MAKALAH INSTRUMEN FARMASI

“ HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY “

Disusun oleh :

1. Dhea aprilia (PO.71.39.19.007)

2. Dian Rana Yusriah (PO.71.39.19.008)
3. Elza Novia (PO.71.39.19.009)
4. Fransiska Angelina (PO.71.39.19.010)
5. Haikal Ahmad Mujahidin (PO.7.39.1.19.011)
6. Hanifah Dzakira(PO.71.39.19.012)

Kelas :
Reguler 2A

Dosen Pembimbing :
Vera Astuti,S.Farm, Apt, M.Kes

NILAI PARAF

POLTEKKES KEMENKES PALEMBANG

JURUSAN FARMASI
TAHUN AKADEMIK 2019/2020
 KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum warahmatullahi wabarakatuh

Segala puji bagi Allah SWT yang telah memberikan kami kemudahan sehingga kami dapat
menyelesaikan makalah ini dengan tepat waktu. Tanpa pertolongan-Nya tentunya kami tidak
akan sanggup untuk menyelesaikan makalah ini dengan baik. Shalawat serta salam semoga
terlimpah curahkan kepada baginda tercinta kita yaitu Nabi Muhammad SAW yang kita nanti-
natikan syafa’atnya di akhirat nanti.

Penulis mengucapkan syukur kepada Allah SWT atas limpahan nikmat sehat-Nya, baik itu
berupa sehat fisik maupun akal pikiran, sehingga penulis mampu untuk menyelesaikan
pembuatan makalah sebagai tugas dari mata kuliah Instrumen Farmasi dengan judul “ HIGH
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY ”

Penulis tentu menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari kata sempurna dan masih banyak
terdapat kesalahan serta kekurangan di dalamnya. Untuk itu, penulis mengharapkan kritik serta
saran dari pembaca untuk makalah ini, supaya makalah ini nantinya dapat menjadi makalah yang
lebih baik lagi. Kemudian apabila terdapat banyak kesalahan pada makalah ini penulis mohon
maaf yang sebesar-besarnya.

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada semua pihak khususnya kepada Dosen
Pembimbing kami yang telah membimbing dalam menulis makalah ini.

Demikian, semoga makalah ini dapat bermanfaat. Terima kasih.

Palembang, 12 November 2020

Penulis

1
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR.......................................................................................................................................1
DAFTAR ISI...................................................................................................................................................2
BAB I............................................................................................................................................................3
PENDAHULUAN...........................................................................................................................................3
I. Latar Belakang.................................................................................................................................3
II. Tujuan..............................................................................................................................................4
III. Rumusan Masalah.......................................................................................................................4
BAB II...........................................................................................................................................................5
TINJAUAN PUSTAKA....................................................................................................................................5
I. Perkembangan Kromatografi...........................................................................................................5
II. Pengertian HPLC..............................................................................................................................6
III. Teknik Pemisahan dengan HPLC..................................................................................................8
IV. Prinsip Kerja Dari KCKT................................................................................................................9
V. Kegunaan KCKT................................................................................................................................9
VI. Mekanisme Kerja KCKT..............................................................................................................10
VII. Jenis – Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi............................................................................17
VIII. Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC.......................................................19
BAB III........................................................................................................................................................21
PEMBAHASAN...........................................................................................................................................21
II. ANALISIS KUANTITATIF......................................................................................................................23
BAB III........................................................................................................................................................25
PENUTUP...................................................................................................................................................25
I. Kesimpulan....................................................................................................................................25
II. Saran..............................................................................................................................................25
DAFTAR PUSTAKA......................................................................................................................................26

2
 BAB I

PENDAHULUAN

I. Latar Belakang

Kimia analitik adalah cabang ilmu kimia yang berfokus pada analisis material untuk
mengetahui komposisi, struktur, dan fungsi kimiawinya. Secara tradisional, kimia analitik dibagi
menjadi dua jenis, kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif bertujuan untuk mengetahui
keberadaan suatu unsur atau senyawa kimia, baik organik maupun anorganik, sedangkan analisis
kuantitatif bertujuan untuk mengetahui jumlah suatu unsur atau senyawa dalam suatu cuplikan.
Kimia analitik modern dikategorisasikan melalui dua pendekatan, target dan metode.
Berdasarkan targetnya, kimia analitik dapat dibagi menjadi kimia bioanalitik, analisis material,
analisis kimia, analisis lingkungan, dan forensik. Berdasarkan metodenya, kimia analitik dapat
dibagi menjadi spektroskopi, spektrometri massa, kromatografi dan elektroforesis, kristalografi,
mikroskopi, dan elektrokimia.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC
(Hight Performance Liquid Chromatograhy ) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal
tahun 1970-an. Saat ini KCKT merupakan tekhnik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam sebidang, antara lain :
farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer dan industri-industri makanan. Beberapa
perkembangan KCKT terbaru antra lain : miniaturisasi`sistem KCKT, penggunaan KCKT untuk
analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat dan analisisi senyawa-senyawa
kiral.
Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC, High Performance Liquid Chromatography)
merupakan suatu tekhnis analisis obat yang paling cepat berkembang. Cara ini ideal untuk
analisis beragam obat dalam sediaan dan cairan biologi, karena sederhana dan kepekaannya
tinggi.
            KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu
seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis;
menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintetis, atau
produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor sampel-sampel yang berasal dari
lingkungan ; memurnikan senyawa-senyawa dalam suatu campuran ; memisahkan polimer dan
menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran; kontrol kualitas dan mengikuti
jalannya reaksi sintetis.

            Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT
dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya
sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.

