Makalah HPLC

Kelompok 6

Nama Anggota :
1. Siska Oktari (PO.71.39.1.18.033)
2. Sulistio (PO.71.39.1.18.034)
3. Tasya Septiyani (PO.71.39.1.18.035)
4. Tiara Mayang Pratiwi (PO.71.39.1.18.036)
5. Yuliana Safitri (PO.71.39.1.18.037)
6. Yuni Suharina (PO.71.39.1.18.038)
7. Zafira Fathya (PO.71.39.1.18.039)
Kelas : Reguler 2A
Dosen Pembimbing : Vera Astuti S.Farm Apt M.Kes

POLTEKKES KEMENKES PALEMBANG

PRODI D3 FARMASI
TAHUN AKADEMIK 2018 / 2019
 DAFTAR ISI

DAFTAR ISI..................................................................................................................

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang.........................................................................................................

B. Penjelasan Singkat.............................................................................................................

BAB II PEMBAHASAN

A. Pengertian................................................................................................................

B. Jenis-jenis HPLC......................................................................................................

C. Instrument HPLC......................................................................................................

D. Prinsip Kerja HPLC..................................................................................................

E. Kelebihan dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC...................................

F. Teknik Pengoperasian Alat.......................................................................................

G. Analisis Kromatografi / Interprestasi Data................................................................

H.Contoh Analisa..........................................................................................................

BAB III DISKUSI

A. Tanya Jawab............................................................................................................

BAB IV PENUTUP

A. Kesimpulan..............................................................................................................

Daftar Pustaka................................................................................................................
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan

berdasarkan partisi cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat
cair, dan fasa diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Kita biasanya
menganggap Tswett sebagai penemu kromatografi, yang pada tahun 1903
menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom kapur untuk memisahkan
pigmen dalam daun. Istilah ‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett untuk menggambarkan
daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan
dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu
lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan
cairan yang merembes lewat atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner
mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu
cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi
empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair.
Pembahasan teknik kromatografi modern,  baru lengkap bila disebut
kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom
klasik  merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair
yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode
itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama.
Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup
kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi
oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm -2 (3000
p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen
dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm 3m-
1
).Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih
cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang
tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas penggunaannya
dalam kimia organik.

B. PENJELASAN SINGKAT

 Pengertian dan Konsep HPLC

HPLC adalah metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik
untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. HPLC pelarutnya menetes melalui
kolom dibawa pengaruh gravitasi, terdapat pompa yang dapat
memberikan tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. HPLC dapat
dianggap sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Pada KG, senyawa
yang akan dianalisis harus menguap atau dapat diubah menjadi senyawa
yang menguap. Sedangkan pada HPLC, analit harus larut dalam cairan
(fase gerak). HPLC dapat digunakan untuk menganalisis senyawa organik
dan anorganik yang pada umumnya tidak dapat menguap. HPLC
memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk
material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas
permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-
molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih
baik dari komponen-komponen dalam campuran.Sampel yang akan
dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan
diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui
sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar
asam organik.
 Prinsip Kerja HPLC
Prinsip HPLC menggunakan Prinsip kromatografi untuk mengukur
sampel.Dalam kromatografi, analisis dilakukan dengan cara istirahat
molekul berdasarkan perbedaan struktur atau komposisinya. Pemisahan
tersebut terjadi saat sampel bergerak melewati fase diam (bisa terdiri zat
padat atau cair) karena terbawa oleh fase gerak (dapat Berupa zat cair
atau gas).
Beragam komponen dalam sampel akan terpisah berdasarkan
perbedaan afinitasnya terhadap fase diam Komponen yang bisa tinggal
secara kuat dengan fase diam akan bergerak lebih lambat sehingga
dapat terpisah dari komponen lain dengan interaksi yang lemah.
Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan dengan melewatkan sample
pada suatu kolom dengan bantuan fase gerak cair yang dialirkan sampai
ke detector yang kemudian hasilnya dibaca oleh recorder dalam bentuk
kromatogram.

