MAKALAH PRAKTEK INSTRUMEN FARMASI

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Disusun
Oleh :

Nama Kelompok/ NIM :

1. Adhella Vianka Yudhistiarani / PO. 71. 39. 1. 18. 001

2. Almuhibu Sakinah
3. Bella Mayasari
4. Dea Rahma Dewi
5. Debby Putri Milenia
6. Deva Puza Anggraini
/ PO. 71. 39. 1. 18. 002
/ PO. 71. 39. 1. 18. 003
/ PO. 71. 39. 1. 18. 004
/ PO. 71. 39. 1. 18. 005
/ PO. 71. 39. 1. 18. 006

Kelas : Reguler IIA

Kelompok : 1 ( satu )

Dosen Pembimbing : Vera Astuti, Apt, M.Kes

POLTEKKES KEMENKES PALEMBANG

JURUSAN FARMASI
TAHUN AKADEMIK 2018/2019
 DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI ............................................................................................................................ 2

BAB I ....................................................................................................................................... 3
PENDAHULUAN .................................................................................................................... 3
BAB II ...................................................................................................................................... 5
ISI 5
2.1. Pengertian ...................................................................................................................... 5
2.2. Prinsip Kerja .................................................................................................................. 7
2.3. Kegunaan Secara Umum ............................................................................................... 9
2.4. Komponen Alat ............................................................................................................. 9
2.5. Cara Kerja Alat ............................................................................................................ 17
BAB III ................................................................................................................................... 20
DISKUSI ................................................................................................................................ 20
BAB IV................................................................................................................................... 28
PENUTUP .............................................................................................................................. 28
DAFTAR PUSTAKA............................................................................................................. 29
 BAB I
PENDAHULUAN

Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan

berdasarkan partisi cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau
zat cair, dan fasa diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Kita biasanya
menganggap Tswett sebagai penemu kromatografi, yang pada tahun 1903
menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom kapur untuk memisahkan
pigmen dalam daun. Istilah ‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett untuk
menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan
dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk
suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya
merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui fase yang stasioner.
Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang
bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis
kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-
padat, cair-cair, dan gas-cair.
Pembahasan teknik kromatografi modern, baru lengkap bila disebut
kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom
klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase
cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi.
Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu
pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam
teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena
dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang
bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini
digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan ke
dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan
dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat)
daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang
tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas
penggunaannya dalam kimia organik.
 BAB II
ISI

2.1. Pengertian

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance

Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia
berdasarkan pada teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan
dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau padat.
Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis
secara simultan beberapa analit dalam martiks sederhana maupun kompleks.

Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan

kromatografi cair sebagai suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas.
KCKT adalah kromatografi cair kolom modern, yang dasarnya merupakan
pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan
yang cepat dan efisien.

Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan

peningkatan performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran
dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada
kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada kolom,
fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya
dalam analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi dengan
kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem kromatografinya.

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG),

keduanya dapat digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama
baiknya. Bila derivatisasi diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat
yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada
pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun
demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan
peranan lebih besar dalam analisis.
 KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode
kromatografi lainnya,

antara lain :

a) Cepat : waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang uncomplicated waktu
analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai.

b) Resolusi tinggi : berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada
KCKT karena pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.

c) Sensitivitas detektor : detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam

KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari
bermacam-macam zat. Detektor-detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat
mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).

d) kolom dapat digunakan kembali : berbeda dengan kolom kromatografi klasik,

kolom KCKT dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan
dengan kolom yang sama sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali
untuk berbagai jenis sampel.

e) Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah : zat-zat yang tidak bisa
dianalisis dengan KG karena terurai oleh suhu tinggi atau volatilitasnya
rendah dan dapat dianalisis secara KCKT.

f) Mekanisme pemisahan lebih variatif : banyaknya pilihan fase gerak dan fase
diam yang digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan
fase gerak memungkinkan terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.

g) Mudah rekoveri sampel : umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT

tidak menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa,
sehingga komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan
setelah melewati detektor.

Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi,

KCKT memiliki beberapa kelemahan, yaitu :
1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus

2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan

canggih dalam analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji
kemurnian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis
senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu
tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan metode KG. Banyak senyawa yang
dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai
senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan
obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral
yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif.

Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan

KCKT sangat mahal, namun metode ini tetap dipilih untuk digunakan
menganalisis 277 obat / bahan obat karena hasil analisis yang memiliki
akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu analisis yang cepat.

2.2. Prinsip Kerja

Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana
solut atau zat terlarut terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-
solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur
oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit
berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan
larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC
dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi
untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan
kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya)
akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya
terpisah.
 Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan
hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester <
golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.
HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses
kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan
melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan
standard umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal
lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang
sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum
3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat
yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen
yang dianalisis di dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada
system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa
jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa
carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang
khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat
(Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-,
polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh
pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap
selanjutnya adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam
bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak
yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai
kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling
bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan
perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini
dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap
diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi
biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat
aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.
2.3. Kegunaan Secara Umum

1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun

specimen biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

2.4. Komponen Alat

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase

gerak (Reservoir) , pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi),
kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer
atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi
cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini :
1 . Wadah fase gerak (Reservoir)
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah
ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase
gerak sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang
ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu
detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya
terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan
berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan
oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-
komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase
gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase Gerak
Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen
atau pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen
campuran campuran menuju detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan
solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu
faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

Persyaratan fase gerak HPLC:

1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan
dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang
dapat mengganggu interpretasi kromatografi.
3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak
beracun.
5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi
Poise).
6. Sesuai dengan detector.

Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak:

a) HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan
fase gerak non-polar. Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau
trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fase gerak
yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.
b) HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan
fase gerak polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau
asetinitril.
Fase gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’ pada rentang yang
sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan
fase gerak yang memberikan k’ antara 2-5.

2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus
inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah
gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan
sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan
preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak
 dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa
dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran
fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan
sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan
konstan.

Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:

a) Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan
cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa
gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka
bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju
maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di
ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.
b) Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang
dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga
menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik
kolom dan viskositas pelarut.

c) Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa
jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan
kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir
bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.

3. Tempat Injeksi
 Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan
dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi.
Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel
volume (misalnya 20 – 500 μL).

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem
tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi
di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b) Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan
pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-
70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut
Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum
injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi
volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan
menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan
secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja
atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam
kolom.

Syarat- syarat injektor yang baik :

- Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit
mungkin
- Mudah digunakan
 - Keberulangan tinggi
- Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

4. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam
untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :
Parameter Kolom konvensional Kolom mikrobor
Tabung Stainless steel Stainless steel
kolom Panjang 3,10,15,20 dan 25 Panjang 25 dan 50 cm
cm Diameter luar 0,25 inci
Diameter luar 0,25 inci Diameter dalam 1 atau 2 mm
Diameter dalam 4,6 cm
Fase diam Porous, silika ukuran kecil, Porous, silika ukuran kecil, silika
silika yang dimodofikasi yang dimodofikasi secara
secara kimiawi (bonded kimiawi (bonded phase), atau
phase), atau polimer- polimer-polimer stiren/divinil
polimer stiren/divinil benzen.Rata-rata diameter
benzen.Rata-rata partikel 3,5 atau 10µm dengan
diameter partikel 3,5 kisaran sempit.
atau 10µm dengan
kisaran sempit.
Tekanan 500-3000 psi 1000-5000 psi
operasio (35-215 bar (70-350 bar)
nal

