deteksi Warna bercak Penggunaan

solut
Ninhidrin Pink ke ungu Asam-asam amino dan amina
2,4-dinitrofenil hidrazon Oranye/ merah Senyawa-senyawa karbonil
Bromokresol hjau/ biru Kuning Asam-asam organik
2,7-fluoresein Kuning-kehijauan Senyawa organik
Vanilin/ asam sulfat Merah/ hijau/ Alkohol, keton
pink
Rhodamin B Berfluoresensi Lemak
merah
Anisaldehid/ antimon Berbagai macam Steroid
triklorida
Difenil amin/ seng Berbagai macam Pestisida 57
Contoh reagen untuk deteksi metabolit
sekunder yang terkandung dalam Centella
asiatica L.
58
c. Metode Deteksi Berbasis
Aktivitas Biologi (Bioactivity-
Based Detection Methods)
Contoh metode deteksi bercak yang
berbasis aktivitas biologi:
• Microbiological method
• Biochemical methods
59
Contoh Bioactivity-Based
Detection Methods:
• Saponin dapat ditekesi dengan sel darah merah
• Setelah pengembangan, suspensi darah – gelatin
diaplikasikan ke atas lempeng.
• Kemudian senyawa pada lempeng akan berdifusi dari
lempeng ke suspensi darah-gelatin.
• Jika ada saponin, maka senyawa ini akan menyebabkan
sel darah mengalami hemolisis, sehingga akan tampak
bercak transparan (mendekati tidak berwarna) pada latar
belakang yang pekat dari suspensi darah – gelatin.
60
Contoh lain:
• Adanya antibiotik dalam sampel lingkungan dapat
dideteksi dengan bakteri Bacillus subtilis
• Lempeng yang telah dikembangkan, dicelupkan ke
dalam larutan/ suspensi bakteri. Setelah inkubasi,
lempeng disemprot dengan reagen MTT-tetrazolium salt
yang setelah diinkubasi akan menghasilkan backgroun
atau latar belakang biru-violet.
• Adanya antibiotik pada bercak akan menghambat
pertumbuhan bakteri yang menyebabkan zona
hambatan yang cerah/ terang pada latar belakang yang
berwarna tadi
61
Contoh lain
62
5. Interpretasi Data
• Interpretasi dilakukan dengan menghitung
nilai Rf masing-masing bercak.
• Rf bisa berarti"ratio of fronts" atau
“Retention Factor” dan nilainya
karakteristik untuk tiap-tiap senyawa..
• Oleh karena itu, nilai Rf senyawa yang
sudah diketahui (zat baku pembanding /
referen) dapat dibandingkan dengan nilai
Rf senyawa yang tidak diketahui untuk
membantu identifikasi senyawa tak 63
diketahui tersebut.
Menghitung nilai Rf senyawa
Rf = jarak tempuh bercak dari titik penotolan

Jarak Tempuh Solven dari titik penotolan
64
Penentuan Nilai Rf
solvent front
Rf of component A =
dA component B
dS
dS
dB
Rf of component B =
dB
component A
dS
dA
Nilai Rf adalah fraksi
desimal, biasanya ditulis origin
dalam dua desimal
65
Senyawa Pembanding/ Baku/
Standar
• Nilai Rf sering tergantung pada
temperatur, solven, yang digunakan dalam
percobaan KLT
• Untuk identifikasi suatu senyawa
dilakukan dengan menotolkan senyawa
yang diketahui (sebagai baku
pembanding) pada Plat KLT yang sama.
66
Kemurnian
• Kemurnian suatu sampel dapat juga
diperkirakan dari kromatogram.
• Suatu sampel yang tidak murni, hasil
pengembangan satu totolan sampel akan
menghasilkan dua atau lebih bercak,
sedangkan suatu sampel yang murni akan
hanya menghasilkan satu bercak dari
pengembangan satu totolan sampel.
67
Satu Bercak  Murni??
• Setelah percobaan kromatografi, jika
pengembangan sampel hanya menghasilkan satu
bercak, maka bisa murni bisa juga tidak.
• Sampel mungkin mengandung senyawa lain tetapi
tidak terpisahkan di bawah kondisi percobaan.
• Kemurnian sampel biasanya diuji lagi dengan
tehnik yang lain, misalnya dengan pengukuran titik
lebur, atau mendapatkan spektrum NMR (nuclear
Magnetic Resonance) nya.
68
Aplikasi KLT untuk optimasi Kromatografi Kolom
Fase gerak pada KLT yang optimum yang akan digunakan

untuk kromatografi kolom adalah jika fase gerak tersebut
menghasilkan bercak-bercak dengan nilai Rf 0.2 < Rf < 0.5
69
Separation factor : dapat digunakan untuk
menunjukkan seberapa jauh perbedaan nilai Rf
kedua bercak, yang artinya dapat digunakan untuk
mengetahui terpisah tidaknya kedua bercak
Rf1 dan Rf2 nilai Rf kedua

puncak berdekatan ; dan
Rf1>Rf2
Rf1 dan Rf2 nilai Rf kedua

puncak berdekatan; dan
Rf1<Rf2
70
Spesifisitas (selektivitas)
Nilai Rs untuk 2 bercak/pita yang berdekatan
dihitung dengan persamaan :
d = jarak antar pusat dua spot/pita/bercak yang berdekatan

Wb1 dan Wb2 = lebar pita/spot/bercak pada base line
71
Ilustrasi resolui pada KLT (a)
Kromatogram; (b) corresponding concentration profiles of
chromatographic spots.
72
Pemisahan sebagai fungsi Rs
73
4. Mana dari sampel yang
ditotolkan pada plat KLT
berikut yang pasti tersusun
lebih dari satu senyawa ?
74
Bagaimana menurut anda hasil kedua
kromatografi tersebut?
75
KLT : Campuran 2 komponen
solvent front
component B Kurang polar

solvent front
component B
component A Lebih Polar

component A
origin mixture origin origin

solvent front
Meningkatnya waktu pengembangan

76
Thin-Layer Chromatography:
Qualitative Analysis
A = pembanding
parasetamol
B = pembanding kofein
Unknown = sampel tablet
8 cm
5. Hitung Rf masing-masing 5,5 cm
bercak baik untuk pembanding
maupun sampel
Obat apakah yang terdeteksi 2,6 cm
dalam sampel tablet yang
dianalisis dengan KLT di
A B unknown
samping? 77
78
O OH
Fluorene Fluorenone Fluorenol
a) Mana senyawa yang kurang polar?
b) Mana senyawa yang paling polar?
c) Bagaimana urutan pemisahan ketiga senyawa pada plat