3
 Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan
dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa- fasa ini membentuk suatu lapisan
stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes
lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa stasioner/diam dapat berupa zat padat atau suatu
cairan, dan fasa gerak dapat berbentuk cairan ataupun gas. Maka semua jenis kromatografi yang
dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat,gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Day dan
Underwood, 2002). Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan
melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan
tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.
Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan dalam memisahkan suatu campuran senyawa.
Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi
piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu
menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography
(HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter
umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran
dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).
HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase
diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit ( kolom )
dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan
tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relative singkat.
HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi;
lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan.

II. Tujuan
Tujuan dari pembuatan makalah ini adalah :
1. Untuk mengetahui pengertian dari HPLC.
2. Untuk mengetahui prinsip kerja dan penerapan dari HPLC.
3. Untuk mengetahui kelebihan dan kekurangan metode analisis dengan HPLC.
4. Untuk mengetahui penerapan HPLC dalam analisis senyawa (obat) dalam campuran

III. Rumusan Masalah

1. Bagaimana penerapan HPLC dalam analisis senyawa (obat) dalam campuran?

4
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

I. Perkembangan Kromatografi

Kromatografi pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen yang

akan dipisahkan terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur yaitu fasa diam dan
fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat terlarut oleh suatu
proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu
diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu
menunjukkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul
atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti, 1998).
Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang
berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga
menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang
pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi. Penyelidikan
tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk
kromatografi padatan cair (LSC).
Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai
berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov
dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik
sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak
hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk
pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James
mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir
tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih
(Sudjadi, 1986).
Kromatografi cair kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan
dimana fase cair yang mengalir perlahan-lahan melewati kolom akibat gaya gravitasi dan terjadi
proses pemisahan di kolom tersebut. Metode itu dicirikan dengan efisiensi kolom yang rendah
dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik
kolom cair kembali dilirik dengan dikembangkannya sistem kolom bertekanan tinggi oleh
Kirchland dan Huber, yang mampu bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm -2 (3000p.s.i).
Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung
berukuran sekitar 30 nm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar
1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih
cepat) daripada dengan kromatografi cair yang biasa (Bassett et. all., 1994).
Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada
dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat
membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan
kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid

5
Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance =
Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed= Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah
berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan
kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian
membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini
dengan teknik yangsudah matang dan dengan cepat HPLC mencapai suatu keadaan yang
sederajat dengan kromatografi gas (Putra, 2004).
Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-
contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung
gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai
penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya
cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam. Secara
keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk
menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel
penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high
performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC
menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel
penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar,
2003).
HPLC telah digunakan di Indonesia sejak tahun 1997 oleh Wiadnyana dalam
penelitiannya yang bertema menguji dan menentukan kadar toksisitas berbagai macam
fitoplankton di perairan laut. Selain digunakan untuk uji toksisitas, dalam bidang Biokimia
HPLC kerap digunakan untuk menghitung kadar vitamin dan protein dari suatu makanan atau
sampel. Singkatnya, HPLC merupakan sebuah metode analisa modern yang multifungsi dan
sudah ada di Negara kita Indonesia. Oleh karena itu ijinkan penulis untuk bercerita sedikit
tentang High Perfomance Liquid Chromatography.

II. Pengertian HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada teknik
kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau
padat.
Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara simultan
beberapa analit dalam martiks sederhana maupun kompleks.
Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan kromatografi cair
sebagai suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah kromatografi cair
kolom modern, yang dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom menjadi
suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien.
Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan performa
kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil
dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada
kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya dalam
analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat
diintegrasikan dengan sistem kromatografinya.

6
 HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Chromatography, yaitu alat yang
berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan
partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak)
pada tekanan tinggi melalui kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat
tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah
grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.
         HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk
material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar
berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan
pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.Sampel yang akan
dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia
oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini adalah
mengetahui kadar asam organik.
      Banyak dari pengubahan tergantung dari sifat alami analit, fase diam, dan
fase bergerak. Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan
suatu karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan kecepatan
linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi, dan menghasilkan
chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-zat organik seperti
methanol. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus di-distruksi dulu kemudian di-
treatment sehingga berupa larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening, karena
syarat sampel yang dapat dianalisa menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan
harus bening.

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya dapat
digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila derivatisasi diperlukan
dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat
yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian
bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam
analisis.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode kromatografi lainnya,
antara lain :

a) Cepat :: waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan
sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang uncomplicated waktu analisis kurang dari 5 menit bisa
dicapai.
b) Resolusi tinggi :: berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT karena
pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.
c) Sensitivitas detektor :: detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-
detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).
d) kolom dapat digunakan kembali :: berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT
dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama
sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali untuk berbagai jenis sampel.
e) Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah :: zat-zat yang tidak bisa dianalisis dengan
KG karena terurai oleh suhu  tinggi atau volatilitasnya rendah dan dapat dianalisis secara KCKT.

