LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

“ PENETAPAN KADAR GLUKOSA DALAM DARAH DENGAN

METODE GOD-PAP “

Disusun oleh:

Hayu Ajeng Anggana Raras (098114004)

Amelia Felicia Cornelius Putri (098114005)

Kenny Ryan Limanto (098114006)

LABORATORIUM BIOKIMIA
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2010
 PERCOBAAN IV
PENETAPAN KADAR GLUKOSA DALAM DARAH
DENGAN METODE GOD-PAP

A. TUJUAN
Menentukan kadar glukosa dalam darah dengan metode GOD-PAP

B. DASAR TEORI
Glukosa merupakan karbohidrat yang paling penting dalam biokimia mamalia
karena hampir semua karbohidrat dalam makanan akan dikonersi menjadi glukosa
untuk metabolisme selanjutnya (Murray, 1999).
Glukosa adalah suatu aldoheksosa dan sering disebut dekstrosa karena
mempunyai sifat dapat memutar cahaya terpolarisasi ke arah kanan. Di alam, glukosa
terdapat pada buah-buahan dan madu lebah. Dalam alam, glukosa dihasilkan dari
reaksi antara karbon dioksida dan air dengan bantuan sinar matahari dan klorofil
dalam daun (Poedjiadi, 1994).
Penggunaan glukosa diatur dalam tubuh oleh insulin. Kelebihan glukosa akan
diubah menjadi glukagon dan akan disimpan dalam hati dan otot , dan akan digunakan
bila diperlukan dan akhirnya diubah menjadi lemak dan disimpan sebagai jaringan
lemak (Anonim, 2002).
Kadar glukosa dalam darah merupakan faktor yang sangat penting untuk
kelancaran kerja tubuh. Kadar normal glukosa dalam darah adalah 70-90 mg/100 ml.
keadaan di mana kadar glukosa berada di bawah 70 mg/ 100 ml disebut hipoglisemia,
sedangkan jika di atas 90mg/ 100 ml disebut hiperglisemia. Hipoglisemia ekstrim
dapat menghasilkan suatu rentetan reaksi goncangan yang ditunjukkan oleh gejala
gemetarnya otot, perasaan lemah badan dan pucatnya warna kulit. Hipoglisemia yang
serius dapat menyebabkan kehilangan kesadaran (pingsan) sebagai akibat kekurangan
glukosa dalam otak yang perlu untuk pembentukan energi, sehingga kemudian dapat
menyebabkan kematian (Wirahadikusuma, 1985).
Kadar glukosa yang tinggi merangsang pembentukan glikogen dari glukosa,
sintesis asam lemak, dan kolesterol dari glukosa. Kadar glukosa antara 140-170 mg/
100mL disebut kadar ambang ginjal. Gejala ini disebut glikosuria, yaitu keadaan
ketidakmampuan ginjal untuk menyerap kembali glukosa yang telah mengalami
filtrasi (Poedjiadi, 1994).

Hormon insulin berperan sentral dalam mengatur glukosa darah. Hormon ini
dihasilkan oleh sel β pulau Langerhans di pankreas sebagai respons terhadap
hiperglikemia. Sel-sel β pulau Langerhans bersifat permeabel bebas terhadap glukosa
melalui pengangkut GLUT 2, dan glukosa mengalami fosforilasi oleh glukokinase.
Oleh karena itu peningkatan glukosa darah akan meningkatan aliran metabolik
 melalui glikolisis, siklus asam sitrat, dan pembentukan ATP. Oleh karena itu, kadar
insulin dalam darah setara dengan konsentrasi glukosa darah. Meskipun tidak secara
langdung mempengaruhi penyerapan glukosa oleh hati, namun insulin meningkatkan
penyerapan jangka panjang akibat kerjanya pada enzim-enzim yang mengendalikan
glikolisis, glikogenesis, dan glukoneogenesis (Murray, 1999).

Glukosa ditetapkan kadarnya setelah dioksidasi secara enzimatis

menggunakan enzim GOD (Glucose oksidase). H2O2 yang terbentuk kemudian
bereaksi dengan fenol dan 4-aminoantipirin dengan katalis enzim peroksidase (POD)
yang membentuk quinoneimine. Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan
konsentrasi glukosa dalam sampel (Anonim, 2009).
GOD (Glukosa-oksidase) adalah suatu enzim spesifik FAD yang diperoleh
dari jamur, karena dipakai untuk penafsiran glukosa. Semua aerobic dehidrogenase
yang diterangkan mengandung 2 molekul glukosa nukleotida. PAP (Phenol Amino
Peroksidase) mengandung antigen atau antibody dalam patogen jaringan.
Mempertahankan kadar glukosa dalam darah hingga stabil adalah salah satu yang
paling baik pengaturannya dari semua mekanisme homeostatik (Mayes, 1984).