KLT (Silica gel) dengan fase gerak diklormetan (CH2Cl2 )
dimana sifatnya tidak terlalu polar? 79
Plat KLT silica gel Ac As C I
yang telah Aspirin spot
Caffeine spot
Ditotoli sampel
Aceaminophen spot
Ibuprofen spot
pencil mark 1 cm
depth of mobile phase from bottom
Prediksi urutan elusi
Komponen tersebut
OH
CO2H O CH3
O CH3 H3C N
N
HN O
O N
O N
Aspirin CH3 CH3
CO2H
Acetaminophen Caffeine
Ibuprofen
80
Berikut adalah beberapa contoh aplikasi
KLT-Densitometri dalam analisis
81
82
Densitogram sampel dan
pembanding
83
Densitogram pada penentuan kurva baku. Pada lempeng
ditotolkan pembanding dengan kadar yang berbeda.
Semakin ke kenan, kadar semakin besar. Anda lihat, tinggi
puncak semakin ke kanan semakin tinggi, kalo kita hitung
luas puncaknya juga semakin ke kanan semakin besar
84
Dari densitogram pada slide sebelumnya, kita buat
kurva hubungan antara kadar baku di sumbu x dan
luas puncak di sumbu y. Nanti akan diperoleh
persamaan garis lurus y = bx + a. Persamaan tersebut
kita gunakan untuk menghitung kadar analit dalam
sampel yang kita analisis
85
VALIDASI METODE ANALISIS METOPROLOL
DALAM URIN MANUSIA SECARA IN VITRO
MENGGUNAKAN KLT-DENSITOMETRI
DENILLA ESTIKA, PRI ISWATI UTAMI, 2017
86
87
Pada TLC scanner kita dapat menentukan panjang
gelombang yang akan digunakan dalam pengukuran.
Sebagai contoh di atas, ada dua senyawa yaitu
Bisoprolol Fumarat (BF) dan Hidroklortiazid (HCT).
Dari spektrum keduanya kita pilih panjang gelombang
di mana kedua punya absorbansi
88
Deteksi secara densitometri pada 225 nm Nilai Rf
bisoprolol fumarate : 0.62 dan hydrochlorothiazide : 0.40,
89
90
91
92
93
94
Link Video
• https://www.youtube.com/watch?v=qdmK
GskCyh8
95
HPTLC
• https://www.youtube.com/watch?v=KO16n
dWHcpk
• https://www.youtube.com/watch?v=dNueD
Q0Fn9U
96
HPTLC
1
HPTLC
• HPTLC kepanjangan dari High Performance
Thin Layer Chromatography atau kalau dalam
Bahasa Indonesia kita sebut Kromatografi
Lapis Tipis Kinerja Tinggi (KLTKT).
2
• KLTKT atau HPTLC dimaksudkan untuk
menghasilkan pemisahan dan hasil
analisis yang baik dibanding dengan KLT
biasa.
• Kelebihan KLTKT dibanding KLT adalah
terletak pada fase diamnya.
• Pada KLTKT digunakan fase diam
berukuran halus dan pori-porinya
seragam serta mempunyai ketebalan
lapisan 0,1 mm. 3
• Ukuran partikel fase diam yang lebih kecil ini
akan menyebabkan semakin besarnya jumlah
lempeng teoritis (N) yang akan menyebabkan
pemisahan menjadi lebih efisien.
• Kita akan bahas Jumlah Lempeng Teoritis (N)
atau Number of Theoretical Plate pada
pembahasan kromatografi kolom.
• Nilai N ini merupakan salah satu karakteristik
kromatografi yang paling penting. Semakin
besar nilai N, artinya efisiensi semakin baik.
4
Lempeng KLTKT (HPTLC Plates)
• Lempeng KLTKT menawarkan kecepatan dan
sensitivitas lebih tinggi dibandingkan KLT klasik
dan menyediakan pemisahan yang lebih baik
• Dengan menggunakan peralatan instrumen,
lempeng KLTKT dapat memberikan kinerja
analisis yang sebanding dengan kinerja
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High
Performance Liquid Chromatography (HPLC)
5
LempengHPTLC
KLTKTPlate
(HPTLC Plates)
• Lempeng KLTKT memiliki ukuran partikel yang lebih
kecil (<10 μm), lapisan yang lebih tipis (<150 μm) dan
plat yang lebih kecil ( jarak pengembangan <10 cm).
• Memiliki distribusi ukuran partikel adsorben lebih
sempit dibandingkan plat KLT.
• Lempeng KLTKT menyediakan kekuatan pemisahan
yang lebih per satuan jarak, pengembangan yang lebih
cepat, dan konsumsi solven yang lebih sedikit.
• Namun, difusi sampel dalam arah migrasi harus dijaga
minimum untuk mencegah pelebaran pita dan volume
sampel dijaga maksimum 1 μL.
6
Perbandingan Lempeng KLT dan
TLCKLTKT
- HPTLC
Lempeng KLT Silica Gel Lempeng KLKT
 Ketebalan lempeng 200-  Ketebalan lempeng 100
250 mm µm
 Diameter pori (dp) ~20  Diameter pori (dp) ~20
mm mm
 Jumlah lempeng teoritis  Jumlah Lempeng Teoritis
(N) ~2000 (N) ~4000
 Waktu pengembangan  Waktu pengembangan
25-30 menit pada pelat 12 menit pada pelat 3 cm
1cm
Perbedaan utama KLTKT dan KLT adalah pada Ukuran Partikel
7
dan Pori dari Adsorben
Lempeng KLKT
• Lempeng KLTKT dapat digunakan untuk analisis
kuantitatif dari sampel kompleks
• Lempeng KLKT dapat digunakan untuk KLT yang
dikerjakan secara manual maupun otomatis.
• Lempeng silika HPTLC bekerja tiga kali lebih cepat
daripada lempeng KLT konvensional – dan jauh
lebih sensitif.
• Ini membuat Lempeng KLTKT sempurna untuk
pemisahan lanjutan.
8
KLTKT
• Pemisahan HPTLC dan HPLC menunjukkan
hasil pemisahan yang sama, jika kedua teknik
digunakan di bawah kondisi kromatografi yang
serupa.
9
Di samping ini kita
dapat melihat
perbandingan KLT dan
KLTKT
10
Rentang volume yang
dapat diaplikasikan
atau ditotolkan pada
KLT 1 – 10 µL
sementara pada
KLTKT 0,1 – 500 µL
11
KLT konvensional
tidak dapat
dikoneksikan dengan
komputer/PC,
sedangkan KLTKT
dapat dikoneksikan
dengan komputer/PC
12
Pada KLT, aplikasi
sampel menggunakan
pipa kapiler atau
micropipet, pada
KLTKT menggunakan
syringe
13
KLT jika sendirian
tidak dapat digunakan
untuk analisis
kuantitatif; KLTKT
dapat digunakan
untuk analisis
kuantitatif.
KLT dapat untuk
analisis kuantitatif
ketika digabungkan
dengan Densitometer
14
Pada KLT biasanya
deteksi dengan sinar
UV pada  254 atau
366 nm, dan sinar
tampak. Pada KLTKT
dapat digunakan 
190 – 800 nm (sinar
monokromatis).
Pilihan panjang
gelombang lebih lebar
15
Pada KLT sendirian
tidak dapat diperoleh
data sektrum dari
analit yang
dipisahkan.
Pada KLTKT dapat
diperoleh spektrum
analit yang
dipisahkan.
Jika KLT digabung
dengan TLC-Scanner
dapat diperoleh
spektrum analit
16
Pada KLT interpretasi
hasil oleh manusia
(analis, sedangkan
pada KLTKT
interpretasi hasil
dilakukan oleh mesin
(dapat diotomatisasi) 17
Tabel di
samping juga
merupakan
perbandingan
KLTKT dan KLT
18
Berikut adalah Peralatan dasar KLKT
dari CAMAG
19
Berikut adalah Skema tahapan
prosedur pengembangan metode KLKT
20
Berikut adalah
Skema tahapan
prosedur
pengembangan
metode KLKT
21
Berikut adalah beberapa contoh
aplikasi KLKT
22
HPTLC fingerprint of Ginseng and
American ginseng
23
Rb2 tidak terdeteksi
pada American ginseng
F11 tidak terdeteksi

pada Akar Ginseng
Hasil HPTLC dapat digunakan untuk membedakan apakah suatu

sampel itu Akar ginseng atau American Ginseng. Silahkan anda
perhatikan perbedaan puncak-puncak yang dihasilkan dari
kedua jenis ginseng tersebut.
24
Aplikasi HPTLC untuk pemisahan
phyllanthin (1) dan hypophyllanthin (2) dalam ekstrak
beberapa spesies Phyllanthus
Ini adalah puncak-puncak pada pembanding yang

digunakan 25
phyllanthin (1) hypophyllanthin (2)
Dari hasil ini maka kita bisa lihat bahwa phyllanthin (1) dan
hypophyllanthin (2) terdeteksi pada Phyllantus amarus, tetapi
tidak terdeteksi pada spesian Phyllantus yang lain
26
HPTLC untuk analisis Kurkuminoid dalam
sampel Curcuma longa (Kunyit) dan Curcuma
amada (Temu mangga)
Curcumin, Demethoxy curcumin, dan bisdemethoxy

curcumin dibedakan dari gugus pada R1 dan R2 (lihat
tanda panah) 27
Sampel yang dipisahkan ada dua yaitu Curcuma longa
(kunyit) dan Curcuma amada (temu mangga) dengan
KLTKT yang deteksinya menggunakan densitometri
Gambar di atas adalah densitogram hasil pemisahan Curcumin

(A), Demethoxy curcumin (B), dan Bisdemethoxy curcumin (C)
dalam larutan standar (St); Sampel Curcuma longa (Cl); dan
sampel Curcuma amada (Ca). Pengamatan pada 366 nm dengan
mode absorbansi/ reflektan. 28
Bisdemethoxy curcumin Demethoxy curcumin
Curcumin
Tampak bahwa dalam Curcuma longa (Cl) dan Curcuma

amada (Cl) memilki perbedaan kadar Curcumin (A),
Demethoxy curcumin (B), dan Bisdemethoxy curcumin
(C). Hal itu ditunjukkan dengan tinggi/ luas puncak
masing-masing yang berbeda pada kedua sampel
tersebut.
29
Aplikasi TLC/HPTLC pada bidang
Biomedis
30
Kromatografi Kolom
1
Pendahuluan
• Di bidang farmasi terutama di laboratorium
kimia organik, misalnya kita mereaksikan
2
Anhidrida Asam
Asam Salisilat
Asetat (Reaktan 2)
(Reaktan 1)
Produk Reaksi
Produk yang diinginkan : Aspirin (Asam Asetil Salisilat)
3
Pertanyaannya adalah... Apakah
di dalam labu tersebut hanya ada
produk yaitu Aspirin saja tanpa
Produk Reaksi ada zat lain? Apakah kita
Produk yang memperoleh Aspirin murni?
diinginkan : Aspirin
Jawabnya adalah:
(Asam Asetil
Salisilat) Kemungkinan besar Tidak
Produk yang kita hasilkan belum murni, tetapi

masih berupa Campuran yaitu apa:
- Sisa reagen (Asam salisilat dan asam asetat
anhidrid)
- Produk samping yaitu asam asetat
- Produk yang diinginkan yaitu Aspirin
4
• Nah.... di sinilah salah satu contoh peran
kromatografi kolom yang sering dimanfaatkan di
bidang farmasi
• Yaitu untuk Purifikasi atau Pemurnian
• Dalam ilustrasi di atas, kita memurnikan Aspirin
dari zat-zat lain.
• Nah apakah hanya pada kimia organik saja
kromatogafi kolom itu dimanfaatkan. Tentu saja
tidak
• Dalam upaya memperoleh obat dari bahan alam,
kromatografi sering digunakan untuk
memurnikan suatu senyawa aktif dari ekstrak
tanaman misalnya. Sehingga diperoleh zat aktif
yang murni
5
Jadi... Semoga Anda punya gambaran aplikasi
kromatografi kolom yang akan kita bahas
6
• Sebelumnya Anda sudah mempelajari KLT
• Prinsip pemisahan dan tekniknya
• Nah.... Kromatografi kolom itu punya prinsip
yang sama. Jadi sangat mudah memahami
prinsip pemisahan pada kromatografi kolom
ketika Anda sudah mempelajari KLT
7
Pada KLT dan Kromatografi kolom sama:
Secara umum komponen terpisahkan berdasarkan
polaritasnya.
8
Perbedaan
Bedanya hanya arah bergeraknya fase gerak. Pada

