High Performance Liquid

Chromatography
(HPLC)
Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi
(KCKT)

Indra, M.Si
 Sebagai alat pemisah

Pemisahan
Dalam zat padat

Pemisahan
Dalam zat cair
 PEMISAHAN YANG TERJADI
 1. Antara padat dan cair:
Bahan cair Fase gerak

(Mobile phase)

Bahan Padat (Stationair phase)

Fase diam
 Sifat kimia fisika
Senyawa polar Senyawa nonpolar

As. Benzoat -COOH

Larut
Air
Na-Benzoat
-COONa

Kloroform
 PERBANDINGAN METODE PEMISAHAN
PERBANDINGAN METODE PEMISAHAN
Apa yang menjadi perbedaan ?
PERBANDINGAN METODE PEMISAHAN
Gambar pemisahanPERBANDINGAN METODE PEMISAHAN
Gambar pemisahan
Gambar pemisahan

1 1
1 1
1 1

8
8

Kromatografi
Corong pemisah Distilasi
8 Kelarutan
Kelarutan Dan interaksi kimia Perbedaan Ttk didih
Instrumen KCKT
Skematik KCKT
 Keuntungan KCKT
1. Waktu analisis cukup singkat, umumnya 5–30
menit.
2. Fasa mobil, kolom dan detektor banyak pilihannya.
3. Dapat dipakai untuk penentuan beraneka macam
4. senyawa (mikro sampai makro-molekul) termasuk
senyawa khiral.
5. Rentang dinamik (instrumental dynamic range)
yang cukup lebar
6. Dapat terpadu dengan intrumen fisiko kimia lainnya
sebagai “ hyphenated instrument “ contohnya :
LC/MS
 Kelemahan KCKT
• Sistem deteksinya, karena analit masuk kedalam
flow cell detektor dengan kecepatan tinggi [hal ini
bisa diatasi dengan PDA (photo diode array
detector)]
• Sistem elusi dan pemompaan fasa mobil [hal ini bisa
diatasi dengan memilih sistem pompa tekanan
rendah].
• Efisiensi pemisahannya mengingat kolom KCKT
panjangnya hanya 5 – 25 cm [bisa diatasi dengan
penyambungan kolom seri]
• Biaya pelaksanaan analisis cukup mahal.
Beberapa hal yang perlu diperhatikan oleh
kromatografi(wan?) KCKT

• Instrumentasi KCKT
• Sifat dan parameter kimia-fisika fasa mobil
• Pemilihan pompa KCKT
• Pemilihan sistem inlet KCKT
• Pemilihan kolom KCKT
• Pemilihan detektor KCKT
• Pengenalan perangkat lunak, evaluasi data dan
penyuguhan data analisis
Kromatografi Cair (KC)
• Merupakan sistem kromatografi dengan fase gerak
cairan

Bagaimana fase diamnya?

Jawab
Bisa padat bisa juga cair
Faktor apa yang mendasari kita memilih satu
mekanisme pemisahan dalam kromatografi?

Jawab
Yang mendasari kita memilih satu mekanisme pemisahan
dalam kromatografi sifat dan jenis analit yang ingin
dipisahkan
KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME
ADSORBSI ATAU DIKENAL DENGAN
KROMATOGRAFI ADSORBSI

Untuk analit yang bagaimana?

Jawab: untuk analit yang polar

Bagaimana prinsipnya:
Adsorbsi dan desorbsi
Bagaimana maksudnya adsorbsi - desorbsi

Jawab
Anda ingat like disolve like, seperti itulah
mekanismenya

Perjanjian: dalam kromatografi adsorbsi: fase

diam selalu polar (contoh Silika, Alumina, dll)
Berdasarkan perjanjian tersebut
Jika fase diam Polar, kemudian
Ada campuran analit, dengan
sifat Polar dan lainnya non
polar, maka yang bersifat polar
akan disukai oleh fase diam
(dengan kata lain teradsorbsi
lebih kuat) dibanding analit lain
yang kurang polar.

