REVIEW JURNAL PRAKTIKUM BIOANALISIS PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE KCKT-SM UNTUK PENETAPAN DEXCHLORPHENIRAMINE MALEATE DALAM PLASMA

Disusun Oleh: Wanda Indriani Wibowo Kenny Ryan Limanto Bernadetta Arum Wijayanti Rachelia Octavia Johanes Putra Wicaksono Dina Christin Jenny Marina 098114003 098114006 098114007 098114008 098114010 098114015 098114016

KELOMPOK A1

LABORATORIUM BIOANALISIS FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2011

REVIEW JURNAL Kromatografi Kromatografi merupakan teknik analisis yang paling sering digunakan pada analisis senyawa dalam sediaan farmasi maupun cairan biologis. Berdasarkan alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi menjadi empat, antara lain: (a) kromatografi kertas; (b) kromatografi lapis tipis; (c) kromatografi cair kinerja tinggi; dan (d) kromatografi gas. Dalam penelitian ini akan dibahas lebih lanjut tentang kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) yang juga dikenal sebagai HPLC (High Performance Liquid Chromatography) (Gandjar, 2010). Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam. Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok yaitu: (1) wadah fase gerak, (2) sistem penghantaran fase gerak; (3) alat untuk memasukkan sampel; (4) kolom; (5) detektor; (6) wadah penampung buangan fase gerak; (7) tabung penghubung, dan (8) suatu komputer atau integrator atau perekam (Gandjar, 2010). Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS atau alternatif KC-SM) adalah teknik kimia analisis yang menggabungkan kemampuan pemisahan fisik dari kromatografi cair (KCKT) dengan kemampuan analisis (detektor) spektrometer massa. LC-MS adalah teknik yang banyak digunakan untuk berbagai aplikasi yang memiliki sensitivitas dan spesifisitas sangat tinggi. Pada umumnya aplikasi LC-MS berorientasi pada deteksi dan identifikasi potensi spesifik suatu senyawa terhadap keberadaan senyawa lainnya (dalam campuran yang kompleks).

Pendahuluan Pada penelitian ini, dilakukan pengembangan dan validasi metode analisis KC-MS yang sederhana, spesifik, cepat, sensitif untuk menetapkan kadar chlorpheniramine maleate (RS-CPM) dalam plasma manusia. Tujuan dari penetapan kadar obat dalam plasma adalah mengetahui bioavailabilitas dan bioekivalensi dari suatu obat.

Gambar 1. Struktur Dexchlorpheniramine maleate

Dexchlorpheniramine maleate (RS-CPM) atau yang dikenal juga sebagai 3-(4-chlorophenyl)-N,N-dimethyl-3-(2-pyridyl) propylamine monomaleate

merupakan obat antihistamin yang poten. Dalam penggunaannya, CPM banyak digunakan untuk meringankan gejala penyakit tertentu, seperti demam dan alergi. Struktur dari CPM yang mempunyai atom C kiral yang mengakibatkan CPM terdapat dalam bentuk sinister (berotasi berlawanan arah jarum jam) dan rectus (berotasi searah jarum jam). Berdasarkan penelitian yang ada, CPM yang mempunyai aktivitas farmakologi adalah S-CPM (dextrorotatory S-enantiomer). Di dalam Farmakope Eropa III (European Pharmacopoeia III), metode KCKT dapat digunakan untuk menentukan kemurnian dari S-CPM, dimana kadar S-CPM maksimum yang diijinkan dalam sampel yang diuji sebesar 2% b/b. Dari studi farmakokinetika yang telah dilakukan, diketahui bahwa kadar CPM dalam plasma sangatlah rendah, yaitu berada pada level maksimal konsentrasi sebesar 6,2 ng/mL dan 7,0-8,2 ng/ mL untuk pemberian oral dengan dosis tunggal 2 mg dan 4 mg. Dari penelitian terdahulu, banyak metode yang dapat digunakan untuk menetapkan kadar RS-CPM, antara lain GC (Gas Chromatography), GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry), dan KCKT (High Performance Liquid Chromatography). Pada penelitian ini, dilakukan pengembangan dan validasi metode analisis KCKT-MS yang sederhana, spesifik, cepat, sensitif untuk menetapkan kadar SCPM dalam plasma manusia. Pengembangan dari metode ini digunakan untuk menetapkan kadar S-CPM dalam plasma setelah pemberian dosis tunggal tablet yang mengandung S-CPM sebanyak 6 mg pada subjek uji pria yang sehat. Dari

metode ini, dipeoleh nilai LOQ sebesar 1,0 ng/ mL dengan waktu pengerjaan selama 5 menit.

Gambar 2. Struktur Simvastatin (STA)

Alat dan Bahan Dalam penelitian ini, standar S-CPM yang digunakan mempunyai kemurnian 99,67%. Standar internal simvastatin (STA) yang digunakan mempunyai kemurnian 98,44%. Perlu ditambahkan standar internal sebagai faktor koreksi sebab zat analit yang diuji memiliki konsentrasi yang sangat kecil dalam sampel (plasma). Pemilihan simvastatin sebagai standar internal dikarenakan alasan sebagai berikut: 1. terpisah sempurna dari peak senyawa yang dianalisis dan peak lain, 2. memiliki waktu retensi yang mirip dengan sampel, 3. tidak terdapat dalam sampel awal, 4. dapat me-mimic analit disetiap tahap preparasi sampel, 5. tidak harus memiliki kemiripan secara kimiawi dengan analit dan 6. stabil dan tidak bereaksi dengan sampel atau fase gerak. Ada berbagai macam cairan biologis yang dapat digunakan, meliputi darah, serum, plasma, urin, keringat, saliva, empedu, air susu dan air mata. Cairan biologis yang digunakan dalam penelitian ini merupakan plasma. Perbedaan plasma dan serum adalah pada plasma diberikan antikoagulan (berupa heparin), sedangkan pada serum tidak. Pemilihan plasma sebagai sampel biologis