7
f) Mekanisme pemisahan lebih variatif :: banyaknya pilihan fase gerak dan fase diam yang
digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak memungkinkan
terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.
g) Mudah rekoveri sampel :: umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga komponen sampel
tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor.
Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, KCKT memiliki
beberapa kelemahan, yaitu :
1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus
2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam
analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar.
Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak
stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan metode KG. Banyak senyawa yang
dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik
makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif
dikembangkan suatu fase pemisahan kiral yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif.
Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun
metode ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 obat / bahan obat karena hasil analisis
yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu analisis yang cepat.
Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:
1.                  Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis
2.                  Analisis ketidakmurnian (impurities)
3.                  Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
4.                  Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
5.                  Isolasi dan pemurnian senyawa
6.                  Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7.                  Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

III. Teknik Pemisahan dengan HPLC

Tehnik pemisahan dalam kromatografi melibatkan dua fasa, yakni fasa diam yaitu padat
atau cairan yang terikat pada padatan pendukung, dan fasa gerak yang berupa gas dan cair.
Proses pemisahan dalam kromatografi di dasarkan pada perbedaan laju migrasi masing- masing
komponen dalam sistem kromatografi. Perbedaan laju migrasi dari masing-masing komponen
merupakan akibat dari perbedaan keseimbangan distribusi masing-masing komponen diantara
fasa gerak dan fasa diam. Metode kromatografi dibedakan dalam beberapa macam, berdasar pada
fasa gerak, fasa diam, mekanisme, dan tehnik yang digunakan dan salah satu diantaranya adalah
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC).
Dalam kromatografi cair Kinerja tinggi ini fasa gerak yang digunakan berupa cairan,
sedangkan fasa diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada kolom tertutup
(melekat secara kimia dalam kolom tersebut). Maksud dan tujuan analisis dengan kromatografi
yaitu didapatnya pemisahan yang baik demikian halnya dalam HPLC diharapkan pemisahannya
baik dan dalam waktu proses yang relative singkat. Untuk mencapai Tujuan analisis ini, maka

8
dipilih pelarut pengembang yang sesuai dengan komponen yang dipisahkan, kolom yang
digunakan juga harus diperhatikan, dan detector yang memadai.
Parameter baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada lima factor, yaitu waktu
retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, resolusi, dan factor ikutan.
a.       Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu
komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat
konsentrasi maksimum.
b.      Faktor kapasitas (k’) juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika
nilai k’ kecil, maka komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k’ yang lebih
besar, maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan dan
puncaknya melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k’ optimum, yaitu antara 1 sampai 10.
Kolom dinyatakan baik jika cukup selektif artinya mampu menahan berbagai komponen
dengan kekuatan yang cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai
selektivitas (α) harus lebih besar daripada 1., dimana semakin besar nilai α maka
pemisahannya akan semakin baik. Nilai α dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa
gerak (misal: memperbesar polaritas); mengubah fasa diam; mengubah temperature, karena
pada umumnya kenaikan temperature akan memperkecil waktu retensi; dan mengubah
bentuk komponen.
c.       Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan dengan
hasil yang memuaskan dan dalam waktu yang singkat.
d.      Keterpisahan antara dua puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi ‘R’ (ukuran besar
kecilnya pemisahan). Jika nilai R ≥ 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik.
e.       Sedangkan factor terikutan (Tf) merupakan ukuran kesimetrisan suatu puncak. Dengan
catatan nilai Tf < 2,0.
Perkembangan HPLC berkembang dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke
arah yang lebih luas, yaitu proses pemisahan yang berasaskan afinitas. Filtrasi gel dan ion yang
berpasangan., akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan di dalam kolom disertai
pemakaian pelarut pengembangdengan tekanan tinggi (Ahmad dan Suherman, 1995).
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair– cair yang dapat digunakan baik
untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC
didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan
dengan luas atau area larutan standar. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan sejumlah
senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities);
analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic,
maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang
strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace
elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry.

IV. Prinsip Kerja Dari KCKT

Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut
terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom
kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase
diam.

V. Kegunaan KCKT

9
 Kegunaan umum KCKT adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik,
maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities) ; analisis senyawa-senyawa
tidak menguap (non-volatil) ; penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter
ion ; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir
sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element), dalam jumlah
banyak dan dalam skala proses industri. KCKT merupakan metode yang tidak dekstruktif dan
dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.

VI. Mekanisme Kerja KCKT

Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai
macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom,
kecepataan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel.
Instrumen KCKT pada dasarnya tersiri atas delapaan komponen pokok yaitu :
1.      Wadah fase gerak
2.      Sistem penghantaran fase gerak
3.      Alat untuk memasukkan sampel
4.      Kolom
5.      Detektor
6.      Wadah penampung buangan fase gerak
7.      Tabung penghubung
8.      Suatu komputer atau integrator atau perekam

1. Wadah fase gerak pada KCKT

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Sebelum menggunakan fase gerak harus
dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan
berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan
analisis. Pada saat membuat pelarut pada fase gerak maka sangat dianjurkan untuk menggunakan
pelarut, bufer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi xdan lebih terpilih lagi jika
pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat KCKT (HPLC grade).

2. Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi, yang ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.
Deret eluotrofik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan hal penting dalam
pemilihan fase gerak.
Adapun ciri-ciri yang harus dimiliki oleh fase gerak pada KCKT, yaitu :
1) Kemurnian tinggi (high purity), yaitu cairan eluen yang tidak terkontaminasi.
2) Kestabilan tinggi, yaitu eluen yang tidak bereaksi dengan sampel atau zat yang berfungsi
sebagai fase diam.
3) Kekentalan rendah, yaitu kerapatan eluen sekecil mungkin.

10
4) Dapat melarutkan sampel, tidak mengubah kolom dan sifat kolom serta cocok dengan
detektor.

Beberapa deret eluotropik KCKT :

Pelarut Beberapa deret Parameter kekuatan UV cut off (nm)

eluotropik KCKT : pelarut (partisi)
n-heksana 0,01 0,1 195
sikloheksana 0,04 -0,2 200
tetraklorometran 0,18 1,6 265

Nilai pemenggalan UV merpakan panjang gelombang  yang mana pada kuvet 1 cm,
pelarut akan memberi absorbasi lebih dari 1,0 satuan absorbansi. Sangat dianjurkan untuk
menggunakan panjang gelombang deteksi yang tidak bertepatan atau di sekitar panjang
gelombang pemenggalan UV pelarut yang digunakan sebagai fase gerak.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah
campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.Untuk pemisahan
dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut
hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut jenos alkohol.