KLT, fase gerak merambat naik, pada kromatografi
kolom, fase gerak bergerak turun
9
Perbedaan
Pada KLT anda hanya menotolkan dan memisahkan sedikit

sampel, pada kromatografi kolom, anda memasukkan dan
memisahkan jumlah sampel yang lebih banyak.
10
Mari kita mulai pembahasan
Kromatografi Kolom
11
Kromatografi Kolom
Metode kromatografi dimana :
Fase diam dipacking ke dalam kolom.
Fase gerak yang mengalir dapat berupa cairan atau
gas.
Mekanisme pemisahan solut (baca kembali) : sudah

dibahas di mekanisme fisika kimia yang bertanggung
jawab terhadap pemisahan solut (adsorpsi, partisi,
penukar ion, eksklusi molekul, dan afinitas). Ingat
perbedaan mekanisme ditentukan oleh jenis fase
diam yang digunakan untuk mengisi kolom
12
Kromatografi Kolom
Kromatografi Kolom Konvensional

(tradisional) / terbuka
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi Gas
13
Kromatografi kolom yang akan kita pelajari dalam mata
kuliah ini ada 3 :
1. Kromatografi Kolom Konvensional (tradisional) /
terbuka
2. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High
Performance Liquid Chromatography
3. Kromatografi Gas (Gas Chromatography) / GC
Ilustrasi yang saya berikan dari slide 2-10 adalah lebih mengarah ke
Kromatografi Kolom Konvensional (tradisional) / terbuka.
KCKT dan GC akan Anda pelajari lebih detail setelah kita bahas kolom
konvensional
14
Ini adalah foto alat KCKT.
Silahkan nanti dilihat di Lab Kimia Analisis, di Lab Biologi
Farmasi, dan di Lab Mikroanalisis Lab Terpadu
Pada KCKT, kolom sangat kecil, ada

yang panjangnya 10, 25, atau 30 Kolom pada
cm, dll. Di dalam kolom tersebut KCKT
berisi fase diam 15
Ini adalah salah satu contoh Kromatografi Gas
Silahkan nanti dilihat di Lab Mikroanalisis Lab Terpadu
Pada GC, kolom biasanya dibuat

melingkar spt gambar di samping,
karena panjang kolom bisa
Kolom pada GC
beberapa meter. Di dalam kolom
tersebut berisi fase diam 16
Ini adalah Kolom konvensional
(Kolom Terbuka)
Ukuran kolom
terbuka ini juga
bervariasi, nanti
slide bawah ada
contoh gambar
ukuran-ukuran
kolom, dari yang
panjang beberapa
cm hingga yang
panjangnya 2
meter
17
Kolom konvensional (tradisional)
(kolom terbuka
Fase diam dipacking (diisikan)

di dalam tabung gelas yang
dilengkapi kran, dan fase
gerak mengalir di bawah
pengaruh gaya gravitasi
Fase diam
Kran
18
Kromatografi Kolom
19
Gambar berikut menunjukkan perubahan yang terjadi sejalan
dengan perubahan waktu yang menunjukkan pemisahkan dua
band/ pita solut yang berbeda
Ini adalah pada

saat sampel baru
dimasukkan ke
ujung kolom.
Anda dapat
melihat zat-zat
yang ada di
dalam sampel
masih berupa
campuran
20
Ketika kita sudah

mulai
mengalirkan fase
gerak, zat-zat
tersebut akan
bergerak
bersama fase
gerak, namun
anda lihat zat-zat
tersebut
bergerak dengan
kecepatan yang
tidak sama
21
Agak lebih
kelihatan bahwa
dua zat tersebut
bergerak dengan
kecepatan yang
tidak sama
22
Pada saat ini kita

sudah dapat
melihat dengan
lebih jelas bahwa
kedua zat
terpisah
23
Pada tahap ini kita

bisa memperoleh zat
pertama yang
terpisah dari zat
kedua. Kemudian
setelah zat pertama
keluar semua dan
kita tampung, kita
dapat memperoleh
zat kedua
belakangan dan kita
tampung dalam
wadah yang
berbeda 24
Gambaran lain tentang progress pemisahan pada kolom
kromatografi yang menunjukkan pemisahan dua band/pita
solut
Penjelasalannya sama seperti di slide 20-24.

Hanya saja dibuat menyamping
25
solut
Ini adalah pada saat sampel

baru dimasukkan ke ujung
kolom. Anda dapat melihat
zat-zat yang ada di dalam
sampel masih berupa
campuran
26
solut
Ini adalah pada saat sampel baru

dimasukkan ke ujung kolom.
Anda dapat melihat zat-zat yang
ada di dalam sampel masih
berupa campuran
27
solut
Pada saat ini kita sudah dapat

melihat dengan lebih jelas bahwa
kedua zat terpisah
28
solut
Pada tahap ini kita bisa memperoleh zat pertama

yang terpisah dari zat kedua. Kemudian setelah
zat pertama keluar semua dan kita tampung, kita
dapat memperoleh zat kedua belakangan dan kita
tampung dalam wadah yang berbeda 29
Jika kedua gambaran progress disandingkan
30
Kromatografi Kolom
(Terbuka/ tradisional)
• Kromatografi kolom adalah tehnik yang sangat
penting untuk pemurnian produk sintesis atau
natural product. (sebagaimana sudah saya
paparkan di slide-slide awal)
• Komponen dipisahkan dengan kromatografi kolom
melalui mekanisme yang sama seperti pada KLT;
• Melalui perbedaan gaya intermolekuler komponen
campuran dengan fase gerak, dan antara
komponen dengan fase diam
31
Kromatografi Kolom Kolom berisi silika (ingat: silika
bersifat polar)
Ada dua
zat/komponen
dalam sampel
yang
dipisahkan (a)
dan (b)
(a)
Dimisalkan
dalam
diagram ini
(b) lebih polar (b)
dari (a)
Komponen polar (b) teradsorpsi lebih kuat pada fase diam polar
(misal: silika) dan terelusi belakangan setelah komponen yang
kurang polar (a) yang bergerak lebih cepat dengan solven yang
32
non polar (relatif terhadap silika)
Adsorben
Bermacam-macam adsorben dapat digunakan sebagai

fase diam pada kromatografi kolom terbuka.
Contoh adsorben:
 Silica gel
 CaCO3
 Cellulose
 Starch
33
Fase gerak
• Fase gerak / Solvent juga berperan penting dalam
kromatografi kolom.
• Banyak tipe pelarut tersedia, misalnya:
 Sikloheksana
 Benzen
 Kloroform
34
Kolom
• Dimensi kolom penting untuk
menghasilkan pemisahan
kolom yang efektif.
• Rentangnya antara 1:10
sampai 1:100
35
Kolom
Anda dapat melihat di sini
ukuran kolom yang sangat
panjang.
Kolom dengan ukuran yang

lebih kecil.
36
 Secara umum, semakin panjang kolom, maka
pemisahan semakin baik.
 Namun harus diingat juga bahwa semakin
panjang artinya pemisahan membutuhkan
waktu yang lebih lama.
 Oleh karena itu kita bisa memilih kolom yang
pemisahannya baik tetapi tidak terlalu lama
pemisahnnya.
37
Ada beberapa Tipe Kolom:
1. Gravity Columns (kolom gravitasi):
Pada kolom ini, fase gerak bergerak melalui fase
diam (kolom) karena gaya gravitasi.
38
2. Flash Columns (Air/nitrogen pressure):
Pada kolom ini, Fase gerak didorong oleh aliran
udara atau nitrogen menggunakan alat khusus
(Adaptor).
Adaptor untuk
megatur aliran udara
atau nitrogen
Tempat solven/fase gerak
Kolom
39
Rangkaian Flash Columns (Air/nitrogen pressure):
40
Perbedaan Kolom Gravitasi dan Flash Columns
Pada Flash column, ada aliran udara yang digunakan