disebabkan karena protein (yang mengikat obat) dalam plasma tidak mengendap sehingga obat masih berada di dalam plasma dan dapat diukur kadarnya. Untuk pembuatan larutan stok S-CPM dan standar internal (STA), analit dilarutkan dengan asetonitril sehingga dihasilkan larutan dengan konsentrasi 1000 g/ mL. Asetonitril digunakan sebagai pelarut S-CPM dan standar internal supaya kedua analit yang akan ditetapkan kadarnya berada dalam bentuk bebas sehingga bersifat lebih non-polar, dapat larut dalam pelarut organik dan dapat dipisahkan dari protein (senyawa endogen). Senyawa endogen harus dipisahkan dari larutan uji supaya tidak mengganggu kinerja alat yang digunakan. Senyawa endogen (seperti protein) memiliki ukuran yang besar sehingga dapat menyumbat kolom dan mengganggu pembacaan serapan yang dihasilkan. Larutan stok sekunder dan kerja dibuat dengan cara mengencerkan larutan stok dengan campuran pelarut air: asetonitril (50:50 v/v). Larutan stok kerja yang telah dibuat digunakan untuk membuat kurva baku dan uji kontrol kualitas dari sampel yang akan ditetapkan kadarnya. Pada percobaan ini, kurva kalibrasi digunakan untuk melihat adanya korelasi antara respon yang dihasilkan (AUC) dan konsentrasi, dimana semakin tinggi konsentrasi maka AUC yang dihasilkan akan semakin besar juga. Kurva kalibrasi dibuat dengan delapan seri konsentrasi larutan baku S-CPM dalam rentang 1,0 150,0 ng/mL. Kontrol kualitas sampel berfungsi sebagai kontrol dalam validasi metode analisis untuk sampel. Kontrol ini dilakukan dengan cara menambahkan S-CPM yang diketahui konsentrasinya ke dalam blanko plasma. Sampel kemudian dihomogenkan dengan vortex dan disimpan pada suhu -70 2oC. Sampel disimpan pada suhu rendah (-70 2oC) supaya terjadi inaktivasi enzim yang mungkin terdapat di dalam plasma. Enzim tersebut dapat mendegdradasi obat yang akan diuji. Sampel disiapkan dengan cara ekstraksi cair-cair. Sebanyak 0,5 mL alikuot plasma darah manusia dicampur dengan 0,1 mL larutan standar kerja internal (STA dengan konsentrasi 2500,0 ng/ mL) dan ditambahkan sebanyak 1,0 mL buffer borat dengan pH 9,00, lalu dicampurkan. Tujuan penambahan buffer borat dengan pH 9,00 adalah agar CPM berada dalam suasana basa sehingga CPM lebih

mudah larut dalam pelarut organik yaitu etil asetat sedangkan protein masuk ke dalam fase air. Larutan tersebut dihomogenkan dengan vortex dan diekstraksi dengan menggunakan etil asetat sebanyak 3 x 2 mL dengan tujuan untuk memperoleh pemisahan yang sempurna. Tidak dilakukan dalam satu kali ekstraksi karena dikhawatirkan masih ada CPM yang belum terlarut dalam etil asetat. Diambil fase etil asetat karena senyawa yang akan ditetapkan kadarnya memiliki kelarutan yang besar pada etil asetat (lapisan atas). Larutan yang terdapat pada lapisan atas diuapkan sehingga diperoleh residu. Residu tersebut kemudian

dilarutkan dalam fase gerak dengan volume yang kecil untuk memperoleh konsentrasi yang lebih pekat. Hal ini dikarenakan sampel yang digunakan dalam penelitian ini merupakan trace analysis sample, dimana kmsentrasi sampel yang akan ditetapkan kadarnya sangat kecil sehingga perlu dilakukan pemekatan.

Instrumentasi Alat Pada analisis Dexchlorpheniramine maleate dalam plasma darah digunakan instrumen berupa Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan detektor spektrometer massa. Penggunaan KCKT didasarkan pada pemisahan yang relatif baik, cepat, sensitif, dan spesifik dibandingkan dengan Kromatografi Cair (KC) karena KCKT merupakan teknik pemisahan yang diberikan tekanan tinggi. Kombinasi Kromatografi Cair - Spektrometer Massa (KC-SM) memiliki beberapa kelebihan yaitu: 1. dapat digunakan untuk menganalisis molekul obat dan metabolitnya dengan BM yang rendah maupun tinggi, 2. SM memberikan identifikasi yang baik sebagai detektor pada KCKT karena bobot molekul merupakan salah satu determinasi yang spesifik untuk tiap molekul dan jika informasi ini digabungkan dengan strukturnya, dapat memberikan identifikasi yang baik 3. SM memiliki selektifitas yang tinggi terkait dengan kemampuannya dalam identifikasi dan

4. selektifitas SM digunakan untuk menandai standar internal dan analit, ditambah dengan sensitifitas, akurasi, dan presisi determinasi kuantitatif yang baik. Fase gerak yang digunakan pada penetapan kadar S-CPM yaitu metanol:amonium asetat (90:10) dengan kecepatan aliran 0,5 mL/ menit. Dalam percobaan ini, waktu pengerjaan yang dibutuhkan hanya enam menit. Hal ini dikarenakan dalam waktu enam menit, standar dan sampel sudah terpisah dengan baik. Pemilihan fase gerak disesuaikan berdasarkan kepolaran analit yang akan dianalisis. Kecepatan alir yang digunakan adalah 0,5 mL/ menit karena pada kecepatan alir tersebut diperoleh pemisahan yang baik. Hal ini ditandai dengan resolusi peak yang dihasilkan lebih besar dari 1,5.

Pengembangan Metode Hal ini bertujuan untuk mengembangkan dan memvalidasi metode uji yang sederhana, cepat, dan sensitif untuk melakukan kuantifikasi S-CPM. Metode ini cocok untuk menentukan farmakokinetika dari suatu senyawa uji. Untuk mencapai tujuan tersebut, diperlukan optimasi ekstraksi sampel, deteksi parameter dan kromatografi. Larutan standar S-CPM dianalisis menggunakan KC-SM dengan sistem injeksi langsung yang kemudian diperiksa dengan bantuan ESI dan APCI. Berdasarkan data spektra massa yang diperoleh, berat molekul untuk SCPM adalah 274,9.

Gambar 3. Spektra massa hasil pemisahan

Dalam KCKT, tujuan dari optimasi fase gerak adalah untuk mendapatkan resolusi peak yang baik dan simetris baik analit dan standar internal (SI). Prinsip pemisahan pada KCKT adalah molekul yang terlarut dalam fase gerak akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah dengan kolom. Dengan demikian, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan kepolaran dan pergerakan pada kolom. Fase gerak yang akan dioptimasi adalah amonium asetat, asam asetat, atau kombinasi dari keduanya pada konsentrasi yang berbeda. Dari hasil penelitian, diperoleh bahwa campuran dari asetonitril-air (mengandung 10 mL amonium asetat dan 0,5% asam asetat) (90:10 v/v) dapat digunakan sebagai fase gerak. Hal ini dikarenakan komposisi fase gerak tersebut memberikan pemisahan yang baik. Junlah buffer yang ditambahkan (amonium asetat dan dioptimasi untuk mempertahankan bentuk peak asam asetat) perlu jumlah buffer

karena

mempengaruhi derajat ionisasi dan fragmentasi spektrometer massa.

saat dideteksi dengan

Selain itu perlu dilakukan optimasi kolom dan setelah dilakukan pembandingan terhadap beberapa jenis kolom, maka digunakan kolom Phenomenex (Luna)-ODS (100x4,6 mm, i.d. 5 m) dengan flow rate 0,5 mL/ menit untuk dapat menghasilkan bentuk peak yang baik dan waktu proses yang diijinkan adalah selama 2 menit. Ekstraksi pada tahap preparasi sampel sangat mempengaruhi hasil pemisahan dan deteksi dari spektometer massa. Hal ini dikarenakan adanya pengotor dapat menyumbat kolom dan bahan yang mudah menguap dapat mengganggu saat deteksi. Oleh karena itu dilakukan optimasi dengan menggunakan enam macam pelarut organik, antara lain dietil eter, etil asetat, heksana, diklorometan, kloroform, dan butil metil eter, serta campuran dari pelarut-pelarut organik tersebut dengan kombinasi dan rasio yang berbeda. Dari hasil optimasi, etil asetat menghasilkan kromatogram yang paling baik sehingga etil asetat digunakan sebagai pelarut untuk mengekstraksi sampel.