3. Pompa
Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu pompa kinerja konstan (constant pressure)
dan pompa pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi
menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan
suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau
peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor
sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa
syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
Tujuannya adalah  untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara
tepat.Ada 2 jenis pompa KCKT yaitu : pompa dengan tekanan konstan dan pompa aliran fase
gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tekanan konstan.
Syarat – syarat pompa yang ideal:
a. Mampu membangkitkan tekanan tinggi
b. Pulse free – out put
c. Control laju alir yang akurat
d. Tahan korosi
e. Terbuat dari bahan yang tahan terhadap fasa gerak
f. Bebas pulsa
g. Perlu“de gasser”
h. Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar
i. Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien
j. Bekerja pada tekanan sampai 6000 psi (400 atm)

11
 Tiga jenis pompa yang sering digunakan dalam sistem KCKT yaitu :
1) Pompa Bolak-balik (reciprocating pump)
Jenis pompa yang paling banyak digunakan. Kelebihan pompa jenis ini adalah volume
internalnya kecil sekitar 35 – 400 μl, tekanan hingga 10.000 psi, kemampuan untuk adaptasi
menggunakan elusi gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas dari tekanan balik kolom dan
akibat dari kekentalan solven.
2) Pompa Sistem Penggantian (displacement pump)
Sistem penggantian menggunakan sebuah wadah besar seperti syringe dengan sebuah
penekan yang digerakan oleh motor. Menghasilkan aliran yang bebas tekanan balik, tidak
dipengaruhi kekentalan dan bebas denyut. Kekurangan pompa jenis ini adalah kapasitas pompa
terbatas hanya 250 ml dan cukup sulit saat solven harus mengalami penggantian.
3) Pompa Tekanan Udara (pneumatic pump)
Bentuk paling sederhana sebuah pompa pneumatik merupakan wadah yang ditekan oleh gas
bertekanan tinggi. Harga relatif murah dan bebas denyut merupakan kelebihan jenis pompa ini.
Kekurangannya terletak pada kapasitas terbatas, tekanan keluaran terbatas hanya sekitar 2000
psi, dipengaruhi oleh tekanan balik dan kekentalan solven dan tidak dapat digunakan untuk
sistem elusi gradien.

4. Injektor (penyuntikan sampel)

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fase gerak yang
mengalir dibawah tekanan meuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga
tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau
eksternal. Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana
mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama
halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).

Pada saat pengisian, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya
dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan katup diputar sehingga fase gerak mengalir
melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikkan dengan keluk
sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1 %. Penyuntikkan ini mudah digunakan untuk
otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada KCKT.
Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom. Waktu yang dibutuhkan oleh
senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagaiwaktu retensi. Waktu
retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan
ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki
waktu retensi yang berbeda.

12
 Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) kondisi dari
fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) komposisi
yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom 1. Elusi Gradien Elusi Gradien didefinisikan
sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung.
Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang
tertahan kuat pada kolom. Dasar- dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder. Elusi Gradien
menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak

5. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Perbandingan
kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :

Parameter Kolom konvensional Kolom mikrobor

Tabung kolom Stainless steel Stainless steel
Panjang 3,10,15,20 dan 25 cm Panjang 25 dan 50 cm
Diameter luar 0,25 inci Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 4,6 cm Diameter dalam 1 atau 2 mm

Fase diam Porous, silika ukuran kecil, Porous, silika ukuran kecil,
silika yang dimodofikasi silika yang dimodofikasi
secara kimiawi (bonded secara kimiawi (bonded
phase), atau polimer-polimer phase), atau polimer-polimer
stiren/divinil benzen.Rata-rata stiren/divinil benzen.Rata-
diameter partikel 3,5 atau rata diameter partikel 3,5
10µm dengan kisaran sempit. atau 10µm dengan kisaran
sempit
Tekanan operasional 500-3000 psi 1000-5000 psi
(35-215 bar) (70-350 bar)

Fase gerak Hidrokarbon+pelarut Hidrokarbon+pelarut

terklorinasi atau alkohol untuk terklorinasi atau alkohol
fase normal. Untuk fase untuk fase normal. Untuk
terbalik (reversed phase) fase terbalik (reversed phase)
digunakan metanol atau digunakan metanol atau
asetonitril + air atau asetonitril + air atau
bufer.Kecepatan alir : 1-3 bufer.Kecepatan alir 10-100
ml/menit µl/menit.Modifikasi
instrumen
Sistem penghantaran pelarut
yang mampu memberikan

13
 kontrol aliran di bawah
10µl/menit.Katup injeksi
sampekl bervolume kecil;sel
detektor bervolume kecil.