untuk mendorong fase gerak. 41
3. Low and Medium Pressure Columns (pumped)
 Pergerakan fase gerak dipercepat dengan menggunakan pompa

yang akan menghasilkan tekanan rendah atau medium.
 Kenaikan kecepatan alir akan memperpendek waktu pemisahan.
42
Low and Medium Pressure Columns (pumped)
Pompa berfungsi
untuk mendorong
fase gerak masuk
ke dalam kolom
Fase
diam
Berisi fase gerak
yang akan
dipompakan
masuk ke kolom
Fraksi-fraksi yang
keluar dari kolom
ditampung
4. Vacuum Columns [Vacuum liquid chromatography]
(VLC)]
Adsorben
Adsorben diaplikasikan dalam ke Vakum
keadaan kering ke dalam
sintered glass funnel.
Sampel diaplikasikan dengan
metode kering atau sebagai
larutan.
Kemudian, fase gerak
ditambahkan porsi demi porsi
dan vakum diaplikasikan
Fraksi dikumpulkan, setiap
setelah tiap porsi untuk
pemberian porsi fase gerak,
mengumpulkan fraksi.
wadah diganti
Vacuum Columns
[Vacuum liquid chromatography] (VLC)]
Fase diam
45
5. High pressure Columns (HPLC):
 Pada kolom ini digunakan adsorben yang

sangat halus sehingga akan meningkatkan
daya pisah.
 Kecepatan alir fase gerak sangat diturunkan.
 Pompa bertekanan tinggi digunakan untuk
mendorong solven melewati kolom yang
terbuat dari stainless steel.
46
High pressure Columns (HPLC):
Pompa bertekanan tinggi
Anda akan mempelajari lagi alat ini di Kolom pada

topik KCKT/HPLC HPLC
47
Pada slide selanjutnya yang akan kita
bahas adalah tahapan prosedur ketika
kita melakukan pemisahan dengan
kromatografi kolom terbuka/
konvensional
48
1. Persiapan Kolom
Adsorben atau fase diam diaplikasikan ke dalam kolom
dengan dua cara:
1. Slurry packing (Wet method)

2. Dry Packing
Di video yang anda lihat (link video di onclass), aplikasi

adsorben yang digunakan adalah yang pertama yaitu wet
method
49
Persiapan Kolom
1. Slurry packing (Wet method):
 Adsorben disuspensikan dalam fase gerak dan diaduk
dengan sangat baik untuk menghilangkan semua
gelembung udara.
 Bubur yang dihasilkan kemudian dituangkan ke dalam
kolom.
 Pada ujung kolom, sedikit glass wool atau kapas harus
ditambahkan sebelumn bubur adsorben diaplikasikan.
Pasir dapat ditambahkan setelah aplikasi bubur
adsorben.
 Setelah aplikasi bubur adsorben, kolom dibiarkan
semalam.
 Pada kromatografi gel, adsorben harus direndam
dalam fase gerak semalam agar mengabsorpsi fase
gerak dan mengembang.
50
Persiapan Kolom
2. Dry Packing:
 Adsorben kering dituangkan langsung ke
dalam kolom.
 Dilakukan vibrasi untuk menghilangkan
gelembung udara
 Kemudian fase gerak dilewatkan melalui
adsorben.
 Metode ini tidak dapat digunakan pada
Kromatografi gel (permeasi gel/filtrasi gel).
51
2. Persiapan Fase gerak
 Fase gerak berupa campuran pelarut organik (jarang
digunakan hanya satu pelarut).
 Pilihan fase gerak pada kromatografi kolom didapat dari
optimasi dengan KLT dengan beberapa sistem pelarut.
 Ada yang berpendapat bahwa sistem pelarut yang baik
adalah pelarut yang ketika digunaka pada KLT
menghasilkan nilai Rf kurang dari 0,6 untuk semua bahan
yang akan dipisahkan dengan kromatografi kolom.
 Jika sistem pelarut membawa komponen campuran lebih
jauh dan menghasilkan nilai Rf yang lebih besar, maka
pemisahan pada kromatografi kolom tidak akan terjadi.
 Sistem pelarut yang tidak membawa bercak totolan
sampel pada KLT adalah sistem yang tidak cocok untuk
pemisahan dengan kromatografi kolom.
52
KLT untuk optimasi Kromatografi Kolom
Pada gambar atas,

hasil pemisahan
pada KLT (gambar
kiri)memiliki nilai Rf
pada rentang 0,2 <
Rf < 0,5, ketika
digunakan pada
kromatografi kolom
memberikan
pemisahan yang
lebih baik, tampak
dari dua puncak yang
terpisah
Nilai Rf optimum: 0,2 < Rf < 0,5
53
Gambaran hasil KLT untuk optimasi Kromatografi Kolom
Pada gambar bawah,

hasil pemisahan
pada KLT (gambar
kiri) memiliki nilai Rf
ada yang >0,5, ketika
digunakan pada
kromatografi kolom
memberikan
pemisahan yang
kurang baik, tampak
dari dua puncak
masih ada yang over
laping atau tumpang
tindih
Dua puncak overlaping
menunjukkan dua zat belum
terpisah sempurna
54
3. Aplikasi Sampel
Cara memasukkan sampel ke dalam kolom ada
dua:
1. Wet application
2. Dry loading
Dalam video yang Anda lihat, aplikasi menggunakan cara

pertama (Wet application)
55
3. Aplikasi Sampel
1. Wet application: Larutkan sampel dalam fase
gerak awal dan aplikasikan dengan pipet pada
ujung atas kolom. Metode ini sangat bagus,
tetapi dalam beberapa kasus, sampel yang akan
dipisahkan tidak larut dalam fase gerak awal.
2. Dry loading: Larutkan sampel dalam pelarut

yang volatil (mudah menguap). Larutan sampel
kemudian diadsorpsi pada sejumlah kecil
adsorben dan pelarut dibiarkan menguap.
Adsorben kering yang telah diloading dengan
sampel kemudian diaplikasikan ke dalam kolom.
56
4. Pengembangan atau Elusi
Pengembangan pada Kromatografi kolom bisa

dilakukan dengan dua mode:
• Isocratic elution / Elusi Isokratik
• Gradient elution / Elusi gradien
57
1. Elusi Isokratik:
 Artinya digunakan fase gerak yang sama sejak dari awal hingga
akhir pemisahan. Polaritas fase gerak tidak berubah dari awal
hingga akhir elusi. Misal: CHCl3 : Metanol (70:30)
2. Elusi Gradien:
 Artinya, elusi dilakukan dengan merubah perbandingan
fase gerak yang berakibat apda berubahnya polaritas fase
gerak.
 Polaritas sistem meningkat secara bertahap selama
pemisahan dengan cara meningkatkan proporsi pelarut
yang lebih polar.
 Sebagai contoh: dimulai dengan CHCl3, diikuti dengan
campuran CHCl3/MeOH dengan peningkatan secara
bertahap % MeOH sampai semua komponen terelusi dari
sistem. 58
59
5. Monitoring Kolom
Fraksi-fraksi
5. Monitoring Kolom
• Monitoring kolom maksudnya adalah
menentukan fraksi-fraksi yang diperoleh misalnya
dengan bantuan KLT.
• Nanti fraksi-fraksi yang memberikan bercak yang
sejajar pada KLT kita kumpulkan menjadi satu
(Perhatikan pada Video yang Anda lihat. Ada

tahapan menotolkan fraksi pada lempeng KLT dan
kemudian menggabungkan fraksi-fraksi ke labu alas
bulat sebelum diuapkan agar lebih pekat)
61
Monitoring Kolom
1. Dengan KLT
• Fraksi sejumlah volume tertentu yang dikumpulkan
jika perlu diuapkan untuk memperoleh volume
yang lebih kecil.
• Kemudian masing-masing fraksi ditotolkan pada
KLT.
• Fraksi yang menunjukkan bercak yang mirip pada
KLT akan dikumpulkan bersama untuk pemurnian
atau kristalisasi.
2. Dengan Pengujian hayati/ Bioassay
Fraksi dimonitor dengan pengujian hayati
kemudian dilakukan KLT.
62
Kasus
Adsorben adalah alumina – neutral, polar
Senyawa manakah yang memiliki afinitas lebih