Gambar 4. Kromatogram hasil pemisahan pada blangko

Validasi Penetapan kadar S-CPM dalam sampel plasma yang diambil dari sukarelawan dilakukan pada kondisi kromatografi yang optimal. Parameter validasi seperti akurasi, presisi (keterulangan dan reprodusibilitas), linearitas dan rentang, sensitivitas (LOD dan LOQ), robustness, stabilitas, selektifitas/ spesifitas dan uji kesesuaian sistem perlu dievaluasi terlebih dahulu. Hasil dari validasi ditunjukkan pada tabel berikut :

Tabel 1. Studi presisi S-CPM dari hasil pengukuran (ng/ mL)

Larutan baku yang telah ditambahkan dengan standar internal, blanko tanpa penambahan standar internal, blanko dengan penambahan standar internal, kurva kalibrasi, uji kualitas kontrol sampel dianalisis dan direkam kromatogramnya. Fase gerak yang digunakan untuk penelitian memberikan pemisahan yang baik antara sampel, standar internal dan senyawa endogen. Dari kromatogram yang dihasilkan tidak tampak adanya gangguan pada waktu retensi sampel dan standar internal.

Gambar 5. Kromatogram hasil pemisahan matriks biologis (plasma)

Akurasi Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi ini dinyatakan dengan persen (%) perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Akurasi harus diukur dengan menggunakan minimal lima determinasi per konsentrasi dan minimal tiga konsentrasi dalam kisaran konsentrasi yang diharapkan adalah dianjurkan. Nilai rata-rata harus berada dalam jarak 15% dari nilai yang sebenarnya kecuali pada LLOQ, di mana seharusnya tidak menyimpang lebih dari 20%. Deviasi rata-rata dari nilai yang sebenarnya berfungsi sebagai ukuran akurasi (Anonim, 2001). Kisaran batas akurasi harus berada dalam rentang linier. Akurasi khas dari pemulihan zat obat dalam campuran harus sekitar 98-102%. Nilai-nilai keakuratan data di luar rentang pemulihan harus dipertimbangkan (Anonim, 2001). Sedangkan menurut Mulja dan Hanwar, akurasi untuk kadar obat yang besar adalah sebesar 95-105% dan untuk bioanalisis rentang 80-120% masih bisa diterima (Mulja dan Hanwar, 2003). Pada penelitian ini, akurasi dari metode ini ditentukan oleh recovery relatif dan absolut (Tabel 1). Nilai persentase recovery absolut S-CPM berkisar antara 89,06% sampai 91,32 dan nilai recovery relatif berkisar antara 88.07 % sampai 91,33%. Apabila penelitian ini mengikuti parameter dari Chan, maka penelitian ini dapat dikatakan belum memiliki akurasi yang baik sebab Chan dalam bukunya

10

menyebutkan bahwa akurasi zat obat dalam campuran harus berada dalam range antara 98-102%. Namun berbeda apabila penelitian ini mengikuti parameter dari Mulja dan Hanwar karena dalam bukunya, Mulja dan Hanwar mengatakan bahwa akurasi untuk bioanalisis dalam rentang 80-120% masih dapat diterima dimana akurasi yang dalam penelitian ini dinyatakan dalam persen recovery masih masuk dalam range tersebut baik recovery absolut maupun untuk recovery relatifnya.

Presisi Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang-ulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen (Harmita, 2004). Presisi dinyatakan dalam koefisien variasi (KV). Suatu metode dapat dikatakan baik apabila memiliki KV <2% (Harmita, 2004). Akurasi harus diukur dengan menggunakan minimal lima determinasi tiap konsentrasi dan minimal tiga konsentrasi dalam kisaran konsentrasi yang diharapkan. Nilai rata-rata harus berada dalam jarak 15% dari nilai yang sebenarnya kecuali pada LLOQ, dimana seharusnya tidak menyimpang lebih dari 20%. Deviasi dari rata-rata dari nilai yang sebenarnya berfungsi sebagai ukuran akurasi (Anonim, 2001). Pada penelitian ini, digunakan tiga macam konsentrasi dalam sampel yaitu 25, 75, 125 ng/ mL. Hasil ini dapat dikatakan sudah memiliki presisi yang cukup baik apabila mengikuti parameter yang disebutkan oleh Harmita karena % CV yang terdapat pada penelitian ini rata-rata kurang dari 2%, hanya satu sampel yang memiliki konsentrasi lebih dari 2% yaitu sampel pada kondisi long-term stability dengan % CV = 2,07. Dapat disimpulkan bahwa metode yang dikembangkan cukup akurat dan dapat dipercaya.

11

Tabel 2. Uji stabilitas S-CPM pada plasma

Spesifisitas Spesifisitas atau selektivitas suatu metode adalah kemampuan yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan (Harmita, 2004). Spesifisitas metode ini diuji sebanyak enam kali, dimana blanko plasma yang telah ditambah dengan standar dan sampel dibandingkan dengan kromatogram dari larutan baku. Dari hasil yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa metode ini bersifat selektif. Hal ini dikarenakan kromatogram yang dihasilkan tidak mengalami gangguan waktu retensi akibat adanya senyawa endogen pada matriks biologis yang digunakan.

Linearitas Linearitas merupakan kemampuan suatu metode (pada rentang tertentu) untuk mendapatkan hasil uji yang berupa variasi data (misal: absorban, luas area

12

kromatogram) yang secara langsung proporsional terhadap konsentrasi analit di dalam sampel (Anonim, 2007). Menurut International Conference on Harmonisation (ICH), rentang linearitas yang baik adalah + 20% dari konsentrasi nominal. Untuk memperoleh rentang tersebut, paling tidak digunakan lima tingkat konsentrasi. Dalam penelitian ini, linearitas menunjukkan bahwa metode yang digunakan linear dalam rentang konsentrasi S-CPM yang spesifik. Kurva kalibrasi diplotkan antara respon faktor dan konsentrasi larutan standar. Linearitas ditemukan pada rentang 1 sampai 150 ng/mL. Kurva kalibrasi dibuat selama 11 hari yang berbeda dari 4 minggu untuk menentukan variabilitas slope dan intersep.

Tabel 3. Hasil analisis statistik studi bioekuivalensi dari sampel dan standar dexchlorpheniramine maleat.

Dari tabel 3, terlihat bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan dari slopes dan intercepts yang melewati rentang konsentrasi optimum.

Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantititation (LOQ) LOD adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat diukur pada kondisi percobaan tertentu tetapi tidak perlu secara kuantitatif. Penentuan LOD pada metode instrumental didasarkan pada signal to noise ratio yaitu dengan cara membandingkan hasil pengukuran analit yang telah diketahui konsentrasinya terhadap respon blanko. Konsentrasi analit yang mampu memberikan respon 2-3 kali respon blanko inilah yang kemudian ditetapkan sebagai LOD. Penentuan LOD dapat pula didasarkan pada standar deviasi yang diperoleh dari pengukuran sejumlah blanko yang kemudian dikalikan dengan faktor sebesar dua atau tiga (Anonim, 1995). LOQ adalah konsentrasi terendah dari analit dalam sampel yang masih dapat dikuantifikasi dengan presisi dan akurasi yang baik pada kondisi percobaan tertentu dari suatu metode. LOQ merupakan parameter uji kuantitatif untuk senyawa berkadar rendah dalam sampel yang mengandung bahan-bahan lainnya

13

seperti bahan pengotor dalam serbuk obat dan hasil degradasi dari suatu produk obat jadi. Penentuan LOQ pada metode instrumental biasanya didasarkan pada standar deviasi yang diperoleh dari pengukuran sejumlah blanko yang kemudian dikalikan dengan suatu faktor sebesar sepuluh (Anonim, 1995). Lower Limit of Quantification (LLOQ) adalah jumlah terkecil dari analit dalam sampel yang dapat dikuantifikasi dan memberikan akurasi dan presisi yang baik. LLOQ menunjukkan sensitivitas dari metode tersebut dimana pada konsentrasi standar terendah akan memberikan koefisien variasi < 20%. Standar terendah pada kurva kalibrasi dapat diterima sebagai LLOQ jika kondisi berikut terpenuhi: 1. Respon analit (LLOQ) harus minimal lima kali respon blanko. 2. Peak analit (respon) harus dapat diidentifikasi dan memiliki keterulangan yang berbeda, dengan presisi kurang dari 20% koefisien variasi (CV) dan akurasi 80 sampai 120%. Dalam penelitian ini ditemukan batas deteksi (LOD) sebesar 0,25 ng/ mL dan batas kuantifikasi (LOQ) sebesar 1,00 ng/ mL untuk S-CPM. Hasil ini menunjukkan bahwa metode yang dikembangkan sensitif. LOD dan LOQ dipengaruhi oleh kondisi pemisahan (kolom, reagen, dan instrumentasi dan data sistem), perubahan instrumen (misalnya sistem pompa dan detektor) dan

penggunaan pelarut yang bukan grade KCKT dapat menghasilkan perubahan dalam signal-to-noise ratio.

Kekasaran (Ruggedness) dan Ketahanan (Robustness) Kekasaran merupakan tingkat reprodusibilitas hasil yang diperoleh di bawah kondisi percobaan yang beragam dan diekspresikan sebagai persen relative standar deviation (% RSD). Kondisi-kondisi ini meliputi laboratorium, analis, alat, reagen dan waktu percobaan yang berbeda. Kekasaran dapat diketahui jika metode telah digunakan berulang kali. Strategi untuk menentukan kekasaran suatu metode akan bervariasi tergantung pada kompleksitas metode dan waktu tersedia untuk melakukan validasi. Penentuan kekerasan metode dapat dibatasi oleh kondisi-kondisi percobaan yang kritis, seperti pengecekan pengaruh kolom

14

kromatografinya yang berbeda (pabrik dan jenisnya sama) atau pengaruh operasional metode pada laboratorium yang berbeda (Gandjar, 2010). Ketahanan merupakan kapasitas metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh adanya variasi parameter metode yang kecil. Ketahanan dievaluasi dengan melakukan variasi parameter-parameter metode seperti: persentase pelarut organik, pH, kekuatan ionik, suhu dan sebagainya. Ketahanan suatu metode dievaluasi dengan cara membuat variasi parameter-parameter penting dalam metode tersebut secara sistematis lalu mengukur pengaruhnya pada pemisahan (Gandjar, 2010). Dalam penelitian ini tidak ada perubahan yang signifikan dalam parameter kromatografi yang diamati (operator, instrumen, reagen dan kolom dari jenis yang sama) dan kondisi optimum (pH, rasio fase gerak dan aliran) yang berubah.

Uji Stabilitas Uji ini digunakan untuk memastikan bahwa sampel, reagen dan baku yang digunakan stabil pada waktu tertentu supaya diperoleh hasil-hasil analisis yang reprodusibel dan reliabel. Stabilitas sampel plasma yang telah di-spiking dengan baku, diuji freeze-thaw cycles (sebanyak tiga kali siklus); stabilitas jangka pendek dan panjang pada suhu kamar dalam tiga hari dan dalam empat minggu pada suhu -70oC. Hasil dari percobaan dapat diperlihatkan pada tabel 2. Untuk larutan standar, stabilitas dari larutan diuji pada suhu kamar dan keadaan membeku dalam waktu enam minggu dan empat minggu. Hasil rerata konsentrasi yang diperoleh dari hasil pengukuran dibandingkan dengan teoritisnya. Dari hasil tersebut, dapat disimpulkan bahwa sampel dapat disimpan dalam keadaan beku untuk satu bulan tanpa mengalami degradasi. Sampel stabil pada jangka pendek dan larutan sampel dapat disimpan pada suhu kamar tanpa mengalami degradasi.

Uji Kesesuaian Sistem Uji kesesuaian sistem bertujuan untuk menjamin bahwa suatu metode dapat menghasilkan akurasi dan presisi yang dapat diterima (Gandjar, 2010). Uji

kesesuaian sistem dapat dilihat dari efisiensi kolom (jumlah plat teoritis), nilai

15

resolusi dan simetrisitas dari puncak yang dihasilkan. Dari hasil percobaan, diperoleh jumlah plat teoritis sebesar 18432 hingga 22987 dan nilai resolusinya sebesar 2,46. Nilai plat teoritis yang besar tersebut menunjukkan bahwa pemisahan memiliki efisiensi yang baik karena nilai resolusi yang diperoleh lebih dari 1,5. Hal ini menunjukkan pemisahan yang dihasilkan telah mencapai base line. Hasil ini digunakan untuk mengevaluasi kesesuaian dari sistem yang digunakan untuk menetapkan kadar S-CPM. Dari hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa metode yang digunakan ini telah mempunyai akurasi, presisi, selektivitas dan linearitas yang baik untuk penetapan kadar S-CPM dalam plasma dan dapat digunakan untuk mengetahui bioavailabilitas dan bioekivalensi dari obat tersebut.

