Prinsip dasar HPLC adalah fase gerak air dialirkan denganpompa melalui kolom ke detektor.

Cuplikan
dimasukkanke dari gumaliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadipemisahan
komponen-komponen cairan karena perbedaan kekuataninteraksi antara salut-salut terhadap fase
diam akan keluar dari kolomlebih dahulu dan sebaliknya. Setiap komponen campuran yang
keluardari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentukkromatogram. Senyawa
yang keluar dari dari kolom atas dasarkepolaran yang berbeda akan mempengaruhi kekuatan.
Analisis kualitatif bertujuan untuk mengetahui keberadaansuatu unsur atau senyawa kimia, baik
organik maupun inorganik,sedangkan analisis kuantitatif bertujuan untuk mengetahui jumlahsuatu
unsur atau senyawa dalam suatu cuplikan.

Prinsip Kerja HPLC

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya
terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling
membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk
mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya
untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum
yang puncak-puncaknya terpisah.

Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi <
golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.

HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara yang paling
umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT
yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal lain
yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai
spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat
tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis di dalam
sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang
digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa
carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk
tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk
analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh
pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.

Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses identifikasi.
Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat
peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan
banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan
dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini
dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC
sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit
mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.