tinggi terhadap adsorben? Mengapa?
Fluorene Fluorenone
63
Faktor yang mempengaruhi pemisahan:
64
Faktor yang mempengaruhi pemisahan pada kromatografi kolom
( Faktor yang mempengaruhi efisiensi kolom)
Faktor Pengaruh
Ukuran partikel
Memperkecil ukuran akan meningkatkan pemisahan
fase diam padatan
(tetapi ukuran partikel yang sangat kecil
(atau pendukung
membutuhkan tekanan yang tinggi)
fase diam)
Efisiensi meningkat sejalan dengan meningkatnya
Dimensi kolom
rasio panjang / lebar
Packing fase diam yang tidak seragam menyebabkan
pergerakan solut yang tidak teratur melewati kolom
Keseragaman
& pembentukan zona yang kurang seragam (dapat
packing
menyebabkab pelebaran pita /band broadning atau
terjadinya tailing).
Peningkatan temperatur kolom akan berpengaruh
Temperatur kolom terhadap kecepatan elusi tetapi tidak meningkatkan
pemisahan (tailing).
65
Solven sebaiknya memiliki viskositas yang
rendah (agar dapat memberikan resolusi yang
Solven pengelusi
efisien) dan volatilitasnya tinggi (untuk
memperoleh recovery solut yang cepat)
Kecepatan alir Kecepatan alir yang rendah dan seragam
solven memberikan resolusi yang lebih baik.
Kontinuitas Kecepatan alir yang tidak kontinyu akan
aliran fase gerak mengganggu resolusi
Kondisi Deaktivasi adsorben akan menurunkan
adsorben pemisahan.
Konsentrasi Senyawa dengan konsentrasi yang tinggi akan
solut bergerak lebih lambat.
66
Faktor fase diam:
1. Ukuran partikel :
2. Aktivitas Adsorben
3. Paking kolom yang tidak seragam
4. Konsentrasi campuran
67
Faktor karena fase gerak
1. Pemilihan fase gerak yang tepat
2. Kecepatan alir fase gerak
3. Konsistensi kecepatan alir
68
Faktor Kolom
1. Dimensi Kolom
2. Temperatur kolom
69
INGAT…
• Jika fase diam bersifat POLAR
• Molekul yang lebih polar akan berinteraksi lebih kuat
dengan fase diam.
• Molekul yang lebih polar akan bergerak lebih lambat
melewati kolom.
• Molekul non-polar bergerak lebih cepat.
70
Reverse Phase column
chromatography
• Fase diam (column packing) bersifat NON-POLAR
• Molekul Non-polar akan bergerak lebih lambat
sebab terikat lebih kuat pada column packing/
fase diam.
• Molekul yang lebih polar akan bergerak lebih
cepat melewati kolom..
• Fase gerak/solvent polar, seperti air dan metanol
digunakan dalam RP chromatography
• Banyak digunakan, misalnya pada HPLC
71
Reverse phase chromatography
Silica is alkylated with long chain hydrocarbon groups, using 18
carbons long. This is usually referred to as C-18 silica.
CH3
CH2
CH3 17 CH3
Si
CH2 SiCH3)3 CH3
17 CH3 SiCH3)3
O
SiCH3)3
Si O
CH3 O
O
O Si
Si O
Si O
Si O O
Si O O
O O
O O
O Si
Si O
Si O
Si O O
Si O O
O O
O O
O
Si
Si O
O
O O
O
72
Aplikasi Kromatografi Kolom
1. Pemisahan
2. Purifikasi / Pemurnian
3. Isolasi komponen aktif / active constituents
4. Klinis
73
74
Terima Kasih
75
Parameter dalam Kromatografi
Kolom
1
• Dalam topik ini, kita akan mempelajari
beberapa istilah dan parameter yang penting
dan akan kita jumpai dalam pekerjaan kita
menggunakan kromatografi.
2
Parameter-parameter yang akan kita
pelajari adalah sebagai berikut:
1. Resolusi (R atau Rs)

2. Capacity Factor/ Faktor Kapasitas (k’)
3. Column Selectivity/ Selektivitas Kolom (α)
4. Column Efficiency/ Efisiensi Kolom
3
• Sebelum kita bahas parameter-parameter
tersebut, kita kembali dulu ke definisi
kromatografi yang pernah kita bahas.
• Dalam pengertian kromatografi ada kita
temukan istilah “migrasi diferensial”
• Nah kita bahas lagi apa itu migrasi diferensial
dalam kromatografi kolom
4
Migrasi Diferensial
 Komponen-komponen (zat-zat) yang
berbeda bergerak melalui sistem dengan
kecepatan pergerakan yang berbeda yang
disebut “migrasi diferensial".
 Kecepatan beberapa komponen dalam
campuran ditentukan oleh jumlah molekul
komponen tersebut dalam fase gerak.
5
Misalnya kita memiliki campuran komponen atau zat “A” dan “B”:
A. Zat A memiliki afinitas yang lebih besar terhadap fase gerak,

sehingga banyak molekul berada dalam fase gerak.
B. Zat B memiliki afinitas yang lebih besar terhadap fase diam,

sehingga sedikit molekul yang berada dalam fase gerak
Stationary Phase B
Bs
As
A B A
Bm
Mobile Phase Am
6
Stationary Phase Bs B
As
A B A
Bm
Mobile Phase Am
7
Tanda panah yang lebih
pendek ke arah fase diam
sebagai simbol bahwa zat
A lebih sedikit pada fase
diam
Stationary Phase B
Bs
As
A B A
Bm
Mobile Phase Am
Tanda panah yang lebih panjang ke arah

fase gerak sebagai simbol bahwa zat A
8
lebih banyak pada fase gerak
Tanda panah yang lebih
panjang ke arah fase diam
sebagai simbol bahwa zat B
lebih banyak pada fase diam
Stationary Phase B
Bs
As
A B A
Bm
Mobile Phase Am
Tanda panah yang lebih pendek ke arah fase gerak

sebagai simbol bahwa zat B lebih sedikit pada fase
9
gerak
Zat B lebih banyak berada pada fase diam dibanding
zat A, maka anda lihat di kolom, zat B bergerak lebih
lambat melewati kolom dibanding zat A
Stationary Phase B
Bs
As
A B A
Bm
Mobile Phase Am
Jadi antara zat A dan B, yang lebih banyak berada pada

fase gerak adalah zat A, maka Anda lihat di kolom, zat A
akan bergerak lebih cepat dibanding zat B 10
• Nah kemudian, kita akan jelaskan tentang
migrasi diferensial atau perbedaan kecepatan
komponen-komponen melewati kolom
dengan gambaran matematis di slide berikut
ini:
11
Gambaran matematis dari migrasi diferensial:
Kita simbolkan sebagai berikut:

• U: kecepatan solven (fase gerak).
• Ux: kecepatan komponen X.
• R: fraksi komponen X dalam fase gerak
• Maka persamaannya adalah sebagai berikut:
Ux = UR
12
Ux = UR
Dari persamaan di atas:
• Jika nilai R = 1,0 yang artinya fraksi komponen X dalam fase gerak
= 1 atau dengan kata lain semua molekul komponen berada
dalam fase gerak (dan tidak ada yang berada pada fase diam)
Maka ketika kita masukkan ke persamaan menjadi:
Ux = U x 1,0
Ux = U
Karena Ux = U, maka dapat dikatakan bahwa k.
Karena Ux = U, Maka, komponen X akan bergerak dengan

kecepatan sama dengan kecepatan fase gerak. Atau dengan
kata lain komponen atau zat tersebut akan sangat cepat keluar
dari kolom
Ingat : U: kecepatan solven (fase gerak) dan Ux: kecepatan komponen X. 13
Sekarang kita lihat pada kondisi yang sebaliknya:
• Jika R = 0,0 artinya fraksi komponen X dalam fase gerak = 0 atau
tidak ada molekul komponen yang berada pada fase gerak dan
semua molekul komponen berada dalam fase diam.
Maka ketika kita masukkan ke persamaan menjadi:
Ux = U x 0,0
Ux = 0,0
Karena Ux = 0, maka artinya komponen X tidak akan bergerak
sama sekali. Pada kondisi ini, komponen X tidak akan keluar
dari kolom.
14
 Dari penjelasan pada slide tersebut di atas,
maka nilai R suatu komponen tidak boleh
nol (0) tetapi juga tidak boleh satu (1).
 Komponen-komponen yang akan dipisahkan
melalui sistem (kolom) harus terdistribusi
diantara fase gerak dan fase diam.
15
• Selanjutnya kita akan mulai membahas
tentang parameter-parameter yang penting
dalam kromatografi, khususnya kromatografi
kolom yang modern (kromatografi cair kinerja
tinggi dan kromatografi gas)
16
Ini adalah
penggambaran
kolom dari awal
aplikasi sampel
dan mulai elusi,
hingga akhir yaitu
semua komponen
keluar dari kolom
17
Ini adalah
penggambaran
elusi kromatografi
kolom dalam
bentuk gambar
yang dihasilkan
oleh detektor yang
disebut
kromatogram yaitu
suatu kurva
hubungan antara
waktu (sumbu x)
dan sinyal detektor
(sumbu y)
18
Ini adalah
penggambaran
dimulainya elusi
(t = 0), pada
kromatogram
tampak sebagai
garis lurus. Hal
tersebu
menunjukkan
bahwa belum ada
komponen yang
keluar dari kolom
19
Ini adalah puncak
yang
menggambarkan
ketika zat A keluar
dari kolom dan
terdeteksi atau
terbaca oleh
detektor. Di sini
digambarkan
sebagai puncak
20
Ini adalah puncak
yang
menggambarkan
ketika zat B keluar
dari kolom dan
terdeteksi atau
terbaca oleh
detektor. Di sini
digambarkan
sebagai puncak
21
• Jadi pada kromatogram, ketika garisnya
berupa garis mendatar yang lurus, itu
menunjukkan pada waktu-waktu tersebut
tidak ada komponen yang keluar dari kolom
dan terbaca oleh detektor
• Sedangkan ketika pada waktu tertentu pada
kromatogram ada muncul puncak, maka
puncak tersebut menunjukkan bahwa pada
saat itu ada komponen yang keluar dari kolom
dan terbaca oleh detektor
22
• Detektor di sini nanti dapat bermacam-
macam, dan kalo kita kembali ke KLT, deteksi
di KLT itu kita lakukan misalnya dengan
mengamati bercak di bawah sinar UV.
• Jadi tanpa detektor, kita tidak dapat
mengetahui ada tidaknya dan kapan suatu
komponen keluar dari kolom.
23
• Selanjutnya kita akan membahas definisi
beberapa parameter yang kita jumpai dalam
suatu kromatogram
24
Sebelum kita bahas parameter, kita
lihat dulu skema sederhana HPLC
Ketika komponen
sampai ke detektor,
akan ditampilkan
dalam kromatogram
Di dalam kolom, komponen
berjalan dari awal kolom menuju
25
ujung kolom
Inilah tampilan
kromatogram,
yang dapat kita
lihat pada layar
komputer yang
biasanya
terpasang pada
alat KCKT.
Sumbu x pada kromatogram adalah waktu, sumbu y