Kinerja Efisiensi meningkat dengan Sangat efisiensi dan sensitif,

bekurannya ukuran partikel akan tetapi lambat,konsumsi
fase diam, akan tetapi umur fase gerak hanya ¼ dari
kolom dengan ukuran partikel kolom konvensional.
3 µm lebih pendek

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibandingkan dengan kolom

konvensional, yakni :
1.      Konsumsi fase gerak mikrobor hanya 80% atau lebhi kecil dibandingkan dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100
µl/menit)
2.      Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.
3.      Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom
ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Kolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel, walaupun untuk tekanan
di bawah 600 psi kolom kaca dapat digunakan. Kolom untuk analisis KCKT memiliki ukuran
panjang kolom berkisar dari 10 – 30 cm berbentuk lurus dan jika diperlukan dapat disambung
dengan kolom yang lain. Diameter dalam kolom 4 – 10 mm dengan ukuran partikel 5 – 10 μm.
Kolom dari jenis ini mempunyai 40.000 hingga 60.000 lempeng/meternya.
Saat ini, pabrik pembuat kolom telah merancang dan memproduksi kolom dengan kecepatan
dan kinerja tinggi. Beberapa kolom hanya memiliki panjang 1 hingga 4,6 cm dengan ukuran
partikel 3 – 5 μm. Beberapa jenis kolom memiliki jumlah lempeng hingga 100.000 hanya dengan
panjang 3 sampai 7,5 cm dengan kelebihan pada kecepatan dan sedikitnya solven yang
diperlukan dalam pemisahan. Jumlah solven minimum menjadi pertimbangan penting karena
mahalnya solven dengan tingkatan kromatografi (chromatography grade).
Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair yaitu jenis pellicular dan partikel
berpori (porous particle). Jenis pellicular terdiri dari partikel dengan bentuk bola, tidak berpori
berbahan dasar gelas atau polimer dengan diameter 30 hingga 40 μm. Lapisan tipis berpori silika,
alumina, divinil benzen sintetis polystirena atau resin penukar ion dilapiskan pada
permukaannya.
Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel berpori dengan diameter partikel 3 –
10μm terbuat dari silika, alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena atau resin penukar
kation yang kemudian dilapisi lapisan tipis film berbahan organik sehingga berikatan secara
kimia atau fisika terhadap permukaannya. (Skoog et al., 1998)

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali
(reusable). Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis

14
sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan. Kolom diisi
dengan partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu cairan yang
berfungsi sebagai fasa diam. Komponen-komponen sample dibawa oleh cairan fasa gerak yang
dialirkan dengan bantuan tekanan tinggi melewati kolom fasa diam.
Komponen- komponen dipisahkan berdasarkan partisi antara fasa diam dan fasa gerak
yang satu sama lain tidak bercampur. Efisiensi kolom salah satunya sangat tegantung dari
besarnya partikel fase stasioner. Oleh karena itu bila ukuran fase stasioner lebih kecil, maka
tinggi plat teoritik akan berkurang, sehingga jumlah plat teoritik akan bertambah, yang
meningkatkan efisiensi kolom. Dengan kolom yang pendek dan efisiensi, pemisahan akan
berjalan dengan cepat.
Terdapat banyak analisis yang dikerjakan pada suhu kamar, suhu kolom sering dapat
diatur dengan konstan dengan memakai cara pemanasan. Sering dibutuhkan suhu kolom yang
lebih tinggi dari suhu kamar untuk mengatasi masalah daya larut solute yang dianalisis dan
viskositas fase gerak yang agak tinggi.

6. Fase diam
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
silika yang tidak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.Permukaan silika
adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).

Silika yang dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen yang akan
bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang stabil terhadap hidrolisis
karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang dimodifikasi ini mempu
karekateristik kromatografi dan selektifitas yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang
tidak dimodifikasi.

Oktadesil silika (ODS atau C18 )merupakan fase diam paling sering digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa denngan kepolaran yang rendah, sedang maupun tinggi.
Solut-solut yang polar, terutama yang bersofat basa akan mengekor (tailing peak) pada
penggunaan fase diam silika fase terikat. Hal ini disebabkan oleh adanya interaksi adsorbsi
antara solut-solut ini dengan residu silanol dan pengotor logam pada silika.Masalah ini dapat
diatasi dengan end-chapping  yakni proses menutupi residu silanol ini dengan gugus-gugus
trimetilsilil dan menggunakan silika dengan menggunakan silika dengan kemurnian yang tinggi
(kandungan logam <1ppm)

7. Detektor KCKT
Detektor pada KCKT dikelompokkan dalam 2 golongan yaitu : detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik dan tidak bersifat selektif) seperti
detektor indeks bias dan detektro spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang
hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti detektor UV-Vis, detektor
Fluoresensi dan elektrokimia.

Detektor ideal pada sistem KCKT mempunyai persyaratan :

15
1) Memiliki sensitifitas yang memadai. Kisaran umum sensitifitas berkisar dari 10 -8 hingga 10-
15
gram zat terlarut per pembacaan
2) Stabil dan memiliki keterulangan yang baik
3) Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi
4) Waktu respon yang singkat
5) Kemudahan pada penggunaan
6) Memiliki volume internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran puncak

Suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
2. Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil.
3. Stabil dalam pengoperasiannya
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8µl atau lebih kecil, sementara kolom
mikrobor selnya bervolume 1 µl atau lebih kecil lagi.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang
luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Beberapa jenis detektor yang digunakan pada sistem KCKT :

1) Detektor Absorban (UV-Vis)
Pada detektor absorban, aliran akan mengalir melalui detektor dari kolom kromatografi.
Untuk meminimalkan pelebaran puncak, detektor dirancang dalam volume yang sekecil
mungkin. Ukuran volume dibatasi 1 – 10 μl dengan panjang sel 2 – 10 mm. Umumnya sel
detektor mampu menahan tekanan hingga 600 psi sehingga peralatan pengurang tekanan
diperlukan sebelum aliran memasuki detektor.

2) Detektor Fluorescens
Detektor fluorescens yang digunakan sama halnya dengan detektor pada spektrofluoro-
fotometer. Detektor paling sederhana menggunakan lampu merkuri sebagai sumber cahaya dan
filter untuk mengisolasi panjang gelombang emisi radiasi. Lampu Xenon digunakan pada
instrumen yang lebih baik dengan gratting sebagai monokromatornya.