 Kegunaan dan Komponen HPLC

Terdapat 5 komponen dasar HPLC yaitu:
a. Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut
kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase
gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2
liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut
yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi
dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan
pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk
fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase
terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum
digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel
kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan,
sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa
dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi dapat dilakukan
dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan
cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang
analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien
digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama
jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. Fase gerak yang paling
sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran
larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk
pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan
adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi
atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase
normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.

b. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus
inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah
gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan
sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan
preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem
penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase
gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari
gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan
konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa
dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan
dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

c. Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam
fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat
penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang
dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. 
d. Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam
untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan

kolom konvensional, yakni:

 Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
 Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas
misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak

setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya
residu gugus silanol (Si-OH).  Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan
menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan
bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus
fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam
yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-
senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau
rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-
silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika
yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu
retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang
digunakan. 

e. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:
detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat
spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis,
detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

 Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

 Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada
kadar yang sangat kecil.
 Stabil dalam pengopersiannya.
 Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita.
 Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
 Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
 Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan
karakteristik detektor seperti berikut :
Detektor Sensitifitas Kisaran Karakteristik
(g/ml) linier
Absorbansi Uv-vis
Fotometer filter 5 x 10-10 104 Sensitivitas bagus, paling sering
Spektrofotometer 5 x 10-10 105 digunakan, selektif terhadap gugus-
spektrometerphoto- > 2 x 10-10 105 gugus dan struktur-struktur yang
diode array tidak jenuh.
Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus, selektif,
Tidak peka terhadap perubahan
suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal akan tetapi
sensitivitasnya sedang. Sangat
sensitif terhadap suhu, dan tidak
dapat digunakan pada elusi
bergradien
Elektrokimia
Konduktimetri 10-8 104 Peka terhadap perubahan suhu dan
Amperometri 10-12 105 kecepatan alir fase gerak, tidak
dapat digunakan pada elusi
bergradien. Hanya mendeteksi
solut-solut ionik. Sensitifitas sangat
bagus, selektif tetapi timbul masalah
dengan adanya kontaminasi
elektroda.

 Penggunaan Alat HPLC

Pertama, semua komponen dari HPLC dihubungkan terlebih dahulu ke
power supply. Pompa atau kompresor dinyalakan. Detektor dinyalakan,
komputer dinyalakan, printer juga dinyalakan karena untuk pengeprinan
hasil langsung. Ditunggu hingga 15 menit terlebih dahulu, lampu yang
berwarna merah menyala pada saat dinyalakan, ketika sudah menyala
barulah berwarna hijau. Setelah komponen menyala, LC solution yang
terdapat dalam komputer dibuka, karena hanya ada 1 LC, maka klik LC
nomor 1. Setelah itu akan muncul bagian pengaturannya, cara
pengaturannya yaitu klik metode, kemudian instrumen, parameter seperti
komposisi eluen, laju aliran, detektor, dan lamanya waktu analisis diatur.
Dalam pengaturan, diatur secara bertahap tidak boleh langsung sesuai
yang diingankan. Mode pa software LC solution terdapat 2 pilihan yaitu,
pertama iso kratik, iso kratik adalah pengaturan dimana eluen dari awal
sampai akhir penggunaan eluen akan sama. Kedua adalah gradien, yaitu
ada tingkatan dimana eluen untuk elusinya dirubah. Klik detektor uv pada
panjang gelombang 254 nm, klik end time. Perhatikan pembacaan
detektor. Selain mengenalkan cara penghidupan HPLC, cara
penginjeksian sampel dilakukan. Penginjeksian sampel dimulai dengan
syringe atau alat penginjeksian dibersihkan terlebih dahulu, setelah bersih
dicuci dengan pelarut yang akan digunakan, klik single star, injeksi run
lalu equation information. Terdapat dua pilihan dalam penginjeksian yaitu
automatic sample atau pengambilan sendiri sampel, atau menginjek
dengan sendirinya, dan yang kedua adalah injection volume (jumlah
sampel yang ingin diinjeksikan). Pada proses penginjeksian syringe
dimasukkan pada bagian injeksi secara tegak dan jangan sampai
jarumnya bengkok. Kemudian tombol pada tempat injeksi diputar kearah
load, keluarkan cairan, yang terakhir putar ke arah injek, lalu keluarkan
jarum secara hati-hati.