adalah respon detektor.
Anda akan mempelajari masing-masing komponen
KCKT pada topik KCKT setelah UTS
26
Beberapa Istilah yang sering dijumpai
dalam Kromatografi
• Kromatogram (Chromatogram)
Adalah suatu plot hubungan antara sinyal detektor dengan waktu
elusi atau volume elusi.
• Waktu Retensi (Retention time)
Adalah waktu yang dibutuhkan suatu solut (zat/komponen) untuk
bergerak dari awal injeksi sampai keluar dari kolom ke detektor
(tr).
• Volume Retensi (Retention volume)
Adalah volume fase gerak yang dibutuhkan untuk menggerakkan
atau membawa solut dari awal injeksi sampai keluar dari kolom ke
detektor (Vr).
27
• Lebar alas puncak (Baseline width)
Adalah lebar puncak suatu solut yang diukur pada garis dasar atau
baseline (w).
• Void time (tm) atau void volume
Adalah waktu atau volume fase ferak yang dibutuhkan untuk
mengelusi komponen atau sampel yang tidak ditahan sama sekali
oleh fase diam (nonretained components)
28
• Pada slide berikut kita akan lihat masing-masing
parameter tersebut di kromatogram.
29
Gambar ini ada contoh penggambaran kromatogram
Sinyal detektor.
Detektor akan membaca
atau mendeteksi cairan atau
gas yang keluar dari kolom
dan sampe ke detektor. Jika
tidak ada komponen, maka
detektor aken menampilkan
garis dasar atau baseline,
dan ketika ada komponen
yang terdeteksi, akan
ditampilkan dengan garis
yang menaik dan akan
Baseline (garis dasar) membentuk puncak.
Puncak 30
Ini adalah awal dimulainya

injeksi (0 menit), sampel masuk
mulai ke dalam kolom untuk
berinteraksi dengan fase diam
dan terjadi pemisahan
31
Waktu retensi
(tr)
Adalah waktu yang
dibutuhkan suatu solut
(zat/komponen) untuk
bergerak dari awal
injeksi sampai keluar
dari kolom ke detektor
(tr).
32
Void time (tm)

Adalah waktu atau
volume fase ferak yang
dibutuhkan untuk
mengelusi komponen
atau sampel yang tidak
ditahan sama sekali
oleh fase diam
(nonretained
components)
33
Lebar alas puncak

(Baseline width)
Adalah lebar puncak
suatu solut yang diukur
pada garis dasar atau
baseline (w).
34
Peak Height (H atau h)

atau Tinggi Puncak
Adalah tinggi puncak
dihitung dari baseline
atau garis dasar ke
puncak 35
Setengah tinggi puncak (50%h)
50% tinggi puncak atau
0,5h artinya jarak yang
diukur dari baseline
atau garis dasar sampai
setengah (50%) tinggi
puncak
36
10% tinggi puncak (0,01h)
10% tinggi puncak atau
0,01h artinya jarak
yang diukur dari
baseline atau garis
dasar sampai 10% dari
tinggi puncak
37
Lebar setengah tinggi puncak (W0,5)
dan Lebar 10% tinggi puncak (W0,01)
W0,5= itu artinya lebar
puncak pada setengah
(50%) tinggi puncak
W0,01= itu artinya

lebar puncak pada 10%
tinggi puncak
38
Lebar pada 10% tinggi puncak
Ketika puncak dibagi
dua dengan garis dari
ujung atas puncak,
maka ada setengah
bagian dari lebar pada
10% tinggi puncak
dinotasikan A dan B
39
Luas Puncak atau Peak Area
Perhatikan pada puncak
yang diblok hijau.
Suatu puncak selain
punya data tinggi
puncak, juga memiliki
luas puncak (peak
area)
Ini nanti penting untuk
kita gunakan dalam
penentuan kadar suatu
zat yang dipisahkan
40
Berikut adalah contoh kromatogram
Retention time
detector’s signal (tr)
Detector A (234nm)
5.300
metoprolol
0.010 baku 001a 0.010
Retention Time
11.058
Volts
Volts
0.005 0.005
3.142
2.758
2.867
3.917
0.000 0.000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Minutes
elution time
Base line
Baseline width (w)
41
2
Detector A (234nm) 1
5.300
metoprolol
0.010 baku 001a
Retention Time
3 0.010
11.058
Volts
Volts
0.005 0.005
3.142
2.758
2.867
3.917
0.000 0.000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Minutes
Pada kromatogram di atas, kita lihat ada 3 puncak :

Puncak 1
Puncak 2
Puncak 3
Masing-masing puncak punya waktu retenti (tr) yang
berbeda-beda, yaitu
tr 1 = 3,917 menit
tr 2 = 5,310 menit 42
tr3 = 11,068 menit

Detector A (234nm)
5.300
metoprolol
0.010 baku 001a 0.010
Retention Time
11.058
Volts
Volts
0.005 0.005
3.142
2.758
2.867
3.917
0.000 0.000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Minutes
 Puncak 1 dengan tr 1 = 3,917 menit, artinya komponen atau zat

no 1 ini membutuhkan waktu 3,917 menit sejak mulai injeksi di
ujung kolom hingga keluar dari kolom sampai ke detektor.
 Puncak 2 dengan tr 2 = 5,310 menit, artinya komponen atau zat
 Puncak 3 dengan tr3 = 11,068 menit artinya komponen atau zat
43
 Jadi ketiga zat tersebut memiliki waktu retensi yang
berbeda-beda yang menunjukkan zat-zat tersebut
bergerak dengan kecepatan yang berbeda melewati
kolom.
 Parameter waktu retensi ini penting untuk Anda pahami,
karena nanti akan banyak digunakan, terutama dalam
identifikasi zat yang sudah dipisahkan.
44
1 2
Detector A (234nm)
5.300
metoprolol
0.010 0.010
baku 001a
Retention Time 3
11.058
Volts
Volts
0.005 0.005
3.142
2.758
2.867
3.917
0.000 0.000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Minutes
 Anda juga dapat lihat bahwa puncak 1,2, dan

3 punya tinggi yang berbeda, demikian juga
luas puncak (peak areanya).
 Jadi dari suatu puncak kita bisa memperoleh
data waktu retensi yang khas untuk tiap zat
dan luas puncak/tinggi puncak yang berbeda
antara satu dengan yang lain 45
 Nanti akan Anda pelajarai lebih jauh di topik