3) Detektor Refraktif Indeks

Detektor jenis ini bekerja dengan mengukur nilai indeks bias yang senyawa yang melalui sel.
Sel akan mengukur indeks bias solven fasa gerak sebagai blanko dan sampel secara bersamaan
untuk mendapatkan nilai indeks bias relatif.

4) Detektor Elektrokimia
Detektor dengan mendasarkan kerjanya pada pengukuran arus listrik. Perubahan arus akan
dideteksi terhadap waktu dan ditampakkan dalam bentuk kromatogram. Contoh penggunaan
detektor adalah pada penetapan senyawa tiol dan disulfida.

16
 5) Detektor Spektra Massa
Sejumlah fraksi kecil cairan dari kolom dimasukkan ke dalam spektrometer massa pada
kecepatan alir 10 – 50 μl per menit atau menggunakan termospray. Analat akan diionisasikan,
dipisahkan pada analisator, dibaca oleh detektor dan menghasilkan spektrum massa.

Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang
mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika
anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada
sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang
diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati
melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak
mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan
menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

VII. Jenis – Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

a. Kromatografi adsorbs
Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang
bersifat agak polar. Partikel-partikel silika atau alumina biasanya digunakan sebagai
adsorben. Jenis kromatografi ini menggunakan fasa gerak non polar seperti heksana dan
disebut jugakromatografi fasa normal.
b. Kromatografi partisi
Kromatografi partisi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa non polar.
Jenis kromatografi ini disebut dengan kromatografi fasa terbalik karena fasa geraknya
lebih polar daripada fasa diam. Salah satu kendala kromatografi ini adalah keterbatasan
selektivitas sebagai ketidakcampuran kedua fasa. Karena keterbatasan ini maka
kromatografi partisi tidak digunakan lagi sebagai teknik analisis rutin.
c. Kromatografi fasa terikat
Kromatografi fasa terikat merupakan teknik HPLC yang paling penting dan paling
banyak digunakan saat ini. Dalam hal penerapann kromatografi fasa terikat dan
kromatografi partisi memiliki persamaan. Akan tetapi, sorben fasa terbalik terdiri dari
partikel silika yang dimodifikasi secara kimia dengan rantai alkil sebaliknya, fasa diam
pada kromatografi partisi terdiri dari partikel yang dilapisi secara fisik dengan zat cair
non polar.
Keuntungan kromatografi fasa terikat, yaitu :
1) Merupakan fasa yang stabil
2) Kepolaran fasa gerak dapat diubah selama proses pemisahan berlangsung bila
kepolaran solut-solut bervariasi.
3) Kolom mempunyai umur panjang.
4) Memiliki keterulangan waktu retensi yang baik.

17
 5) Lebih ekonomis.

d. Kromatogarfi penukar ion

Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan campuran ion-ion atau
molekul-molekul yang dapat diionkan. Ion-ion bersaing dengan ion-ion fase gerak untuk
memperebutkan tempat berikatan dengan fasa diam. Dasar pemisahan kromatografi ini
berasal dari perbedaan afinitas senyawa bermuatan terhadap permukaan penukar ion.

e. Kromatografi ekslusi ukuran

Ukuran molekul merupakan kriteria utama dalam pemisahan dengan kromatografi
ekslusi ukuran. Pemisahan terjadi karena solut-solut berdifusi masuk dan keluar pori-pori
paking kolom. Molekul-molekul yang lebih besar dari diameter pori-pori akan melewati
kolom secara cepat dan dikenal dengan istilah volume terekslusi begitu pula sebaliknya.
Teknik ini berguna untuk mengkarakterisasi distribusi berat molekul polimer, pemurnian
cuplikan biologis dan pemisahan senyawa-senyawa dengan berat molekul 2000 atau lebih

Ada 3 sistem KCKT yang dikenal, yaitu:

1. Sistem elusi isokratik (isocratic elution)
Sampel diinjeksikan ke dalam kolom yang komposisi fasa geraknya tidak berubah
selama analisis dilakukan sampai sampel terelusi dari kolom, sistem isokratik yang
memiliki nilai k’ (rasio atau koefisien partisi yang bervariasi) akan menghasilkan
resolusi yang buruk dan sukar mendeteksi pita elusinya.
2. Sistem elusi gradient (gradient elution)
Ada perubahan fasa gerak baik secara bertahap atau berkesinambungan selama
proses berlangsung. Pada mula-mula elusi, seluruh komponen sampel ditahan di
bagian atas kolom, setelah gradien mulai, kekuatan elusi fase gerak akan meningkat.
Pada akhirnya harga k’ akan menjadi cukup kecil sehingga komponen zat tersebut
akan bermigrasi sepanjang kolom secara cepat sampai ia keluar dari kolom.

3. Sistem elusi bertahap

Baik digunakan untuk sampel yang mengandung komponen-komponen yang
bergerak cepat, yang diikuti senyawa-senyawa yang lambat gerakannya, tetapi tidak
mengandung senyawa dengan nilai k’ setelah sampai diinjeksikan. Komposisi fase
gerak secara bertahap diganti.
Hasil sistem KCKT dan optimasinya sangat tergantung pada beberapa hal, antara
lain :
a. Temperatur
b. Tekanan
c. Diameter partikel fase diam
d. Viskositas
e. Panjang kolom
.