Fase gerak Hidrokarbon+pelarut Hidrokarbon+pelarut terklorinasi

terklorinasi atau alkohol atau alkohol untuk fase normal.
untuk fase normal. Untuk fase terbalik (reversed
Untuk fase terbalik phase) digunakan metanol atau
 (reversed phase) asetonitril + air atau
digunakan metanol atau bufer.Kecepatan alir 10-100
asetonitril + air atau µl/menit.Modifikasi instrumen
bufer.Kecepatan alir : 1- Sistem penghantaran pelarut yang
3 ml/menit mampu memberikan kontrol
aliran di bawah
10µl/menit.Katup injeksi
sampekl bervolume kecil;sel
detektor bervolume kecil.
Kinerja Efisiensi meningkat dengan Sangat efisiensi dan sensitif, akan
bekurannya ukuran tetapi lambat,konsumsi fase
partikel fase diam, akan gerak hanya ¼ dari kolom
tetapi umur kolom konvensional.
dengan ukuran partikel 3
µm lebih pendek.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding

dengan kolom konvensional, yakni:
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas
misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Fase Diam
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi
secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren
dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena
 adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara
kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-
reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan
gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling
banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan
kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang
lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika
aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang
tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu
retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang
digunakan.

5. Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:
detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat
spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis,
detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai

berikut:
a. mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
b. mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada
kadar yang sangat kecil;
c. stabil dalam pengopersiannya;
d. mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita;
e. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis linier);
f. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Karakteristik detector HPLC:
Dasar Jenis Maksimum Peka terhadap Sensitivitas
Pendeteksi sensitifit kecepatan suhu
an as alir
Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah
Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah
Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah
Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 0 C
Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% 0C
Spektometri Umum 10-10 Tidak Tidak ada
massa
elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% 0C

2.5. Cara Kerja Alat

Diagram alir HPLC

1. Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan
mengharapkan bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar.
Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi
gas (jika anda telah mempelajarinya).

2. Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom
menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur
berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan
ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.
Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan
bergantung pada:

 Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari
pelarut)
 Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga
pada ukuran partikel)
 Komposisi yang tepat dari pelarut
 Temperatur pada kolom
Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda
menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-
senyawa.

3. Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati
kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu
penggunaan serapan ultra-violet.
Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa
panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang
keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda
akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.
Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa
tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran
 mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut
menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan
sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.
Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan
air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran
metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang
gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang
salah dari pelarut.

Cara kerja penggunaan Alat HPLC :

1. Sampel yang larut dalam fase gerak diinjeksikan ke dalam kolom kromatografi
dengan menggunakan syringe.
2. Volume yang ditampung adalah 0,2 ml, juk berlebih akan dikeluarkan.
3. Fase gerak akan dialirkan dengan menggunakan pompa.
4. Sampel yang masuk dalam kolom akan didorong oleh fase gerak sehingga zat-
zat yang terkandung dalam sampel akan dianalisis dan bereaksi dengan fase
diam.
5. Kemudian oleh detektor akan dibaca dan dihasilkan keluaran berupa grafik dan
data tinggi beserta luas puncak dalam bentuk angka.
 BAB III
DISKUSI

Notulen : Feli Sabila

1. Siti Qurota Akyuni Reg.2b

 Fase normal dan fase terbalik apakah alat yang digunakan sama?
Jawaban :
(Ilsa Nabila Reg.2b)
Fase normal dan fase terbalik adalah penggunaan alat yang berbeda. Bedanya
terletak pada kolom yang digunakan.
 Apa yang membuat fase terbalik lebih unggul?
Jawaban :
(Meinia Reg.2b)
- Lebih mudah digunakan
- Dapat diaplikasikan untuk molekul dalam range yang luas
- Lebih banyak pilihan kromatografi yang membolehkan
- Mengkontrol dari berbagai tipe solvent-organik, konsentrasi dan pH
- Molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom
 Sebutkan senyawa apa saja pada fase normal dan fase terbalik?
Jawaban :
(Meilin Fadilah Reg.2b)
- Fase Normal, contonya :
1. Molekul-molekul hidrofobik (fasa diam)
2. Pelarut-pelarut organik (non polar)
- Fase Terbalik, contonya :
1. Molekul-molekul hidrofilik (fasa diam)
2. Molekul-molekul polar

2. Ratika Reg.2b

 Sampel apa saja yang dapat digunakan dialat ini? Apakah sampe terseut
harus memiliki kriteria yang sesuai dengan fase geraknya?
Jawaban :
(Yoriza Afriola Reg.2b)
Komposisi eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada 2
macam eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan
pelarut polar untuk fase balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni metanol.
3. Oktarisa Reg.2a