KCKT dan GC
Sekarang kita lanjutkan untuk
membahas 4 parameter ini:
2. Capacity Factor/ Faktor Kapasitas (k’)
3. Column Selectivity/ Selektivitas Kolom (α)
46
• Resolusi : adalah ukuran kuantitatif yang
menunjukkan derajat atau tingkat
keterpisahan kromatografi yang berdekatan.
• Untuk menghitung nilai Resolusi, ada
beberapa persamaan, di sini saya tampilkan
salah satunya yaitu:
47
Anda lihat pada gambar
di samping, ketika nilai R
semakin besar, kedua
puncak semakin terpisah.
Dua puncak dengan R =
1,50 lebih terpisah
dibandingkan dua puncak
dengan R = 0,75
 Derajat keterpisahan dua puncak pada kromatogram

meningkat sejalan dengan meningkatnya nilai R atau
Rs.
 Untuk dua puncak/peak yang ukurannya sebanding/
equal, Resolusi sebesar 1,5 berkaitan dengan overlap/
tumpang tindih area sebesar hanya 0,13%
48
• Jadi, dalam hal parameter Resolusi, kita
menghendaki nilai R yang besar, karena
semakin besar R, artinya dua puncak yang
berdekatan akan semakin terpisah sempurna.
• Kenapa terpisah sempurna ini penting, agar
nanti pada identifikasi dan penetapan kadar
tidak saling mengganggu
49
Latihan
Hasil analisis kromatografi minyak lemon menunjukkan
bahwa puncak limonen memiliki waktu retensi 8,36
menit dengan lebar alas puncak 0,96 menit. -
Terpinene terelusi pada 9,54 menit, dengan lebar alas
puncak 0,64 menit. Berapakah resolusi kedua puncak
tersebut?
2 tr
R=
WA + WB
2 (9,54 – 8,36)
R= = 1,475
0,96 + 0,64
50
Latihan
Manakah kromatogram yang menunjukkan hasil pemisahan

dengan resolusi terbaik?
51
Meningkatkan Resolusi
• Resolusi dapat ditingkatkan melalui peningkatan tr
atau dengan menurunkan lebar alas puncak (wA atau
wB)
• Kita dapat meningkatkan tr dengan meningkatkan
interaksi solut dengan kolom dengan meningkatkan
column’s selectivity terhadap salah satu solut.
• Lebar puncak adalah efek kinetik yang berkaitan
dengan pergerakan solut di dalam dan di antara fase
gerak dan fase diam. Efek ini ditentukan oleh beberapa
faktor yang secara kolektif disebut column efficiency.
52
Meningkatkan resolusi
Dua metode untuk meningkatkan resolusi dua puncak pada

kromatogram :
a) Pemisahan awal yang menunjukkan solut yang tidak
terpisah dengan baik;
b) Peningkatan resolusi kedua solut yang disebabkan oleh
peningkatan column efficiency;
c) Peningkatan resolusi kedua solut yang disebabkan oleh
perubahan column selectivity. 53
2. Capacity Factor/ Faktor Kapasitas
(k’)
• Distribusi solut, S, diantara fase gerak dan fase
diam dapat digambarkan dengan suatu reaksi
kesetimbangan:
dan berkaitan dengan koefisien partisi, KD,

dan Rasio Distribusi, D,
54
Capacity factor (k’) : adalah ukuran seberapa
kuat suatu solut atau komponen ditahan oleh
fase diam
Faktor kapasitas suatu solut dapat ditentukan dari

kromatogram dengan mengukur column’s void time (tm
atau kadang ditulis t0), dan waktu retensi (tr) dari solut.
Keterangan:
Vm adalah volume fase gerak
Vs adalah volume fase diam
tr’ adalah adjusted retentio time 55
• Faktor yang mengatur distribusi beberapa komponen diantara
dua dua fase yang berkompetisi disebut “Distribution
coefficient” atau “Capacity factor” atau “Mass distribution
ratio” k’
(n)s
k’ =
(n)m
(n)s : jumlah mol komponen dalam fase diam

(n)m : total jumlah mol komponen dalam fase gerak
56
Untuk menghitung faktor kapasitas, kita dapat
menggunakan persamaan ini:
tr – tm
k’ =
tm
tr : waktu yang dibutuhkan oleh solut melalui
kolom (retention time/waktu retensi).
tm : waktu yang dibutuhkan oleh molekul solven
melalui kolom.
Makna dari nilai faktor kapasitas suatu solut:
• Nilai k’ yang lebih besar artinya solut tersebut
tertahan lebih lama pada kolom (bergerak lebih
lambat).
• Nilai k’ yang lebih kecil artinya solut tersebut
bergerak lebih cepat. 57
Latihan
• Pada hasil analisis secara kromatografi suatu
asam berbobot molekul rendah, asam butirat
terelusi dengan waktu retensi 7,63 menit. Void
time dari kolom adalah 0,31 menit. Hitunglah
faktor kapasitas dari asam butirat tersebut!
tr - tm
k’ =
tm
7,63 – 0,31
k’ = = 23,61
0,31
58
3. Column Selectivity/ Selektivitas
Kolom (α)
 Selectivity factor / faktor selektivitas (α)
Adalah rasio atau perbandingan faktor
kapasitas deua solut atau komponen
 Persamaan yang dapt digunakan untuk

menghitung nilai α adalah:.
59
Latihan
• Pada hasil analisis secara kromatografi suatu asam
berbobot molekul rendah, asam butirat terelusi
dengan waktu retensi 7,63 menit. Waktu retensi
asam isobutirat adala 5,98 menit. Void time dari
kolom adalah 0,31 menit. Berapakah faktor
selektivitas untuk asam isobutirat dan asam butirat?
trB - tm
α=
trA - tm
7,63 – 0,31
α= = 1,29
5,98 – 0,31
60
• Pelebaran puncak (band broadening)
Adalah peningkatan lebar alas puncak.
• Lempeng teoritis (Theoretical plate)
Adalah ukuran kuantitatif yang menunjukkan
evaluasi efisiensi kolom yang digambarkan bahwa
kolom terdiri atas zona-zone kecil atau lempeng
(plate) di mana pada lempeng tersebut terjadi partisi
solut diantara fase diam dan fase gerak.
61
• Jumlah lempeng teoritis dapat dihitung dengan
persamaan berikut:
 Efisiensi kolom meningkat sejalan dengan meningkatnya

jumlah lempeng teoritis (theoretical plates) atau
menurunnya tinggi lempeng teoritis
 Semakin besar nilai N, artinya semakin baik efisiensi
kolomnya
62
Pentingnya meningkatkan selectivity
dalam pemisahan dua solut
• Peningkatan selectivity dalam pemisahan
campuran solut yang kompleks adalah tujuan
utama dalam kromatografi, karena jika
selectivity dua solut (puncak) nilainya 1,
sesempit apapun atau secepat apapun
pemisahan terjadi, maka kita tidak akan dapat
memisahkan kedua solut tersebut kecuali kita
meningkatkan selectivity
63
Bagaimana merubah selecitivity?
• Selectivity utamanya tergantung pada sifat analit dan
interaksinya dengan permukaan fase diam.
• Jika perubahan selectivity yang besar diharapkan
terjadi dalam pemisahan tertentu, solusi terbaik adalah
dengan penggantian fase diam.
• Selecitivity umumnya tidak dipengaruhi oleh komposisi
fase gerak atau temperatur kecuali parameter ini
memodifikasi atau merubah sifat analit/solut (solvasi,
ionisasi, tautomerisasi, dll).
• Namun demikian, solven seperti metanol vs asetonitril
kemungkinan dapat mempengaruhi selectivity diantara
pasangan solut yang kritis (misalnya isomer)
64
Pergerakan komponen melalui sistem
kromatografi dalam bentuk “zones” atau
“bands”:
• Diasumsikan bahwa sistem kromatografi tersusun dari sejumlah
“distribution systems” atau “equilibrations” yang disebut
“Theoretical Plates”. Tiap theoretical plate tersusun dari fase diam
dan fase gerak. Tinggi dari tiap lempeng disebut “Height
equivalent to Theoretical Plate” (HETP).
• Jumlah lempeng teoritis “N” ini sangat penting untuk pemisahan.

Meningkatnya nilai “N” menghasilkan pita yang lebih sempit dan
pemisahan yang lebih baik.
65
Komponen bergerak melalui kolom sebagai pita/bands atau
zone dan kecepatannya diatur oleh k'.
Komponen dengan k' = 1 (64 molecules)
32 16 8 4 2
32 16 8 4 2
16 16 12 8
16 16 12 8
8 12 12
8 12 12
4 8
4 8
2
2
Komponen akan berada di tengah sistem dalam bentuk

pita. Jika kita meningkatkan “N” , komponen akan lebih
sempit. Pita yang lebih sempit akan menghasilkan
pemisahan yang lebih baik. 66
2
2
8
8
12
12
8
8
2
2
N= 5 N= 25 N= 150
A A
A
B B
B
N= 5 N= 25 N= 150
67
L
N =
H
L: Panjang kolom
Keterangan : HETP (Height Equivalent to the Theoretical
Plate)
The degree of
this band-
broadening is
called the
efficiency.
68
Number of Theoretical Plates / Jumlah
Lempeng Teoritis
Penentuan efisiensi (number of the theoretical plates pada

kolom).
69
Penentuan efisiensi (number of the
theoretical plates pada kolom).
w1/2 (kadang ditulis w0,5 atau WH) adalah lebar pada

setengah tinggi puncak
The degree of this band-broadening is

called the efficiency. 70
 The degree of this band-broadening is called
the efficiency.
 Artinya dapat kita katakan semakin besar nilai
N, puncak akan semakin sempit, semakin kecil
nilai N, maka puncak akan semakin lebar.
71
Latihan
• Suatu hasil analisis secara kromatografi dari pestisida
Dieldrin memberikan puncak dengan waktu retensi
8,68 menit dan baseline width 0,29 menit.
Berapakah jumlah lempeng teoritis yang terlibat
dalam pemisahan? Jika kolom yang digunakan dalam
analisis ini adalah 2,0 m, berapakah tinggi lempeng
teoritis? L
tr N=
N = 16 ( )2 H
W L = 2 m = 2000 mm
8,68 2000
N = 16 ( )2 14.333,87 =
H
0,29
N = 14.333,87 plate H =0,14 mm/plate 72
Selectivity & Efficiency
I. Puncak sempit dan kedua
puncak terpisah jauh,
pengurangan panjang
kolom atau kecepatan alir
fase gerak dapat secara
signifikan memperpendek
runtime tanpa kehilangan
kualitas pemisahan
II. Pemsahan dapat
diterima, metode
kemungkinan tidak
rugged.
III. Pemisahan yang masih
dapat diterima,
repsodusibilatas
kuantitatif mungkin
rendah.
IV.Pemisahan yang tidak
73
baik.
Perbandingan antara Vairasi Selectivity dan Efficiency yang
dibutuhkan untuk meningkatkan Resolusi dari 1 menjadi 1,5
Dari tabel di atas kita lihat bahwa dengan naiknya