BAB II
PEMBAHASAN
A. . PENGERTIAN
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan
pada teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat
dalam bentuk cair atau padat.
Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara
simultan beberapa analit dalam martiks sederhana maupun kompleks.
Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan
kromatografi cair sebagai suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas.KCKT
adalah kromatografi cair kolom modern, yang dasarnya merupakan pengembangan
dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien.
Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan
peningkatan performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi
dan partikel yang jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom,
sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan
tekanan tinggi.Di samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan
adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan
dengan sistem kromatografinya.
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya
dapat digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila
derivatisasi diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak
diderivatisasi dapat dianalisis.Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak
menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT
menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam analisis.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode
kromatografi lainnya, antara lain :
a) Cepat : waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang uncomplicated waktu analisis
kurang dari 5 menit bisa dicapai.
b) Resolusi tinggi : berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT
karena pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.
c) Sensitivitas detektor : detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT
dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-
macam zat. Detektor-detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumlah
sampai picogram (10-12 gram).

d) kolom dapat digunakan kembali : berbeda dengan kolom kromatografi klasik,

kolom KCKT dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan
kolom yang sama sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali untuk
berbagai jenis sampel.

e) Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah :: zat-zat yang tidak bisa dianalisis
dengan KG karena terurai oleh suhu  tinggi atau volatilitasnya rendah dan dapat
dianalisis secara KCKT.

f) Mekanisme pemisahan lebih variatif :: banyaknya pilihan fase gerak dan fase diam
yang digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak
memungkinkan terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.

g) Mudah rekoveri sampel :: umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga
komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati
detektor.

Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, KCKT
memiliki beberapa kelemahan, yaitu :
1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus
2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih

dalam analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan
penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak
mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan
metode KG.Banyak senyawa yang dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari
senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul.Untuk analisis dan
pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase
pemisahan kiral yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif.
Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT
sangat mahal, namun metode ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277
obat / bahan obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi
dalam waktu analisis yang cepat.
Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:
1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen
biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

B. Jenis- Jenis HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase
diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase
diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya).Berdasarkan pada
kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal
dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan
berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi
solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis.Pemisahan kromatografi adsorbsi
biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan
alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai
fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan
berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang
berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan
puncak yang berekor.
  2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat.Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau
dengan fenil.Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS
atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau
dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah  atau basa lemah,
peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan
mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini
menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut
dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami
ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion

HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau
anion dengan suatu fase gerak.Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran,
meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air
karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya
air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak
air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh
pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut.
Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion
fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-
sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode
penukaran ion.Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang
berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

 Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul >
2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau
berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar,
akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan
terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM
yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam.
Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi
interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang
sangat spesifik.Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat
menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik
tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan
antibodi).Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim)
dari campuran yang sangat kompleks.

C. Instrument HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase
gerak (Reservoir) , pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom,
detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau
integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair dapat dilihat
pada gambar di bawah ini :
1 .Wadah fase gerak (Reservoir)
 Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada
fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor
sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas
campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam
daya elusi dan resolusi.Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen
sampel.Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan
elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.Sementara untuk fase
terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun
dengan meningkatnya polaritas pelarut.
 Fase Gerak
Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau
pelarut.Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran
campuran menuju detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh
karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu
keberhasilan proses pemisahan.

 Persyaratan fase gerak HPLC:

1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan
dianalisis.
2.    Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang
dapat mengganggu interpretasi kromatografi.
3.    Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
4.    Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak
beracun.
5.    Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
6.    Sesuai dengan detector.

 Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak:

a)    HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan
fase gerak non-polar. Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau
trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica.Sedangkan fase gerak yang
digunakan adalah heksana atau i-propileter.
b)   HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar
dan fase gerak polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau
asetinitril.
      Fase gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’  pada rentang yang
sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan
fase gerak yang memberikan k’ antara 2-5

2. Pompa
          Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase
gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat,
Teflon, dan batu nilam.Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan
tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir
3 mL/menit.Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa
dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan
dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:
    a)      Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara
gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan
berkontak langsung dengan pelarut.Ketika piston mundur maka bola gelas bawah
terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah
menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong
masuk ke dalam kolom. 
     b)      Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi
pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang
cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.

     c)      Pompa pneumatic

Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi.Pompa jenis ini
murah dan bebas pulsa.Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan
yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut
dan takanan balik kolom.

3. Tempat Injeksi
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi
yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke
dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat
tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500
μL).

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a)   Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem
tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam
cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b)   Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan
pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70
atmosfir.Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi
Cair.Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat
menyebabkan penyumbatan.
c)    Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume
lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan
adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual).
Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE
difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.