 Perbedaan dari masing-masing detektor tersebut dan masing-masing

detektor tersebut digunakan pada kondisi seperti apa?
Jawaban :
(M.Aldino Putra Reg.2a)
1. Detektor spektrofotometrik
Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara
luas. Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang
yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi
berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik, sel sample yang
biasa akan digantikan dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen kolom
guna menembus berkas sample dari peralatan tersebut.
2. Detektor Fluorometrik
Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis
yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus
di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan
memanfaatkan sebuah sumber kontinyu dan monokromator, biasanya penyaring-
penyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran
pada foto detektor sambil menahan radiasi eksitasinya. Suatu contoh yang paling
terkenal adalah pendeteksian asam-asam amino pada tingkat subnanogram setelah
reaksi dengan reagen fluoresamin (fluorescamin).
3. Detektor Elektrokimia
Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik
(konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya
digunakan untuk mendeteksi solute-solut yang dapat mengalami reaksi redoks
baik senyawa organic maupun anorganik. Pendeteksian jenis ini telah digunakan,
misalnya untuk neurotransmitter dan metabolisme mereka di dalam ekstra selular
dari jaringan otak hewan percobaan, senyawa-senyawa seperti dopamin,
norepinefrin, serotonin dan asam homovanilik menghasilkan arus oksidasi pada
elektroda karbon mirip yang diberi potensial +0,60 V vs. Sebuah elektroda
referensi perak-perak klorida. Elektroda referensi pada umumnya melewati
semacam jembatan garam.
4. Tharissa Reg.2b

 Apakah sama prinsip kerja HPLC yang menggunakan gas sebagai fase
gerak dengan prinsip HPLC yang mengguanakan zat cair sebagai fase
gerak? Jika sama, sebutkan contoh prinsip HPLC yang menggunakan gas
sebagai fase gerak?
Jawaban :
(Titis Nadhira Reg.2b)
Sumber yang kami dapat mengatakan bahwa KCKT teknik fase geraknya
berbentuk cairan. Jika fase geraknya gas maka teknik yang digunakan adalah
kromatografi gas.

5. Shafa Reg.2b

 Ada 2 jenis kolom pada HPLC, yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Apa perbedaan HPLC yang menggunakan kolom konvensional
dengan yang menggunakan kolom mikrobor?
Jawaban :
(Yuli Agustia Reg.2b)
- Kinerja dibuat tabel adalah efesiensi meningkat dengan bekurangna ukuran
partikel fase diam, akan tetapi umur kolom dengn partikel 3 um lebih pendek.
Kolom konvensional sangat efisiensi dan sensitif, akan tetapi lambat, konsumsi
fase gerak hana ¼ dari kolom konvensional.
- Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan
kolom konvensional, yakni :
1. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hana 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fafse
gerak lebih lambat (10-100ul/menit)
2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih
ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
3. sensivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya
jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis. Meskipun demikian, dalam praktekna, kolom mikrobor ini tidak setahan
kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
6. Sri Ismawati Reg.2b

 Pada prinsip kerja HPLC, interaksi apa yang terjadi? Suatu senyawa yang
lebih kuat akan bertahan dan sebaliknya? Jelaskan
Jawaban :
(Melisyah Meliana Reg.2a)
Di dalam kolom terjadi pemisahan senyawa-senyawa dalam kolom akan keluar
atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan
interaksi antara senyawa terhadap fase diam. Senyawa-senyawa yang kurang kuat
interaksinya dengan fase diam akan keluar terlebih dahulu, dan sebaliknya
senyawa yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan keluar lebih lama.
 Adakah aplikasi jenis selain windows NT workstation version 4.00 yang
digunakan untuk membaca data hasil pengukuran HPLC?
Jawaban :
(Kurniati Munzilah Reg.2b)
Setiap perangkat keras computer ataupun system operasi computer untuk setiap
teknisi berbeda beda. Dalam pengukuran HPLC telah dirancang menggunakan
Windows NT workstation version 4.00 yang mana lebih mempermudah untuk
teknisi ilmiah. Sementara sebagai contoh untuk teknisi Arsitektur menggunakan
system operasi computer yang berbeda dengan system operasi computer untuk
ilmiah. Seperti tombol F8 dalam hplc tombol tersebut digunakan untuk
memberhentikan kerja dari hplc, sementara untuk teknisi lain bias saja untuk
membesarkan volume suara perangkat.
 3 jenis injeksi mana yang paling sering digunakan dan kenapa?
7. Sabila Gustiharda Reg.2a