Efisiensi dari 10.000 menjadi 22.500 maka Resolusi naik
dari 1 menjadi 1,5.
Dengan meningkanya selektivitas dari 1,04 menjadi 1,06
maka Resolusi meningkat dari 1 menjadi 1,5
74
Merubah nilai N
Efficiency (N) dapat ditingkatkan dengan :
1. Meningkatkan panjang kolom (tidak praktis).
2. Menurunkan HETP.
H atau HETP dapat diturunkan :
1. Menurunkan ukuran partikel fase diam.
2. Pemilihan fase gerak yang lebih baik/cocok.
75
• Efficiency utamanya ditentukan oleh parameter
kolom.
• Pada kolom kromatografi gas, efficiency sangat
tergantung kepada kecepatan alir fase gerak.
• Pada HPLC, karena viskositas fase gerak yang jauh
lebih tinggi, rentang kecepatan alir yang dapat
diaplikasikan tidak terlalu lebar, variasi kecepatan
alir tidak secara signifikan mempengaruhi
efficiency kolom.
76
• Sebaliknya, geometri packing material; keseragaman;
dan densitas packing kolom adalah menjadi faktor
utama yang menentuka efficiency kolom tertentu.
• Tidak ada hubungan yang jelas antara diameter partikel
dan efficiency kolom tertentu, tetapi fenomena
peningkatan efficiency dapat diharapkan tercapai
dengan penurunan diameter partikel, karena
perbedaan rata-rata ukuran pori dari packing material
dan ukuran pori interpartikel akan berkurang, yang
akan menyebabkan lebih seragamnya aliran di dalam
dan diantara partikel.
77
Hasil eksperimen yang menunjukkan hubungan antara tinggi
lempeng teoritis (H) dengan kecepatan alir pada kolom yang
dipakcing dengan tipe partikel yang sama tetapi berbeda
diameter ukuran partikelnya.
78
Persamaan Van Deemter
van Deemter equation
Adalah suatu persamaan yang menunjukkan efek
kecepatan fase gerak terhadap tinggi lempeng teoritis
Ket :  Adalah kecepatan alir linera, dan A, B, & C

adalah konstanta dari suatu kolom dan fase gerak
tertentu
79
• Tiga istilah pada persamaan Van Deemter
pada dasarnya mewakili tiga proses yang
berkotribusi terhadap keseluruhan
chromatographic band-broadening.
A—multipath effect or eddy diffusion
B—molecular diffusion
C—mass transfer
80
• A—multipath effect atau eddy diffusion
Multipath effect tidak tergantung pada kecepatan alir (flow rate).
Mendefisikan kemampuan molekul yang berbeda berjalan melalui media
berpori dengan jalan yang berbeda panjangnya..
• B—molecular diffusion
Molecular diffusion berbanding terbalik dengan kecepatan alir. Ketika
kecepatan alir lebih lambat, molekul bertahan lebih lama di dalam kolom
dan proses difusi molekular memiliki lebih banyak waktu untuk
memperlebar puncak.
• C—mass transfer
Mass-transfer berbanding lurus dengan kecepatan alir, yaitu semakin
cepat kecepatan alir fase gerak, akan semaknin besar pelebaran
puncaknya.
81
A—multipath effect atau eddy diffusion
Beberapa molekul solut bergerak dengan mengikuti jalur

yang relatif lurus ketika melewati kolom, namun yang
sebagian yang lain menempuh jarak yang lebih panjang dan
berliku
82
B—molecular diffusion
(longitudinal diffusion)
longitudinal diffusion
Adalah merupakan salah satu yang berkontribusi
terhadap timbulnya pelebaran pita/puncak dimana
solut berdifusi dari area dengan konsentrasi tinggi
ke area dengan konsentrasi rendah.
83
C—mass transfer
mass transfer
Adalah salah satu yang berkontribusi terhadap pelebaran
pita atau puncak dikarenakan waktu yang dibutuhkan oleh
sautu solut bergerak dari fase gerak atau fase diam ke
antarmuka kedua fase.
Band broadening atau pelebaran puncak muncul ketika

pergerakan solut ke antarmuka tidak cukup cepat untuk
menjaga kesetimbangan distribusi solut antara kedua fase84
Skema dari Fungsi Van Deemter function
dan komponen-komponennya.
Optimum flow rate
85
Nanti, aplikasi dari persamaan Van Deemter
akan Anda pelajari di pembahasan KCKT.
86
Terima Kasih
87

Bismillah Kromato

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Bismillah Kromato

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

KROMATOGRAFI

• Preparatif – memurnikan dan mengumpulkan

FI V, 2014, hal 1531

Chemicals are like People

• Gas (Gas Chromatography / GC)

• Liquid Solid Chromatography

• Gas Solid Chromatography

Liquid chromatography (LC)

Column High performance Thin layer,

Sampel HARUS bersifat volatil pada temperatur DI BAWAH 3500C

Berdasarkan Jenis Fase Geraknya :

Different sorptions explained

1. Gaya tarik solut pada adsorben (Stationary

 Elution: Kecenderungan solut untuk terlarut dan bergerak

 Displacement: Molekul solven berkompetisi dengan solut

Solven disusun dalam suatu urutan

C4 (RP4) C8 (RP8) C18 (RP18)

Si-O-Si–(CH2)3 –CH3 Si-O-Si-(CH2)7-CH3 Si-O-Si-(CH2)17-CH3

 Dikenal juga sebagai Liquid-Liquid Chromatography

Low salt High salt

Komponen/ zat yang berwarna biru teradsorbsi pada

Gaya Kapiler – gerakan cairan solven diantara material

• Setelah bercak ditandai, selanjutnya menghitung nilai Rf

Rf = jarak tempuh bercak dari titik penotolan

Rumus berikut digunakan untuk menghitung nilai

HRf = Jarak tempuh bercak dari titik penotolan x 100

Nilai Rf berkisar dari 0 - 1

a. Untuk menentukan berapa banyak komponen

KLT dapat digunakan untuk memantau reaksi kimia. Pada

 Silica bersifat sangat polar.

 Komponen sampel akan terpisah pada fase diam menurut

Daya pisah dan efisiensi pemisahan tergantung pada ukuran dan

Senyawa-senyawa yang mampu menyerap sinar UV

Contoh: Pengaruh kelembaban relatif. Ketika kelembaban relatif

1. Sampel 4.Motor stepper

Ini KLT yang penotolannya

Catatan: KLTKT = Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi 29

• Pada pengembangan ini, dilakukan

• Pengembangan ini dilakukan dengan

Alasan : solven akan mengalami penguapan ketika

Maka : Jika kita tidak mengangkat plat KLT dari bejana,

In situ detection and identification methods 37

Plat KLT Plat KLT yang sama

Pada mode Reflectance, kita dapat mengukur

Bercak sampel, ada

Densitogram KLT ekstrak metanol daun Agave americana

CAMAG Reprostar 3 with cabinet cover, camera bellows,

Postchromatographic Derivatization = derivatisasi atau

CAMAG TLC plate heater.

Metode Deteksi Warna bercak Penggunaan

Rf = jarak tempuh bercak dari titik penotolan

Fase gerak pada KLT yang optimum yang akan digunakan

Rf1 dan Rf2 nilai Rf kedua

Rf1 dan Rf2 nilai Rf kedua

d = jarak antar pusat dua spot/pita/bercak yang berdekatan

component B Kurang polar

component A Lebih Polar

origin mixture origin origin

Meningkatnya waktu pengembangan

Fluorene Fluorenone Fluorenol

a) Mana senyawa yang kurang polar?

b) Mana senyawa yang paling polar?

c) Bagaimana urutan pemisahan ketiga senyawa pada plat

F11 tidak terdeteksi