18
VIII. Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid Chromatography
(HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis
terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat.
Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara
lain:
a.       Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran
b.      Mudah melaksanakannya
c.       Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
d.      Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis ü Resolusi yang
baik
e.       Dapat digunakan bermacam- macam detektor
f.       Kolom dapat digunakan kembali
g.      Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena
detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis.
h.      Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena HPLC
dilakukan pada suhu kamar.
i.         Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.
j.        Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik didihnya
sangat tinggi seperti polimer
k.      Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas
l.        Banyak pilihan fasa geraknya Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak
analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
m.    Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi
selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;
pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
n.      Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada
HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
o.      Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat.
p.      Detektor- detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram
(10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi,
Radiometri, dll, dapat juga digunakan dalam HPLC
q.      Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom
HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan
kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis
solven yang digunakan
r.        Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan
KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik.
HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.

19
s.       Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC tidak
menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu
komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector.
t.        Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion
memerlukan prosedur khusus.

Sedangkan kekurangannya adalah:

a.       Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu
b.      Hanya bisa digunakan untuk asam organic
c.       Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi
d.      Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

20
 BAB III

PEMBAHASAN

A.    Penerapan HPLC Dalam Analisis Senyawa (Obat) Dalam Campuran

HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat,
produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi.
Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC
dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat
kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh.

Penggunaan KCKT dalam bidang farmasi

Metode KCKT merupakan metode yang sangat populer untuk menetapkan kadar senyawa
obat baik dalam bentuk sediaan atau dalam sampel hayati .Hal ini disebabkan KCKT merupakan
metode yang memberikan sensitifitas  dan spesifitas yang tinggi. Berikut ini adalah beberapa
contoh penggunaan KCKT untuk analisis beberapa sediaan farmasi :

Obat (sediaan) Fase diam Fase gerak Detektor

Adriamisin (serum) C18 Asetonitril-asam Fluoresen

fosfat 0,01 N ph 2,3 EK : 465 nm
(50:50) EM : 580 nm

Aktinomisin C18 CH3CN-H2O (1:1) Elektrometer

(Serbuk)
Allopurinol (tablet) C18; 4 x 30 cm KH2PO4 0,05M; 1,5 UV 254 nm
ml/menit

1. Parasetamol:

  Nama Kimia        : 4- Hidroksiasetanilida

  Rumus Molekul   : C8H9NO2
  Berat Molekul      : 151,16
  Pemerian              : serbuk, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit.
  Kelarutan             : larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N, mudah larut
dalam etanol. (Depkes RI, 1995).

21
 Parasetamol atau N-asetil-p-aminofenol atau asetaminofen merupakan derivat para-amino
fenol yang berkhasiat sebagai analgesik-antipiretik. Asetaminofen merupakan pengganti yang
baik untuk analgesik dan antipiretik aspirin pada penderita dengan keluhan saluran cerna dan
pada mereka dengan perpanjangan waktu perdarahan yang tidak menguntungkan. Asetaminofen
merupakan analgetik dan antipiretis.

Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang
dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini
memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan
fasa gerak polar seperti methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui
saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa paruh plasma
antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol terikat
protein plasma. Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan antipiretik.

Pengujian kadar parasetamol dalam obat menggunakan teknik HPLC , dalam proses
analisisnya HPLC memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan menginjeksikan sampel uji yaitu
larutan obat yang sebelumnya telah disaring dengan membran PTFE ke dalam kolom HPLC
dengan injektor khusus / syringe yang bervolume 20 µL, penyaringan sebelum penginjeksian ini
dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom dan menghilangkan gas dari
pelarutnya. Sampel didorong cepat saat melalui kolom dengan bantuan pompa bertekanan tinggi.
Di dalam kolom, komponen- komponen pada sampel dipisahkan berdasarkan pada perbedaan
kekuatan interaksi solut terhadap fasa diamnya. Solut yang interaksinya kurang kuat akan keluar
lebih lambat dari kolom daripada solut lainnya. Komponen akan keluar dari kolom dengan
kecepatan yang berbeda dan terdeteksi oleh detektor. Detektor yang digunakan adalah detektor
UV karena parasetamol merupakan senyawa organik yang dapat menyerap sinar UV. Pengujian
ini menggunakan panjang gelombang 243 nm dengan mempertimbangkan panjang gelombang
methanol yaitu 205 nm dan air yaitu 190 nm. Teknik yang dilakukan kali ini merupakan “reverse
phase” atau fasa terbalik karena teknik ini menggunakan pelarut polar sebagai fasa gerak
sedangkan fasa diamnya menggunakan pelarut non- polar. Penggunaan fasa gerak dan fasa diam
yang berbeda kepolarannya ini bertujuan agar sampel uji tidak bereaksi dengan fasa diamnya
saat melewati kolom HPLC. Sampel melewati kolom HPLC tentunya memiliki jangka waktu
yang terukur dan juga menjadi parameter, waktu yang dibutuhkan sampel untuk melewati kolom
ini disebut waktu retensi. Dalam pengujian parasetamol dalam obat, waktu retensi yang terukur
adalah antara 2,19 hingga 2,2. Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini menghasilkan suatu
citra berupa kromatogram. Kromatogram ini merupakan grafik antara intensitas komponen yang
dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi. Seharusnya tampilan kromatogram ini berupa
grafik lurus, lancip, dan simetris. Tetapi data yang diperoleh pada percobaan ini sedikit melebar
dan tidak simetris tentunya. Ini disebabkan antara lain oleh adanya difusi didalam kolom HPLC,
difusi yang terjadi adalah difusi longitudinal dan difusi transfer massa. Difusi longitudinal itu
sendiri disebabkan oleh penyebaran komponen yang tidak sama sedangkan difusi transfer massa
disebabkan oleh kecepatan komponen yang tidak merata. Terdapat beberapa parameter
pemisahan dalam HPLC, yaitu laju alir eluen yaitu sebesar 0,5 mL/ menit, ketebalan stasioner
kolom C-18 yaitu 15 cm, ukuran partikel analit, dan laju difusi yang sudah disebutkan diatas.
Parameter- parameter ini dapat menyebabkan kejanggalan dalam pencitraan kromatogram seperti
pelebaran pada puncak. Adanya pelebaran puncak pada kromatogram mengindikasikan
terjadinya overlapping analit yang belum terpisahkan dalam kolom. Semakin tinggi laju
22
difusinya maka komponen dalam sampel akan semakin sulit dipisahkan secara efisien. Dari
grafik luas area terhadap konsentrasi (ppm) dapat dihitung kadar parasetamol dalam sampel obat.
Data yang diperoleh menunjukkan bahwa dari sampel obat sebanyak 12,5 mg diperoleh kadar
parasetamol sebesar 83,444 % sedangkan dari massa rata-rata tablet obat sebesar 738,2 mg
diperoleh massa parasetamol pada tiap tablet obat sebesar 615,9836 mg. Dapat disimpulkan
bahwa kadar parasetamol dalam tablet obat adalah sebesar 615,98 mg per tabletnya.