Analit Lebih
polar m = fase gerak
s = fase diam (polar)
Cerita mekanisme adsorbsi

Campuran analit pertama-tama dijerapkan pada fase diam,

selanjutnya aliran fase gerak akan memaksa analit-analit
tersebut untuk bermigrasi (terdesorbsi). Analit yang lebih
polar akan lebih terikat kuat pada fase diam yang juga
polar, akibatnya kecepatan migrasinya lambat, dibanding
analit yang kurang polar.

Sehingga => terjadi pemisahan

Jadi Kromatografi dengan mekanisme adsorbsi
1. Digunakan untuk pemisahan analit yang
bersifat polar
2. Fase diam yang digunakan bersifat polar:
misal Silika dan Alumina
3. Mekanismenya adsorbsi dan desorbsi
4. Jadi kalau kita menggunakan fase diam silika
pada KLT atau pun KCKT dll maka
mekanismenya adalah adsorbsi
 Kolom HPLC fase normal

Silica
gel : pemakaian umum
Cyano : pemakaian umum
Amino : analisa gula
Diol : analisa protein
-Si-CH2CH2CH2CN
Si -Si-CH2CH2CH2NH2
-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
Si
Silica gel
Modifikasi Si
Kasus: Suatu Campuran berisi

Dilakukan KLT dengan fase diam silika (polar) dan

fase gerak heksan. Mana yang akan mempunyai nilai
Rf lebih tinggi??
Jawab
Ikatan hidrogen
Non-polar

Silica gel (polar)

Apa yang terjadi jika campuran analit tersebut
dipisahkan dengan KCKT dengan kolom berisi silika?

kuat
HO
SiOH

SiOH

lemah

OH

menit
KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME
PARTISI ATAU DIKENAL DENGAN
KROMATOGRAFI PARTISI

Untuk analit yang bagaimana?

Jawab: untuk analit yang Non-polar

Bagaimana prinsipnya:
partisi
Apa yang dimaksud dengan partisi?

Jawab: Ingatkah anda apa yang akan terjadi

jika analit dimasukkan dalam corong pisah
yang berisi dua cairan yang tidak saling
larut? Analit tersebut setelah terjadi
kesetimbangan sebagian akan masuk ke
cairan satu dan sebagian lagi akan masuk ke
cairan dua.
Bagaimana jika kita menginginkan cairan C18H36
sebagai fase diam?
Jawab. Cairan tersebut di reaksikan secara kimia dengan
padatan silika.

-Si-C18H35

Si
 Perjanjian:
Kromatografi partisi: menggunakan fase
diam non polar, dan fase gerak polar

Sistem kromatografi dengan menggunakan

fase diam non polar, dan fase gerak polar
dikenal sebagai fase balik
Bagaimana mekanisme partisi dalam kromatografi
menjelaskan pemisahan kedua analit beikut?

A B

Jawab:
Ingat perjanjian: fase diam adalah bersifat non polar.
Fase diam adalah cairan. Jika campuran analit A dan B
dimasukkan ke sistem maka keduanya akan terpartisi
masing-masing ke dua cairan, yaitu fase diam dan fase
gerak. Senyawa B akan terpartisi lebih banyak dalam
fase diam karena dia lebih non polar. Akibatnya B akan
tertahan lebih lama pada fase diam
 Bagaimana interaksi?

Interaksi
hidrofobik Solven polar

Non-polar
 Hidrofobisitas
Jika sampel memiliki
CH3CH2CH2--- : rantai karbon
 : gugus aromatis Hidrofobisitas
Jadi lebih kuat.
Jika sampel memiliki
-COOH : gugus karboksil
-NH2 : gugus amino
-OH : gugus hidroksil Hidrofobisitas
X jadi lebih lemah.
Waktu retensi dan Hidrofobisitas
OH

C18 (ODS)
lemah

kuat
OH

menit