Syarat- syarat injektor yang baik :

 Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin
 Mudah digunakan
 Keberulangan tinggi
 Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik
4. Kolom
 Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :
Parameter Kolom konvensional Kolom mikrobor
Tabung Stainless steel Stainless steel
kolom Panjang 3,10,15,20 dan Panjang 25 dan 50 cm
25 cm Diameter luar 0,25 inci
Diameter luar 0,25 inci Diameter dalam 1 atau 2 mm
Diameter dalam 4,6 cm
Fase diam Porous, silika ukuran Porous, silika ukuran kecil, silika yang
kecil, silika yang dimodofikasi secara kimiawi (bonded
dimodofikasi secara phase), atau polimer-polimer stiren/divinil
kimiawi (bonded phase), benzen.Rata-rata diameter partikel 3,5
atau polimer-polimer atau 10µm dengan kisaran sempit.
stiren/divinil
benzen.Rata-rata
diameter partikel 3,5 atau
10µm dengan kisaran
sempit.
Tekanan 500-3000 psi 1000-5000 psi
operasiona (35-215 bar (70-350 bar)
l

Fase gerak Hidrokarbon+pelarut Hidrokarbon+pelarut terklorinasi atau

terklorinasi atau alkohol alkohol untuk fase normal. Untuk fase
untuk fase normal. Untuk terbalik (reversed phase) digunakan
fase terbalik (reversed metanol atau asetonitril + air atau
phase) digunakan bufer.Kecepatan alir 10-100
metanol atau asetonitril + µl/menit.Modifikasi instrumen
air atau bufer.Kecepatan Sistem penghantaran pelarut yang
alir : 1-3 ml/menit mampu memberikan kontrol aliran di
bawah 10µl/menit.Katup injeksi sampekl
bervolume kecil;sel detektor bervolume
 kecil.
Kinerja Efisiensi meningkat Sangat efisiensi dan sensitif, akan tetapi
dengan bekurannya lambat,konsumsi fase gerak hanya ¼ dari
ukuran partikel fase kolom konvensional.
diam, akan tetapi umur
kolom dengan ukuran
partikel 3 µm lebih
pendek.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan

kolom konvensional, yakni:
- Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase
gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
- Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih
ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
- Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya
jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan
kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

 Fase Diam
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen.Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu
gugus silanol (Si-OH).Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan
reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus
silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih
sesuai untuk solut yang polar.Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih
cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi
akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya
kandungan air yang digunakan.

5. Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa;
dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara
spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
a.    mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
b.    mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada
kadar yang sangat kecil;
c.    stabil dalam pengopersiannya;
d.   mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita;
e.    signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis linier);
f.     tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Karakteristik detector HPLC:

Dasar Jenis Maksimum Peka Sensitivitas
Pendeteksian sensitifitas terhadap suhu
kecepatan alir
Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah
Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah
Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah
Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 0 C
Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% 0C
Spektometri Umum 10-10 Tidak Tidak ada
massa
elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% 0C

D. Prinsip Kerja HPLC

Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau
zat terlarut terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam
fase gerak dan fase diam
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya.Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi
lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.
Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk
sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada
spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon <
senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton <
golongan alkohol< golongan asam.
HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses
kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat
Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard
umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu
dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan
mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua
zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan,
meskipun memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang
dianalisis di dalam sampel.  Yang berperan dalam proses separasi pada system
HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa,
misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein,
lovastatin, dan sebagainya.Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan
analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan
untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi
sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya
adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal
kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan
banyaknya jenis komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai
kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk
(overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi.
Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample
yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih
dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit
mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses
pelarutan saja.

E. Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid

Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia.HPLC
termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak
cairan dan fasa diam cairan atau padat.Banyak kelebihan metode ini jika
dibandingkan dengan metode lainnya.