 Kromatografi HPLC ini digunakan untuk mengukur apa saja? Berikan

contoh penggunaan metode kromatografi cair (HPLC) pada bidang
farmasi/kesehatan?
Jawaban :
(Mealdry Dwie Almira Reg.2a)
Salah satu contoh penggunaan metode HPLC pada bidang farmasi yaitu dengan
pengujian kadar parasetamol dalam obat. Diawali dengan menginjeksi larutan
obat dengan injektor, kemudian sampel didorong cepat saat melalui kolom
dengan bantuan pompa bertekanan tinggi. Didalam komponen-komponen pada
sampel dipisahkan berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi solute
terhadap fase diamnya, solute dengan interaksi kuat akan keluar terlebih dahulu
kemudian akan dideteksi dengan detektor. Pada analisa ini menggunakan detektor
UV, hal ini dikarenakan parasetamol merupakan zat organik yang dapat
menyerap UV. Selanjutnya analisa ini akan menghasilkan kromatografi berupa
peak.
(Khoirun Nisak Reg.2a)
Kegunaan umum HPLC antara lain : pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidakmurnian (impurities);
analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non volatil); penentuan
molekul-molekul netral, ionil, maupun zwitter ion; serta isolasi dan pemurnian
senyawa.

8. Almuhibu Sakinah Reg.2a

 Adakah pompa dan injeksi yang memang mempunyai satu kinerja (atau
memang sepasang) atau satu fungsi yang sama?
Jawaban :
(Oka Selviana Reg.2a)
Tidak, karena ada 2 jenis pompa HPLC yaitu pompa dengan tekanan konstan dan
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Dalam HPLC pompa yang
digunakan harus pompa bertekanan tinggi agar dapat mendorong fase gerak
dalam reservoi menuju kolom fase diam dan melewati detektor.
9. Elsa Septina Reg.2b

 Apa yang dimaksud dengan mekanisme pemisahan yang lebih variatif?

Jawaban :
(Zafira Fathya Reg.2a)
Mekanisme pemisahan lebih variatif : banyakna pilihan fase gerak dan fase diam
yang digunakan serta besarna interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak
memungkinkan teradina pemisahan dengan berbagai mekanisme.
10. Devia Lestari Reg.2b

 Jelaskan bagian-bagian alat dan fungsinya serta proses apa yang terjadi
pada alat tersebut?
 Jelaskan dengan bahasa kalian konsep dan prisnsip kerja dari HPLC?
 HPLC adalah pemisah analit molekul berdasarkan kepolaran, komponen
apakah yang dianalisis oleh HPLC?
Jawaban :
(Siska Oktari Reg.2a)
Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan
setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan
dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif).
Analisa kualitatif bertujuan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia
dari analit dalam suatu sanple. Sedangkan analisa kuantitatif untuk mengetahui
jumlah dan konsentrasi analit tesebut dalam sample.x.
 Jenis zat apa yang dalam analisisnya harus menggunakan HPLC?
Jawaban :
(Yoriza Afriola Reg.2b)
Komposisi eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada 2
macam eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan
pelarut polar untuk fase balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni metanol.
 Jenis analisa apa yang paling ditekankan pada HPLC kualitati/kuantitatif?
Alasannya?
Jawaban :
(Meilin Fadhilah Reg.2b)
Metode ini tidak menitik beratkan pada salah satu pihak antara hasil analisa
kualitatif dan analisa kuantitatf. Karena secara kualitatif HPLC dapat melihatkan
penimpanan waktu (RT) dan specturn 3D dari signal kromatogram dan secara
kuantitatif dapat mengetahui kadar komponen yang dianalisi dalam sampel.
 Wadah fase gerak berupa kaca, bisakah wadah tersebut terbuat dari kaca
adakah dampak yang ditimbulkan jika wadah bukan dari kaca?
Jawaban :
(Widyan Reg.2b)
Kaca dipakai di berbagai percobaan laboratorium / eksperimen / alat alat
laboratorium karena kaca sendiri bersifat inert , atau sukar bereaksi, namun ada
beberapa bahan lain yang dipakai, namun tidak se efisien kaca , yang spesifiknya
adalah kaca borosiklat (borosiclate glass).
 Pada saat digeser terjadi penekanan udara, apa dampak yang akan terjadi
jika dalam analisa HPLC jika udaranya tidak hilang sempurna?
 Fase gerak seperti apakah senyawa zat cair/gas yang dapat digunakan
sebagai fase gerak dalam HPLC?
Jawaban :
(Puput Oktarina Reg.2b)
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tidak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki viskositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan “sample recovery”
7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable
price)
Contoh pembuatan fasa gerak

