Isolasi dan Pemurnian Protein

Amin Fatoni, Ph.D

Isolasi Protein dari Sel

Sel mengandung ribuan protein
Prosedur pemurnian harus membedakan protein yang
diinginkan dari protein yang lain
Sifat protein merupakan kunci dalam merancang protokol
pemurnian

Sifat Protein
Muatan disebabkan oleh rantai samping COO- dan
NH3+
Berat molekul protein bervariasi
Titik isoelektrik, pI, pH ketika muatan total protein nol
Jika protein dengan pI tertentu berada dalam larutan
dengan pH tertentu, maka:
pH < pI < pH
Net +++

Net ---

Sifat protein
Protein dapat dipisahkan karena perbedaan
Kelarutan
Ukuran
Muatan
binding specificity (affinity)
Sifat hidrofobik/hidrofilik

Proporsi protein tertentu, misalnya enzim

Prosedur umum isolasi protein dari sel

Metode umum
Sel

Lisis

Osmosis
Freeze/Thaw
French press
Grinding glass beads
Sonication (bakteri)

Sentrifugasi
Pelet

Supernatan

Debris sel

Protein terlarut

Isolasi Protein

Metode sentrifugasi diferensial

Sample diputar,
setelah lisis (sel
pecah), to
memisahkan sel utuh,
inti sel, organel,
partikel tidak larut,
protein, dll
Perbedaan kecepatan
menentukan
perbedaan ukuran
yang terpisahkan

Salting Out
Protein yang sudah dipisahkan dari sel dapat
dimurnikan berdasarkan kelarutannya (muatan total,
kekuatan ion, polaritas)
Ammonium sulfate (NH4SO4) biasanya digunakan
untuk pemisahan salt out
air tertarik ke garam tersebut, kelarutan protein
menurun karena interaksi antar protein meningkat
Garam yang digunakan pada berbagai konsentrasi
untuk memisahkan berbagai protein yang berbeda
kelarutannya ( misalnya 30, 40, 50, 75%)
Salah satu fraksi mengandung protein yang diinginkan

Kromatografi kolom
Dasar kromatografi
Pemisahan berdasarkan perbedaan fasa, fasa diam
dan fasa bergerak

Interaksi protein dan fasa

Fasa berbeda sifat

2 fasa:

Fasa diam (Stationary): protein berinteraksi dengan

fasa ini
Fasa gerak (Mobile): bergerak diatas fasa diam,
membawa sampel yang sifatnya sama

Kromatografi kolom

Filtrasi Gel (Size-Exclusion / Gel-Filtration)

Memisahkan Molekul berdasarkan ukurannya.

Fasa diam merupakan gel yang berikatan silang.

Gel berpori sesuai dangan ukuran Molekul yang
dipisahkan
Molekul kecil masuk ke pori-pori, tinggal lebih lama di
dalam kolom, Molekul besar tidak dapat masuk ke
pori-pori, akan melewati kolom lebih cepat.

Size Exclusion/Gel-filtration (Contd)

Kromatografi afinitas
Menggunakan prinsip dasar ikatan spesifik protein terhadap
ligand, misal albumin vs anti-albumin (antibody)
Fase diam berikatan dengan ligand tersebut, untuk mengikat
protein yang diinginkan

Kromatografi Penukar Ion

Berdasarkan muatan total protein
(kurang spesifik disbanding afinitas)
Penukar kation
Penukar anion

Elektroforesis (Electrophoresis)
Prinsip- Partikel bermuatan bergerak di medan listrik,
berlawanan dengan muatannya
Perbedaan pergerakan protein karena:
Muatan

Ukuran
Bentuk

Pemisahan asam nukleat menggunakan agarosa

Pemisahan protein menggunakan akrilamida

Elektroforesis
Polyacrylamide akan menahan protein berukuran
besar lebih lama
Protein ditabah detergen (SDS) sodium dodecyl
sulfate muatan total negative pemisahan akan
menjadi tergantung ukuran protein
Protein kecil akan bergerak lebih cepat (baik ukuran
maupun muatan)

Isoelectric Focusing
Isolectric focusing- based on differing isoelectric pts.
(pI) of proteins
Gel is prepared with pH gradient that parallels electricfield. What does this do?

Charge on the protein changes as it migrates.

When it gets to pI, has no charge and stops

Primary Structure Determination

How is 1 structure determined?

1) Determine which amino acids are present (amino

acid analysis)
2) Determine the N- and C- termini of the sequence
(a.a sequencing)
3) Determine the sequence of smaller peptide
fragments (most proteins > 100 a.a)
4) Some type of cleavage into smaller units necessary

Primary Structure Determination

Protein Cleavage
Protein cleaved at specific sites by:

1) Enzymes- Trypsin, Chymotrypsin

2) Chemical reagents- Cyanogen bromide

Enzymes:
Trypsin- Cleaves @ C-terminal of (+) charged side
chains
Chymotrypsin- Cleaves @ C-terminal of aromatics

Peptide Digestion

Cleavage by CnBr
Cleaves @ C-terminal of INTERNAL methionines

Determining Protein Sequence

After cleavage, mixture of peptide fragments produced.

Can be separated by HPLC or other chromatographic

techniques
Use different cleavage reagents to help in 1 determination

Peptide Sequencing
Can be accomplished by Edman Degradation
Relatively short sequences (30-40 amino acids) can
be determined quickly
So efficient, today N-/C-terminal residues usually not
done by enzymatic/chemical cleavage

Peptide Sequencing