Aplikasi dalam pengembangan metode Metode penetapan kadar dari CPM dalam plasma ini digunakan untuk studi bioekivalensi pada obat. Obat yang tak berlabel, untuk dua kali pemakaian, untuk pemakaian dua periode, dosis tunggal yang dibandingkan antara sampel yang mengandung 6 mg CPM dan standar. Pengujian bioekivalensi dari obat dilakukan pada laki-laki yang sehat, dewasa dan memenuhi standar GCP (Good Clinical Practice) dan aturan FDA. Studi ini dilakukan pada 24 orang pria yang sehat dan umurnya di antara 18-45 tahun. Sampel darah dari sukarelawan diambil sebanyak 6 mL sebelum pemberian dosis, pada saat 0,5; 1,0; 1,5; 2; 3; 4; 6; 8; 12; 18; 24 jam setelah pemberian obat. Sampel yang diperoleh disimpan dalam wadah yang mengandung natrium sitrat sebagai antikoagulan dan disentrifugasi selama 3000 rpm selama 15 menit dan pada suhu 15oC. Plasma yang ada kemudian disimpan pada tube yang telah dilabeli. Kemudian sampel disimpan dalam freezer pada suhu -705oC hingga dianalisis dengan metode KC-SM yang telah divalidasi. Parameter farmakokinetika yang dianalisis antara lain konsentrasi maksimal obat dalam plasma (Cmax), waktu saat obat pada konsentrasi maksimal (Tmax), AUC dari konsentrasi obat dalam plasma sebelum diberikan obat hingga waktu pengukuran terakhir (AUC0-t), AUC konsentrasi obat dalam plasma sebelum diberikan obat hingga obat habis terabsorbsi (AUC0-), kecepatan eliminasi dan

16

waktu paruh eliminasi obat. Berdasarkan hasil uji statistik dengan taraf kepercayaan 90%, disimpulkan Cmax, AUC0-t dan AUC0- yang kemudian dibandingkan dengan standar, bioekivalensi dari obat mempunyai rentang dari 80,0-125,0% untuk Cmax, AUC0-t dan AUC0-. Rerata (SD) konsentrasi dari konsentrasi obat maksimal dalam plasma dari standar sebesar 22.1150 (4.4148) ng/ mL dan untuk obat yang diuji sebesar 25,3421 (2,0605) ng/ mL.

Tabel 4. Profil farmakokinetika dari hasil pengujian.

Daftar Pustaka Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 2001, Analytical Method Validation and Instrument Performance Verification, John Wiley and Sons, Inc., New Jersey, pp. 118-120. Anonim, 2007, The United States Pharmacopeia, Edisi 30, United States Pharmacopeia Convention, Inc., USA Gandjar, I.G., 2010, Kimia Farmasi Analisis, Penerbit Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 466-472. Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi dan Cara Perhitungannya, http://jurnal.farmasi.ui.ac.id/pdf/2004/v01n03/harmita010301.pdf, diakses tanggal 1 November 2011 Mulja, M., dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-prinsip Cara Berlaboratorium yang Baik (Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Indonesia Airlangga, Vol. III, No. 2, Universitas Airlangga Press, Surabaya, pp. 71-76.

Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences Summer 2007: 3(3): 161-170 www.ijps.ir

Original Article

Development and Application of a Validated Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Method for the Determination of Dexchlorpheniramine Maleate in Human Plasma
Aravindaraj Joghee Rajua,*, Gopinath Rama, Rajan Sekara, Mahesh Kumar Siddaiahb, Nanjan Moola Jogheeb, Suresh Bhojrajc
aCADRAT,

Keywords: Bioequivalence; Dexchlorpheniramine maleate; LC-MS. Received: February 5, 2007; Accepted: April 11, 2007.

1. Introduction Chlorpheniramine maleate (RS-CPM) (3(4-chlorophenyl)-N,N-dimethyl-3-(2-pyridyl) propylamine monomaleate) (Figure 1) is a highly potent and widely used antihistaminic drug. It has been widely used for symptomatic relief of common colds and allergic diseases. Its activity is predominantly attributed to the dextrorotary S-enantiomer [1]. The European Pharmacopoeia III describes an HPLC method for the determination of the enantiomeric purity of dexchlorpheniramine maleate (S*Corresponding author: Aravindaraj joghee Raju, Senior Research Associate, CADRAT, JSS College of Pharmacy, Rocklands, Ootacamund - 643 001, India. Tel (+91)423-2447135; Fax (+91)423-2447135 Email: dr_aravindraju@yahoo.co.in

ch

ive

Abstract A convenient liquid chromatographic-single Quadrupole mass spectrometric (LC-MS) method was developed and validated for dexchlorpheniramine maleate (INN name: chlorphenamine) determination in human plasma. The need for just a single liquid-liquid extraction with ethyl acetate and being highly sensitive were the advantages of this method. The linearity was also excellent over the range of 1 to 150 ng.ml-1 of dexchlorpheniramine maleate concentration. The method was statistically validated for its selectivity, linearity, precision and robustness. This method was successfully applied to the analysis of chlorpheniramine maleate in clinical studies.

Ar

of

CPM), allowing the presence of 2% (m/m) of R-enantiomer in the tested sample. Pharmacokinetic studies have revealed that plasma chlorpheniramine concentrations in humans are low, for example, the maximum levels of 6.2 and 7.0-8.2 ng/ml after a single oral administration of 2 and 4 mg [2]; and 5.8-11.3 and 3.9 ng/ml after a 4 and 2.67 mg administration, respectively. Some devised methods have been reported to determine human plasma RS-chlorpheniramine by using gas chromatography (GC), gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and high-performance liquid chromatography (HPLC) [3-9]. This paper describes development and

SI

JSS College of Pharmacy,bTIFAC CORE, JSS College of Pharmacy, cPrincipal, JSS College of Pharmacy, Rock lands, Ootacamund, India

www.SID.ir

AJ Raju et al./ IJPS Summer 2007; 3(3): 161-170

Ar
Figure 1. Structure of dexchlorpheniramine and simvastatin.

ch
162

ive

2. Materials and methods 2.1. Chemicals and reagents The reference standards of S-CPM (purity: 99.67%) and STA (purity: 98.44%) were obtained from M/s, Orchid pharmaceuticals (Chennai, India) and Cadila Pharma (Ahmedabad, India). Highly purified water was prepared in-house using a Milli-Q water purification system obtained from Millipore (India) Pvt. Ltd. (Bangalore, India). Gradient grade methanol and acetonitrile were

of

SI

2.3. Sample preparation A 0.5 ml aliquot of human plasma sample was mixed with 0.1 ml of the internal standard working solution (2500.0 ng.ml-1 of STA) and 1.0 ml of borate buffer of pH 9.00 were added and mixed. The resulting solution was vortexed and extracted by ethyl acetate (32 ml). The upper organic layer was separated, evaporated and the drug was reconstituted using 0.5 ml of the mobile phase and analyzed.

validation of a simple, specific, rapid and sensitive liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) method for the determination of S-CPM in human plasma with a limit of quantification (LOQ) of 1.0 ng/ml for S-CPM during a 5.0 min. run time, using simvastatin (STA) (Figure 1) as an internal standard. In addition, this method was applied to S-CPM quantification of a single dose administration of tablets containing 6 mg of S-CPM in a crossover bioequivalency study of S-CPM in healthy male human subjects.