Kelebihan itu antara lain:

   a . Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran

   b . Mudah melaksanakannya
   c . Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
   d . Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
Resolusi yang baik
   e . Dapat digunakan bermacam- macam detektor
   f  . Kolom dapat digunakan kembali
  g . Mudah melakukan "sample recovery".Mudah untuk mendapatkan kembali
cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang
dianalisis.
  h .Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi
karena HPLC dilakukan pada suhu kamar.
  i . Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa
anorganik.
j. Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik
didihnya sangat tinggi seperti polimer
   k . Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan
panas
 l.  Banyak pilihan fasa geraknya Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari
1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk
analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5
menit bisa dicapai 
  m. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa
dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit
berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan
rasa diam.
  n. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan
rasa gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai
pemisahan yang diinginkan.
  o. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam
HPLC dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari
bermacam-macam zat.
  p. Detektor- detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah
sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer
Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll, dapat juga digunakan dalam HPLC
  q. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom
kromatografi klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) .
Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari
jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang
digunakan
   r. Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa
dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi
untuk menganalisis psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar
ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.
  s. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC
tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang
diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah
dikumpulkan setelah melewati detector.
 t. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk
kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.
    
Sedangkan kekurangannya adalah:

a. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu

b. Hanya bisa digunakan untuk asam organic
c. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan
gradientelusi
d. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang
terbatas

F. Teknik Pengoperasian Alat

Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan
bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini
meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah
mempelajarinya).

Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju
detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu
dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang
maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk
beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

 Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari
pelarut)
 Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada
ukuran partikel)
 Komposisi yang tepat dari pelarut
 Temperatur pada kolom
Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda
menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-
senyawa.
Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom.
Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan
ultra-violet.
Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang
gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom
dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan
pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.
Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu
yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut
yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi
berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian
yang berbeda dari specktrum UV.
Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan
air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-
air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih
besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.

G. Analisis Kromatogram/ interpretasi data

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-
masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan
menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat
menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang
diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa
murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.
Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur
kuantitas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam
senyawa tertentu, X.
Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X
yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam
waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah
dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.
 Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui
detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area
dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu
retensi akan sama. Misalnya, Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen
sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang
dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.
Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi
yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan
jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan
serapan UV sebagai metode pendeteksinya.
Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area
dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi
dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit
dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika
diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

H. Contoh Analisa
Penerapan HPLC Dalam Analisis Senyawa (Obat) Dalam Campuran
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif
pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi
dalam sediaan farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi
senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektometer massa (MS).
Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit
diperoleh.

Penggunaan KCKT dalam bidang farmasi

Metode KCKT merupakan metode yang sangat populer untuk menetapkan
kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan atau dalam sampel hayati .Hal ini
disebabkan KCKT merupakan metode yang memberikan sensitifitas  dan spesifitas
yang tinggi. Berikut ini adalah beberapa contoh penggunaan KCKT untuk analisis
beberapa sediaan farmasi :
Obat (sediaan) Fase diam Fase gerak Detektor
Adriamisin (serum) C18 Asetonitril- Fluoresen
 asam fosfat
EK : 465 nm
0,01 N ph 2,3
EM : 580 nm
(50:50)
CH3CN-H2O
Aktinomisin (Serbuk) C18 Elektrometer
(1:1)
KH2PO4 0,05M;
Allopurinol (tablet) C18; 4 x 30 cm UV 254 nm
1,5 ml/menit

1. Parasetamol:
 Nama Kimia : 4- Hidroksiasetanilida
 Rumus Molekul : C8H9NO2
 Berat Molekul : 151,16
 Pemerian : serbuk, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit.
 Kelarutan : larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1
N, mudah larut dalam etanol. (Depkes RI, 1995).