2. Kafein
Rumus struktur :
  Nama Kimia        : 1,3,7-Trimetil xantin
  Rumus Molekul   : C8H10N4O2
  Berat Molekul      : 194,19
  Pemerian              : serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat putih, biasanya menggumpal,
tidak berbau, rasa pahit.
  Kelarutan : Agak sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam kloroform, sukar
larut dalam eter. (Depkes RI, 1995).
Dalam penetapan kandungan kafein digunakan sampel berupa minuman berkafein. HPLC
yang digunakan adalh jenis HPLC Series 200 dengan detector 275 nm Perkin Elmer, Kolom :
Supelcosil LC : 18, ( 25 cm X 4,6mm, 5 μm ). Menggunakan asam asetat 70% dan methanol
30% sebagai fasa gerak. Proses pengerjaan terdiri dari 2 tahap, yaitu tahap preparasi dan tahap
injection ke HPLC.

II. ANALISIS KUANTITATIF

Metoda Persentase Tinggi / Lebar Puncak
Metoda ini disebut juga Metoda Normalisasi Internal. Untuk analisis kuantitatif
diasumsikan bahwa lebar atau tinggi Puncak (Peak) sebanding (proportional) dengan kadar /
konsentrasi zat yang menghasil puncak. Dalam metoda yang paling sederhana diukur lebar atau
tinggi Puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa setiap lebar atau tinggi Puncak
diekspresikan sebagai suatu persentase dari total). Hasil normalisasi dari lebar atau tinggi puncak
memberikan komposisi dari campuran yang dianalisis, seperti contoh pada Tabel berikut:

NO. Peak Area

Kafein standar Kafein dalam sampel
1 2601417,40 2216635,31

Berdasarkan data table diatas, maka kadar kafein dalam sampel ( teh poci ) dapat dianalisis
dengan mengunakan persamaan :
  Cx     = Ax / Ap X Cp

23
 = x 200 ppm
= 170,42 ppm
Maka dalam 1 mL sampel yang diuji terdapat 0,17042 mg kafein.
Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu:
Kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap
komponen muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada kromatogram. Komponen-
komponen dapat berkoelusi, atau ditahan di dalam kolom, atau, terelusi tanpa terdeteksi. Kita
harus mengasumsi bahwa kita memperoleh respons detektor yang sama untuk setiap komponen
Untuk mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor diperlukan.
Kafein berkhasiat menstimulasi SSP, dengan efek menghilangkan rasa letih, lapar dan
mengantuk, juga daya konsentrasi dan kecepatan reaksi dipertinggi, prestasi otak dan suasana
jiwa diperbaiki. Kofein juga memperkuat kontraksi jantung, vasodilatasi perifer dan diuretis.
Kofein digunakan sebagai penyegar. Zat ini sering dikombinasikan dengan Parasetamol atau
asetosal untuk memperkuat efek analgetisnya.
Kafein dosis sedang menyebabkan insomnia, ansietas dan agitasi. Dosis tinggi diperlukan
untuk memperlihatkan toksisitas berupa muntah dan konvulsi. Dosis letal sekitar 10 g (kira-kira
100 cangkir kopi) yang menimbulkan aritmia jantung. Kematian karena kafein sangat tidak
mungkin. Letargi, iritabel dan sakit kepala terjadi pada pengguna yang secara rutin minumg lebih
dari 600 mg kopi per hari ( sekitar 6 cangkir kopi per hari) dan mendadak berhenti. (Mycek,
2001).

24
 BAB III

PENUTUP
I. Kesimpulan
a. Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector,
pengolahan data.
b. Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawa-
senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam).
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk
hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Contohnya
adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam suatu campuran.
c. HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu menghasilkan
pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak
tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena
detector pada KCKT tidak merusak komponen zat yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan
instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi pemisahan. Sedangkan kekurangannya adalah
larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic,
harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya
mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

II. Saran
Penulis berharap kromatografi gas yang telah disajikan dalam bab isi dapat dijadikan
referensi ataupun tambahan wawasan bagi pembaca sehingga dapat membedakannya dan dapat
menerapkannya secara tepat dengan tujuan memajukan pendidikan di Indonesia.

25
 DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, M., dan Suherman 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press. Surabaya.
Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University Press.
Surabaya.
Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas Padjajaran. Bandung.
Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik,
Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Day, R.A dan Underwood, A.L., 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.
Khopkar, S.M., 2008, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.
Putra,Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Jurusan Farmasi
Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara :3
Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan.  Kanisius. Yogyakarta.

26