purchased from E. Merck Ltd. (Mumbai, India). Ammonium acetate and formic acid were purchased from Qualigens Fine Chemicals (Mumbai). Drug free (blank) heparinized human plasma was obtained from the local Nursing hospital (Ootacamund, India) and was stored at (-) 20 C prior to use. 2.2. Calibration curves The stock solutions of S-CPM and internal standard were prepared in acetonitrile at free base concentration of 1000 g.ml -1 . Secondary and working standard solutions were prepared from stock solutions by dilution by water:acetonitrile (50:50, v/v). These diluted working standard solutions were used to prepare the calibration curve and quality control samples. Blank human plasma was screened prior to spiking to ensure it was free from endogenous interference at retention times of S-CPM and internal standard of SCPM (Figure 2). An eight point standard curve of S-CPM was prepared by spiking the blank plasma with appropriate amount of SCPM. The calibration curve ranged from 1.0 to 150.0 ng.ml-1. Quality control samples, prepared at three concentration levels of 5.0, 25.0, 75.0 and 125.0 ng.ml-1 for S-CPM were made with blank plasma. The samples were vortexed and stored at (-) 702 C for further processing.

www.SID.ir

Determination of dexchlorpheniramine

Table 1. Precision studies of dexchlorpheniramine maleate samples (ng.ml-1).

Quality control Nominal sample concentration Intra-assay Mean concentration (ng.mL-1) SD % CV Inter -assay N Mean concentration (ng.mL-1) SD % CV N

LLOQ LQC MQC HQC

5.00 25.00 75.00 125.00

4.519 24.472 73.686 123.221

0.330 0.383 1.370 1.433

7.28 1.57 1.86 1.16

5 5 5 5

4.573 24.661 73.902 123.225

0.385 0.402 1.530 1.434

8.42 1.63 2.07 1.16

5 5 5 5

S.D: Standard deviation; CV: Coefficient of variance; N: Total number of observations for each concentration; LLOQ: Lower limit of quantification; LQC: Lower quality control; MQC: Middle quality control; HQC: High quality control.

2.4. Instrumentation Chromatographic separation was carried out on a Shimadzu HPLC (Shimadzu Corporation, Japan) with phenomenex (Luna) - ODS (100x4.6 mm i.d., 5 m). The mobile phase consisting of a mixture of methanol (10 mM) and ammonium acetate (90:10 v/v) was delivered with a flow rate of 0.5 ml/min. under ambient temperature. The total running time for each sample analysis was 6.0 min. Mass spectra were obtained using a Single Quadrupole mass spectrometer (Shimadzu, Japan) equipped with Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) source and Electrospray ionization (ESI). The mass spectrometer was operating in the selected ion-monitoring (SIM) mode. Sample introduction and ionization was done in the positive ion mode. The spray voltage and capillary temperature were 1.3 KV and 400 C, respectively. The mass transition ion-pair was selected as m/z 274.9 for S-CPM (Figure 3) and m/z 302.9 for STA. The data acquisition was ascertained by LC-MS solution data station. For quantification, the peak area ratios of the target ions of the drugs to those of the internal standard were compared with weighted (1/c) least squares calibration curves in which the peak area ratios of the calibration standards were plotted versus their concentrations. 2.5.Validation The method was validated according to FDA guidelines [10, 11] and was validated for selectivity, sensitivity, linearity, precision, accuracy, and stability. The selectivity of the method was evaluated by comparing the

chromatograms obtained from the samples containing S-CPM and the internal standard STA with those obtained from blank samples. Sensitivity was determined in terms of LLOQ lower limit of quantification where the response of LLOQ should be at least five times greater than the response of interference in blank matrix at the retention time or mass transitions of the analyte. The linearity of different concentrations of standard solutions was prepared to contain 1 to 150 ng.ml-1 of SCPM containing 2500.0 ng.ml-1 of STA. These solutions were analysed and the peak areas and response factors were calculated. The calibration curve was plotted using response factor against concentration of the standard solutions. The standard curve fitting was determined by applying the simplest model that adequately describes the concentration-response relationship using appropriate weighing and statistical tests for goodness of fitting. The precision of the method was determined by intraday precision and interday precision. The intraday precision was evaluated by analysis of blank plasma sample containing S-CPM at three different concentrations namely low, medium and high quality control concentrations using nine replicate determinations for three occasions. The interday precision was similarly evaluated over a two-week period. The accuracy of the developed method was determined by relative and absolute recovery experiments. The relative recovery of the drug was calculated by comparing the concentration obtained from the drug supplemented plasma to the actually added concentration. Recovery studies were carried

Ar

ch

ive
163

of

SI

www.SID.ir

AJ Raju et al./ IJPS Summer 2007; 3(3): 161-170

Table 2. Stability of dexchlorpheniramine maleate in human plasma samples. Sample concentration Concentration found (ng.ml-1) (n = 6) (meanS.D.) (ng.ml-1)

% CV

out six times for three levels and the percentage recovery, mean, standard deviation and coefficients of variation were calculated. As a part of the method validation, stability and partial volume analysis were evaluated. The room temperature stock solution stability, refrigerated stock solution stability, freeze thaw stability, short term stability and long term stability were determined. The room temperature stock solution stability was carried out at 0, 3 and 8 h by injecting four replicates of prepared stock dilutions of SCPM equivalent to middle quality control sample concentration and the stock dilution of the internal standard equivalent to the working concentration. Comparison of the mean area response of S-CPM and internal standard at 3 and 8 h was carried out against the 0 h value. Refrigerated stock solution stability was determined at 7, 14 and 27 days by injecting four replicates of prepared stock dilutions of the analyte equivalent to the middle quality control sample concentration and the stock dilution of internal standard equivalent to the working concentration. The stability studies of plasma samples spiked with S-CPM were subjected to three freezethaw cycles, short term stability at the room temperature for 3 h and long term stability at

Ar

ch

ive

of
164

SI

Short-term stability (1, 2, 3 h) 25 75 125 Long-term stability (4 weeks) 25 75 125 Stock solution stability (7, 14, 21 Days) 25 75 125 Freeze thaw stability (3 Cycle) 25 75 125

24.39370.46660 73.39970.60909 124.40271.95214 24.70660.51219 73.73611.18283 124.73530.63385 25.05030.10986 74.96630.11445 124.06930.92361 24.74160.3771 73.13611.06265 124.75130.58869