Parasetamol atau N-asetil-p-aminofenol atau asetaminofen merupakan

derivat para-amino fenol yang berkhasiat sebagai analgesik-antipiretik.Asetaminofen
merupakan pengganti yang baik untuk analgesik dan antipiretik aspirin pada
penderita dengan keluhan saluran cerna dan pada mereka dengan perpanjangan
waktu perdarahan yang tidak menguntungkan.Asetaminofen merupakan analgetik
dan antipiretis.
Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor
yang dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV.Karakteristik
senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom
nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti methanol/ air.Parasetamol
diabsorbsi cepat dan sempurna melalui saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma
dicapai dalam waktu ½ jam dan masa paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini
tersebar ke seluruh tubuh.Dalam plasma, 25% parasetamol terikat protein
plasma.Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan antipiretik.
Pengujian kadar parasetamol dalam obat menggunakan teknik HPLC , dalam
proses analisisnya HPLC memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan
menginjeksikan sampel uji yaitu larutan obat yang sebelumnya telah disaring dengan
membran PTFE ke dalam kolom HPLC dengan injektor khusus / syringe yang
bervolume 20 µL, penyaringan sebelum penginjeksian ini dilakukan agar tidak terjadi
penyumbatan didalam kolom dan menghilangkan gas dari pelarutnya. Sampel
didorong cepat saat melalui kolom dengan bantuan pompa bertekanan tinggi.Di
dalam kolom, komponen- komponen pada sampel dipisahkan berdasarkan pada
perbedaan kekuatan interaksi solut terhadap fasa diamnya. Solut yang interaksinya
kurang kuat akan keluar lebih lambat dari kolom daripada solut lainnya. Komponen
akan keluar dari kolom dengan kecepatan yang berbeda dan terdeteksi oleh
detektor. Detektor yang digunakan adalah detektor UV karena parasetamol
merupakan senyawa organik yang dapat menyerap sinar UV.Pengujian ini
menggunakan panjang gelombang 243 nm dengan mempertimbangkan panjang
gelombang methanol yaitu 205 nm dan air yaitu 190 nm.Teknik yang dilakukan kali
ini merupakan “reverse phase” atau fasa terbalik karena teknik ini menggunakan
pelarut polar sebagai fasa gerak sedangkan fasa diamnya menggunakan pelarut
non- polar.Penggunaan fasa gerak dan fasa diam yang berbeda kepolarannya ini
bertujuan agar sampel uji tidak bereaksi dengan fasa diamnya saat melewati kolom
HPLC.Sampel melewati kolom HPLC tentunya memiliki jangka waktu yang terukur
dan juga menjadi parameter, waktu yang dibutuhkan sampel untuk melewati kolom
ini disebut waktu retensi. Dalam pengujian parasetamol dalam obat, waktu retensi
yang terukur adalah antara 2,19 hingga 2,2. Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC
ini menghasilkan suatu citra berupa kromatogram.Kromatogram ini merupakan grafik
antara intensitas komponen yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu
retensi.Seharusnya tampilan kromatogram ini berupa grafik lurus, lancip, dan
simetris.Tetapi data yang diperoleh pada percobaan ini sedikit melebar dan tidak
simetris tentunya. Ini disebabkan antara lain oleh adanya difusi didalam kolom
HPLC, difusi yang terjadi adalah difusi longitudinal dan difusi transfer massa. Difusi
longitudinal itu sendiri disebabkan oleh penyebaran komponen yang tidak sama
sedangkan difusi transfer massa disebabkan oleh kecepatan komponen yang tidak
merata. Terdapat beberapa parameter pemisahan dalam HPLC, yaitu laju alir eluen
yaitu sebesar 0,5 mL/ menit, ketebalan stasioner kolom C-18 yaitu 15 cm, ukuran
partikel analit, dan laju difusi yang sudah disebutkan diatas. Parameter- parameter
ini dapat menyebabkan kejanggalan dalam pencitraan kromatogram seperti
pelebaran pada puncak.Adanya pelebaran puncak pada kromatogram
mengindikasikan terjadinya overlapping analit yang belum terpisahkan dalam kolom.
Semakin tinggi laju difusinya maka komponen dalam sampel akan semakin sulit
dipisahkan secara efisien. Dari grafik luas area terhadap konsentrasi (ppm) dapat
dihitung kadar parasetamol dalam sampel obat. Data yang diperoleh menunjukkan
bahwa dari sampel obat sebanyak 12,5 mg diperoleh kadar parasetamol sebesar
83,444 % sedangkan dari massa rata-rata tablet obat sebesar 738,2 mg diperoleh
massa parasetamol pada tiap tablet obat sebesar 615,9836 mg. Dapat disimpulkan
bahwa kadar parasetamol dalam tablet obat adalah sebesar 615,98 mg per
tabletnya.

2. Kafein
Rumus struktur :
 Nama Kimia : 1,3,7-Trimetil xantin
 Rumus Molekul : C8H10N4O2
 Berat Molekul : 194,19
 Pemerian : serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat putih,
biasanya menggumpal, tidak berbau, rasa pahit.
 Kelarutan : Agak sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut
dalam kloroform, sukar larut dalam eter. (Depkes RI, 1995).

Dalam penetapan kandungan kafein digunakan sampel berupa minuman

berkafein. HPLC yang digunakan adalh jenis HPLC Series 200 dengan detector 275
nm Perkin Elmer, Kolom : Supelcosil LC : 18, ( 25 cm X 4,6mm, 5 μm ).
Menggunakan asam asetat 70% dan methanol 30% sebagai fasa gerak. Proses
pengerjaan terdiri dari 2 tahap, yaitu tahap preparasi dan tahap injection ke HPLC.