Sebanyak 420 mL KH2PO4 0,01 , ditambahkan metanol20 mL, ditambahkan

asetonil 30mL, ditambahkan isopropil alkohol 30mL, disaringmengguanakan
membran whatman filter PTFE 0,2 um, disonikasi selama 30 menit.
11. Fitri Reg.2b

 Coba jelaskan kembali cara kerja video tersebut dengan bahasa kalian
sendiri yang mudah dipahami?
Jawaban :
(Widyan Reg.2b)
Video tersebut sudah cukup jelas, dan sudah dijelaskan selama presentasi
 Mengapa HPLC termasuk kromatografi kolom?
Jawaban :
(Widyan Reg.2b)
HPLC termasuk kromatografi kolom karena fungsi HPLC itu berprinsip atas
kromatografi kolom, kromatografi kolom itu sendiri adalah metode yang
digunakan untuk memurnikan bahan kimia tunggal dari campurannya, atau fase
diam dan fase gerak.

12. Sisi Kurnia Reg.2b

 Cara Pemurnian dari HPLC di ppt kalian coba jelaskan?

Jawanban :
(Rheini Dwi Reg.2b)
Maksudnya dari pemurnian itu bukan memurnikan suatu sampel tapi sampel yang
kita ukur ingin dianalisis itu mengetahui kadar kemurnianna dalam obat atau zat
aktif tersebut misal kita mau menganalisis atau mengetahui kadar kemurnian
paracetamol kita ukur pakai alat HPLC ternyata saat tampil dilayar monitor yang
dideteksi oleh detektor kadar parasetamol dalam obat 100% jadi disimpulkan
kadar Paracetamol itu 100% murni. Dan misalkan juga kita mau menganalisis
kadar etanol 96% ternyata saat di layar monitor yang telah di deteksi oleh
detektor kadar etanol 70% jadi dapat disimpulkan bahwa etanol tersebut tidak
sepenuhnya murni mungkin terkontaminasi bahan lain.
 BAB IV
PENUTUP

 Kesimpulan
Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient,
kolom, detector, pengolahan data.

a. Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah

pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat
fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). HPLC sering digunakan
antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk
hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam
sediaan farmasi. Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan
kafein dalam suatu campuran.
b. HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa
keuntungan yaitu menghasilkan pemisahan yang sangat cepat, dapat
memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan
panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk mendapatkan
kembali cuplikan, karena detector pada KCKT tidak merusak
komponen zat yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan instrumen
lain untuk meningkatkan efisiensi pemisahan. Sedangkan
kekurangannya adalah larutan harus dicari fase diamnya terlebih
dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus mengetahui
kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi,
harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian
yang terbatas.
 DAFTAR PUSTAKA

Day, R.A dan Underwood, A.L., 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga,
Jakarta.

Khopkar, S.M., 2008, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.

Putra,Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang

Farmasi. Jurusan Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Sumatera Utara

Ahmad, M., dan Suherman 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University

Press. Surabaya.

Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga
University Press. Surabaya.