1.91 0.83 1.58 2.07 1.60 0.51 0.44 0.15 0.74 1.52 1.49 0.47

(-)70 C over 4 weeks. In addition, stability of standard solutions was performed at room temperature for 6 h and freeze condition for four weeks. The stability of triplicate spiked human plasma samples following three freeze thaw cycles was analysed. The mean concentrations of the stability samples were compared to the theoretical concentrations. The stability of triplicate short term samples spiked with S-CPM was kept at the room temperature for 1.00 to 3.00 h before extraction. The plasma samples of the long term stability were stored in the freezer at (-) 70 C until the time of analysis. 3. Results and discussion 3.1. Method development The goal of this work was to develop and validate a simple, rapid and sensitive assay method for the quantification of S-CPM, suitable to determine the pharmacokinetics of this compound in clinical studies. To achieve this goal, during method development different options were evaluated to optimize sample extraction, detection parameters and chromatography. The standard solutions of SCPM were analysed by LC-MS system using direct injection probed with ESI and APCI interfaces. From the mass spectrum recorded,

www.SID.ir

Determination of dexchlorpheniramine

the detection molecular ion selected was 274.9 for S-CPM (Figure 4). 3.2. Optimization of the chromatographic conditions The chromatographic conditions, especially the composition of mobile phase, were optimized through several trials to achieve good resolution and symmetrical peak shapes for the analyte and the IS, as well as a short run time. Modifiers, such as ammonium acetate and acetic acid alone or in combination with different concentrations were added. It was found that a mixture of acetonitrile-water (containing 10 mm ammonium acetate and 0.5% acetic acid) (90:10, v/v) could achieve this purpose and was finally adopted as the mobile phase. The percentage of acetic acid was optimized to maintain this peak shape while being consistent with good ionization and fragmentation in the mass spectrometer. After careful comparison of several columns, a Phenomenex (Luna)-ODS column (1004.6 mm, i.d., 5m) was finally used with a flow rate of 0.5 ml/min. to produce good peak shapes and permit a run time of 2.0 min. In order to produce a spectroscopically clean sample and avoid the introduction of nonvolatile materials onto the column and MS system, LLE was used for the sample preparation in this work. Clean samples are essential for minimizing ion suppression and matrix effect in LC-MS analyses.

Ar

ch

ive
165

Figure 2. LC-MS chromatogram of blank plasma sample.

of

Different reversed phase stationary phases (C 4 , C 8 , and C 18 ) were used and the chromatograms were recorded. Based on the retention and peak shape, Phenomenex Luna ODS column was selected for S-CPM. Liquid-liquid extraction (LLE) was used for the sample preparation in this work. LLE can be helpful in producing a spectroscopically clean sample and avoiding the introduction of non-volatile materials onto the column and MS system. Clean samples are essential for minimizing ion suppression and matrix effect in LC-MS analyses. Six organic solvents, diethyl ether, ethyl acetate, hexane, dichloromethane, chloroform and butyl tertmethyl ether, and their mixtures in different combinations and ratios were evaluated. Finally, an ethyl acetate was found to be optimal, which can produce a clean chromatogram for a blank plasma sample and yield the highest recovery for the analyte from the plasma. 3.3. Validation Estimation of the S-CPM in plasma samples from the volunteers was carried out using optimized chromatographic conditions. The validation parameters such as accuracy, precision (repeatability and reproducibility), linearity and range, sensitivity (limit of detection and limit of quantitation), robustness/ruggedness, stability, selectivity/ specificity and system suitability studies were evaluated. The validation results are given

Figure 3. LC-MS chromatogram of dexchlorpheniramine maleate and internal standard sample.

SI

www.SID.ir

AJ Raju et al./ IJPS Summer 2007; 3(3): 161-170

Table 3. Mean pharmacokinetic properties of dexchlorpheniramine maleate obtained from studied subjects (N=24) after administration of a single 6-mg dose of reference and test dexchlorpheniramine maleate formulations. Pharmacokinetic parameters* Test Reference (N=24) (N=24)

Cmax, ng.ml-1 tmax, h AUC0-t (ng.h.ml-1) keli AUC0-Q (ng.h.ml-1) t1/2 (h)

25.3421 (2.0605) 3.2708 (1.1514) 234.1008 (22.8974) 0.1000 (0.0135) 262.8429 (23.6587) 7.0192 (0.9464)

22.1150 (4.4148) 6.7500 (0.9891) 241.5723 (33.8520) 0.1177 (0.0225) 270.3695 (35.5413) 6.0855 (1.0840)

Tmax: Time of maximum concentration; Cmax: Maximum concentration; AUC: Area under the concentration time curve; T1/2: Half-life; keli: Elimination rate constant; AUC0-t: Area under the plasma concentration-time curve, last available measurement; AUC0-: Area under the plasma concentration-time curve from time 0 to infinity. *Values in the parenthesis indicate standard deviation.

Ar

3.4. Accuracy The accuracy of the optimised methods was determined by relative and absolute recovery experiments (Table 1). The percentage recovery values for S-CPM ranged from 89.06 to 91.32% and their relative recovery values ranged from 88.07 to 91.33 %. The coefficient of variation (%) of

ch

ive
166

in Table 1. The reference standard solution with internal standard, matrix blank without the internal standard, zero sample [Matrix blank with internal standard], spiked calibration standards, quality control samples were analysed and chromatograms were recorded. The mobile phase used for the assay provided a well defined separation between the drug, the internal standard and endogenous components. The blank plasma samples showed no interference at retention time of the drugs and their internal standards (Figure 2).

Figure 4. Mass spectrum of dexchlorpheniramine maleate in positive mode Scan.

of

SI

these values was less than 10.00%. It is concluded that the developed methods are accurate and reliable. 3.5. Precision The optimized method for the estimation of S-CPM was found to be precise (Table 2). This was evident from the coefficieny of variation values, which were less than 10.00% in all concentrations. 3.6. Specificity Specificity of the method was analysed by six blank plasma samples and the recorded chromatograms. These chromatograms were compared with the chromatograms obtained from standard solutions. Each chromatogram was tested for interference. The combination of the sample preparation procedure and chromatography provided an assay which is free from significant interfering endogenous plasma components at the retention times of the S-CPM and the internal standard. These observations show that the developed assay method is specific and selective. 3.7. Linearity It was observed that the optimised methods were linear within a specific range of S-CPM concentration. The calibration curves were plotted between response factor and concentration of the standard solutions. The linearity range were found to be 1 to 150 ng.ml -1 . The calibration curves were

www.SID.ir

Determination of dexchlorpheniramine

Table 4. Results of statistical analysis of the bioequivalency study of test and reference dexchlorpheniramine maleate formulations. AUC0-t (ng.h/ml-1) AUC0- (ng.h/ml-1) Cmax, (ng ml-1)

Ratio (%) Geometric CI (%)

105.8 92.36-107.06

104.7 95.51-107.06

111.00 93.69-107.74

constructed on 11 different days over a period of four weeks to determine the variability of the slopes and intercepts. The results indicated no significant interday variability of slopes and intercepts over the optimised concentration range. 3.8. Limit of detection The limit of detection (LOD) values was found to be 0.25 ng.ml-1 for S-CPM and their limit of quantification (LOQ) values were 1.00 ng.ml-1. These observations indicate that the developed methods have adequate sensitivity. These values, however, may be affected by the separation conditions (eg. column, reagents, and instrumentation and data systems), instrumental changes (eg. pumping systems and detectors) and use of non HPLC grade solvents may results in changes in signal-to-noise ratios. 3.9. Ruggedness and robustness The ruggedness and robustness of the methods were studied by changing the experimental conditions. No significant changes in the chromatographic parameters were observed when the experimental (operators, instruments, source of reagents and column of similar type) and optimised conditions (pH, mobile phase ratio and flow rate) were changed.