ANALISIS KUANTITATIF
Metoda Persentase Tinggi / Lebar Puncak
Metoda ini disebut juga Metoda Normalisasi Internal. Untuk analisis kuantitatif
diasumsikan bahwa lebar atau tinggi Puncak (Peak) sebanding (proportional)
dengan kadar / konsentrasi zat yang menghasil puncak. Dalam metoda yang paling
sederhana diukur lebar atau tinggi Puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti
bahwa setiap lebar atau tinggi Puncak diekspresikan sebagai suatu persentase dari
total). Hasil normalisasi dari lebar atau tinggi puncak memberikan komposisi dari
campuran yang dianalisis, seperti contoh pada Tabel berikut:
Peak area
No
Kafein standar Kafein dalam sampel
 1 2601417,40 2216635,31
Berdasarkan data table diatas, maka kadar kafein dalam sampel ( teh poci )
dapat dianalisis dengan mengunakan persamaan :
Cx = Ax / Ap X Cp
= x 200 ppm
= 170,42 ppm
Maka dalam 1 mL sampel yang diuji terdapat 0,17042 mg kafein.

Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu:

Kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-
tiap komponen muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada
kromatogram.Komponen-komponen dapat berkoelusi, atau ditahan di dalam kolom,
atau, terelusi tanpa terdeteksi. Kita harus mengasumsi bahwa kita memperoleh
respons detektor yang sama untuk setiap komponen
Untuk mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor diperlukan.

Kafein berkhasiat menstimulasi SSP, dengan efek menghilangkan rasa letih,

lapar dan mengantuk, juga daya konsentrasi dan kecepatan reaksi dipertinggi,
prestasi otak dan suasana jiwa diperbaiki.Kofein juga memperkuat kontraksi jantung,
vasodilatasi perifer dan diuretis.Kofein digunakan sebagai penyegar.Zat ini sering
dikombinasikan dengan Parasetamol atau asetosal untuk memperkuat efek
analgetisnya.
Kafein dosis sedang menyebabkan insomnia, ansietas dan agitasi.Dosis
tinggi diperlukan untuk memperlihatkan toksisitas berupa muntah dan konvulsi.Dosis
letal sekitar 10 g (kira-kira 100 cangkir kopi) yang menimbulkan aritmia
jantung.Kematian karena kafein sangat tidak mungkin. Letargi, iritabel dan sakit
kepala terjadi pada pengguna yang secara rutin minumg lebih dari 600 mg kopi per
hari ( sekitar 6 cangkir kopi per hari) dan mendadak berhenti. (Mycek, 2001).
Preparasi Sampel
- Sampel harus dalam bentuk larutan
- Untuk skala analisis sampel dalam mikroL , konsentrasi sampel yang
diinjeksikan tidak boleh terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom.
Konsentrasi maksimal adalah 40 ppm.
Preaparasi Fase Gerak
- Fase Gerak ( eluen ) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade
HPLC. Untuk air digunakan akuabidest.
- Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan milipore kemudian
diawagaskan ( di digest ) dengan sonikator sekitar 30 menit untuk
menghilangkan udara terlarut.
- Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan
untuk menghindari adanya gelembung pada selang penghubung.
- Tabung eluen yang diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang di
gunakan.

BAB III
DISKUSI

A. TANYA JAWAB
 BAB IV
PENUTUP

A. Kesimpulan
 Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom,
detector, pengolahan data.
  Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah
pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase
mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). HPLC sering digunakan antara lain
untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil samping
proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi.
Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam suatu
campuran.
 HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu
menghasilkan pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang
tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas, banyak pilihan fasa
geraknya, mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada
KCKT tidak merusak komponen zat yang dianalisis, dan dapat dirangkai
dengan instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi pemisahan. Sedangkan
kekurangannya adalah larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu,
hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus mengetahui kombinasi yang
optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya mahal sehingga
penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, M., dan Suherman 1995.Analisis Instrumental. Airlangga University Press.

Surabaya.

Bahti.1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas Padjajaran. Bandung.

Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis
Kuantitatif Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Day, R.A dan Underwood, A.L., 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.

Khopkar, S.M., 2008, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.

Putra,Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi.
Jurusan Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera
Utara :3