Ar

3.11. System suitability studies System suitability parameters such as column efficiency (theoretical plates), resolution factor and peak asymmetry factor of the optimised methods were found to be satisfactory. Theoretical plates of the columns ranged from 18432 to 22987 and their resolution factor was 2.46. Similarly, the peak asymmetry factors ranged from 1.01 to 1.09. All these observations supported the system suitability for the evaluation of selected drugs. In conclusion, this is an accurate, precise, selective and linear method for S-CPM estimation in plasma and hence can be used for bioavailability and bioequivalency studies. 3.12. Application of the developed method The proposed method was applied to the determination of S-CPM in plasma samples from an on going project bioequivalence studies of sustained release formulation. Open label, balanced, randomized, two-treatment, two sequence, two-period, single dose, crossover bioequivalence study of marketed repetabs containing 6 mg of S-CPM (reference sample) against SR tablets containing 6 mg of S-CPM (test sample) manufactured by Sipali

3.10. Stability studies The stability of plasma samples which had been spiked with selected drugs were studied by subjecting the samples to three freezethaw cycles; short and long term stabilities at room temperature were measured within 3 h and within 4 weeks at (-)70 C, respectively (Table 2). In addition, stability of standard solutions was measured at the room 167

ch

ive

of

SI

temperature and freeze condition within 6 h and within 4 weeks, respectively. The mean concentrations of samples were compared to the theoretical concentrations. The results indicated that selected drugs in plasma samples can be stored in freezing condition for 1 month without degradation. The results of stability studies of short term storage of plasma and also sample solution at room temperature and freeze thaw cycles show that no S-CPM degradation happened and therefore, plasma samples could be handled without special precautions.

www.SID.ir

AJ Raju et al./ IJPS Summer 2007; 3(3): 161-170

Chemicals, India in healthy, adult, male, human subjects under fasting conditions was conducted in accordance with the current good clinical practice (GCP) and FDA guidelines. The study was performed on healthy, willing, 24 male volunteers 18-45 years of age, after they had been informed of the purpose, protocol and risk involved in the study. All subjects gave written informed consent and the protocol was approved by local ethics committee. The venous blood samples 6 ml including (1 ml discarded heparinised blood) were withdrawn via an indwelling cannula at pre-dose and at 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0, 12.0, 18.0 and 24 h following drug administration in each period of the study. The samples were collected in pre-labeled vacutainers containing sodium citrate as the anti coagulant and centrifuged at 3000 rpm for 15 min. at 15 C and plasma was collected in pre-labeled sample collection tube. A wash out period of 7 days was observed between the two phases of the study. The samples were stored in the deep freezer at (-)705 C until analyzed by a validated LC-MS method. The pharmacokinetic parameters namely maximum plasma concentration (Cmax), time point of maximum plasma concentration (Tmax), area under the plasma concentrationtime curve from 0 h to the last measurable concentration (AUC0-t), area under the plasma concentration time curve from 0 h to infinity (AUC0-Q), elimination rate constant (Z) and half-life of drug elimination during the terminal phase (t1/2) were calculated using PK solution software statistical analysis of pharmacokinetic parameters was carried out using SPSS 12.0.1 for un-transformed and ln-transformed pharmacokinetic parameters Cmax, AUC0-t and AUC0-Q (Tables 3 and 4). Based on the statistical results of 90.0% confidenct intervals for the ratios of the means of ln-transformed pharmacokinetic parameters Cmax, AUC0-t and AUC0-Q conclusion was

drawn as to whether the test product was bioequivalent to the reference product. Bioequivalence was to be concluded if the 90.0% confidence interval fell within the bioequivalency range 80.0-125.0 % for Cmax, AUC0 - t and AUC0- Q. The mean (S.D.) plasma maximum concentration obtained for S-CPM in reference and test formulation is 22.1150 (4.4148) ng.ml -1 and 25.3421 (2.0605) ng.ml-1 (Table 3), respectively. 4. Conclusions A simple, specific, rapid and sensitive analytical method for the determination of S-CPM in human plasma has been developed. The developed LC-MS method was successfully applied for the bioequivalency studies. The method provided excellent specificity and linearity with a of quantification limit of 1.00 ng.ml-1 for SCPM. References
[1] Marin A, Barbas C. LC-MS for the degradation profiling of cough-cold products under forced conditions. J Pharm Biomed Anal 2004, 35: 103545. [2] Suntornsuk L, Pipitharome O, Prapin Wilairat P. Simultaneous determination of paracetamol and chlorpheniramine maleate by micellar electrokinetic chromatography. J Pharm Biomed Analy 2003; 33: 441-9. [3] Takagaki T, Matsuda M, Mizuki Y, Terauchi Y. A simple and sensitive method for the determination of chlorpheniramine maleate in human plasma using liquid chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B 2002; 776: 169-76. [4] van Eeckhaut A, Detaevernier MR, Michotte Y. Development of a validated capillary electrophoresis method for enantiomeric purity testing of dexchlorpheniramine maleate. J Chromatogr A 2002; 958: 291-7. [5] Indrayanto G, Sunartob A, Adriani Y. Simultaneous assay of phenylpropanolamine hydrochloride, caffeine, paracetamol, glycerylguaiacolate and chlorpheniramine maleate in Silabat TM tablet using HPLC with diode array detection. J Pharm Biomed Anal 1995; 13: 1555-9.

Ar

ch

ive
168

of

SI

www.SID.ir

Determination of dexchlorpheniramine

Ar
169

ch

ive

of
www.SID.ir

SI

[6] Yamato S, Nakajima M, Shimada K. Simultaneous determination of chlorpheniramine and maleate by high-performance liquid chromatography using tetra-nbutylammonium phosphate as an ion-pair reagent. J Chromatogr A 1996 731: 346-50. [7] Hood DJ, Cheung HY. A chromatographic method for rapid and simultaneous analysis of codeine phosphate, ephedrine HCl and chlorpheniramine maleate in cough-cold syrup formulation. J Pharm Biomed Anal 2003; 30: 1595-601. [8] Celma C, Allue JA, Prunonosa J, Peraire C, Obach R. Simultaneous determination of paracetamol and chlorpheniramine in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr A 2000 870: 77-86. [9] Andronis V, Mesiha MS, Plakogiannis FM. Design and evaluation of transdermal chlorpheni-

ramine maleate drug delivery system. Pharm Acta Helvet 1995; 70: 301-6. [10] FDA guidance for industry, bioavailability studies for orally administered drug: Products-general considerations. US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Centre for Drug Evaluation and Research (CDER), 2000, website: http://www.fda.gov /cder/guidance/index.htm. [11] FDA guidance for industry, statistical approaches to establishing bioequivalence. US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Centre for Drug Evaluation and Research (CDER), 2001, Website: http:// www.fda.gov/cder/guidance/index.htm.