GOD
Glukosa + O2 + 2 H2O asam glukonat + H2O2

POD
2 H2O2 + phenol + 4-aminoantipirin quinoneimine + 4 H2O
(Diachem, 2007)

C. ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah :

1. Sentrifuge 4. Efendorf

2. Tabung sentrifuge 5. Tabung reaksi

3. Mikropipet 6. Microlab-200

Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah :

1. Reagen, yang terdiri dari : 2. Aquabidest

- Fosfat buffer 3. Serum/plasma darah

- 4-amino antipirin

- Glucose oksidase

(GOD)

- Peroksidase (POD)
D. SKEMA KERJA

1. Pembuatan Blanko

Mengambil aquadest sebanyak 10 µL

Memasukkannya ke dalam tabung reaksi

2. Pembuatan larutan standar

Mengambil 1000 µL reagen dalam tabung reaksi

Menambahkan 10 µL larutan standard glukosa

3. Pembuatan larutan sampel

Mengambil 1000 µL reagen dalam tabung reaksi

Menambahkan 10 µL serum darah tikus sebagai sampel yang akan diuji

Melakukan replikasi (didapat 2 larutan sampel tiap kelompok)

4. Pengukuran dengan Microlab-200

Memvortex semua larutan yang telah dibuat

Mendiamkannya selama operating time , kurang lebih 20-25 menit

Mengukur aktivitas serumnya dengan Microlab-200 pada panjang gelombang 546

nm

Mengukur serapan blanko dan standar, sebelum mengukur kadar sampel

 E. DATA PENGAMATAN

kadar
komposisi Absorbansi ( − ) | − |
( ) ( )
blanko 10 µL aquadest - 0 - -
10 µL larutan standard
standar glukosa + 1000 µL 160 0,409 31,111 967,894
reagen
10 µL serum tikus +
sampel 1 224 - 95,111 9046,102
1000 µL reagen
10 µL serum tikus +
sampel 2 158 - 29,111 847,450
1000 µL reagen
10 µL larutan standard
standar glukosa + 1000 µL 100 - -28,889 834,574
reagen
128,889
10 µL serum tikus +
sampel 3 146 - 17,111 292,786
1000 µL reagen
10 µL serum tikus +
sampel 4 78 - -50,889 2589,690
1000 µL reagen
10 µL larutan standard
standar glukosa + 1000 µL 101 - -27,889 777,796
reagen
10 µL serum tikus +
sampel 5 93 - -35,889 1288,020
1000 µL reagen
10 µL serum tikus +
sampel 6 100 - -28,889 834,574
1000 µL reagen
| − | 17478,886

∑| − | 17478,886 17478,886
( )= = = = 46, 742
−1 9−1 8

∶ ±
= (128,889 − 46, 742) − (128,889 + 46, 742)
= 82,147 − 175,631

Data yang tidak masuk dalam range, data sampel 1 yang menunjukkan kadar 224 mg/ dL dan data
sampel 4 yang menunjukkan kadar 78 mg/ dL.
 F. PEMBAHASAN
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk menentukan kadar glukosa dalam darah dengan
metode GOD-PAP. Metode GOD-PAP adalah salah satu metode penentuan kadar glukosa sesudah
oksidasi enzimatik oleh glukosa oksidase.
Reaksinya adalah :

Pada reaksi di atas , glukosa oksidase (GOD) mengkatalisis oksidase glukosa,pada reaksi ini
terbentuk H2O2 , yang dengan adanya peroksidase (POD) akan bereaksi dengan fenol dan amino-
antipirin. Sebenarnya dapat digunakan 2,4-dichloro phenol, namun karena susah didapat, sifatnya
yang tak stabil dan harganya mahal, maka digunakan fenol dalam percobaan ini. Oksidasi ini akan
menimbulkan zat warna yang intensitasnya sebanding dengan kadar glukosa, diukur secara
fotometrik. Reaksinya:

Prinsip dari pengujian ini adalah dengan menembakkan panjang gelombang tertentu (dalam
percobaan ini, digunakan λ = 546 nm) pada suatu senyawa. Karena cahaya yang ditembakkan
mengandung energi ( = ℎ ), hal ini akan membuat elektron dari senyawa tersebut akan tereksitasi
ke orbital yang lebih tinggi. Setelah mengalami eksitasi, elektron tersebut akan turun kembali ke
ground state (keadaan dasar), sambil melepaskan emisi yang kemudian dapat diukur oleh Microlab-
200. Salah satu yang memegang peran dalam pengujian ini adalah gugusan kromofor (ikatan rangkap
terkonjugasi), yang dapat menangkap panjang gelombang tertentu.
Metode GOD-PAP ini memiliki akurasi dan presisi yang baik karena enzim GOD spesifik
untuk reaksi pertama. Sedangkan pada reaksi kedua rawan interferen (sifatnya tidak spesifik).
Interferen yang dapat mengganggu antara lain bilirubin, asam urat , asam askorbat. Untuk itu bagian
yang diuji bagian serumnya, protein darah (sel padatnya) tidak boleh ikut terambil.
Pada praktikum yang digunakan adalah darah tikus. Tikus tidak dalam keadaan puasa karena
kadar glukosanya akan menurun. Pada tubuh manusia, pengaturan kadar glukosa dalam darah
berkaitan erat dengan hormon insulin dan glukagon. Pada waktu kadar glukosa darah naik, hormon
insulin disekresikan, yang akan menurunkan kadar glukosa darah. Dalam keadaan puasa, kadar
glukosa darah menurun, hormon glukagon disekresikan untuk meningkatkan kadar glukosa darah.
Keduanya bekerja berlawanan, hormon insulin dihasilkan oleh sel-sel beta pulau Langerhans dan
glukagon dihasilkan oleh sel-sel alfa pulau Langerhans. Gangguan pada pengeluaran hormon insulin
dapat menyebabkan penimbunan glukosa dalam darah (hiperglikemia = di atas 90 mg / 100mL) yang
kita kenal sebagai penyakit diabetes melitus. Sebaliknya jika hormon glukagon tidak disekresikan
dengan baik maka kita dapat merasakan pusing, gemetar, lemah, pucat, hipoglikemia (di bawah 70
mg/ 100mL) dapat mengakibatkan pingsan sebagai akibat kekurangan glukosa dalam otak yang perlu
untuk pembentukan energi. Kemudian dapat menyebabkan kematian (Wirahadikusuma, 1985).
Setelah itu dilakukan sentrifugasi (pemisahan campuran berdasarkan perbedaan berat jenis).
Kecepatan yang digunakan 3000 rpm. Setelah memisah, terdapat bagian yang menggumpal dan cairan
yang bening. Yang diambil adalah cairan bening itu (serumnya), selain sudah dijelaskan di atas, akan
ada interferen dari protein-protein darahnya, juga karena yang dibutuhkan pada percobaan ini adalah
bagian cair bening yang dapat ditembus cahaya, sedangkan padatan tentu tidak bisa ditembus oleh
cahaya sehingga jika plasma darah dalam serum itu mengalami lisis, maka tidak dapat diukur
menggunakan Microlab-200, karena prinsip dari Microlab-200 itu sendiri adalah spektroskopi, yang
bisa mengukur jika larutan itu bening sehingga dapat ditembus oleh cahaya.
Setelah serum didapat , diambil sebanyak 10 µL dan ditambahkan reagen sebanyak 1000 µL
dan di-vortex dengan tujuan agar serum dan reagen homogen. Larutan direplikasi sebanyak 2,
sehingga masing-masing tabung berisi 5 µL serum dan 500 µL reagen. Larutan blanko dibuat dengan
mengambil aquadest sebanyak 10 µL. Tujuan dari pembuatan larutan blanko adalah untuk
membuktikan bahwa aquadest (pelarut) yang digunakan tidak memiliki daya absorbansi (sama dengan
nol) sehingga ketika kita mengukur sampel, hanya kadar yang ingin kita ukur saja (glukosanya) yang
terbaca. Kemudian dibuat juga larutan standard yang berisi 1000 µL reagen dan 10 µL larutan
standard glukosa. Larutan standard ini sebagai pembanding kedua sampel yang ada. Kemudian
setelahnya didiamkan selama 20-25 menit (operating time) supaya didapatkan hasil optimal di mana
reagen dan serum bereaksi optimal.
Langkah selanjutnya adalah mengukur aktivitas serum dengan Microlab-200 pada panjang
gelombang 546 nm. Pada panjang gelombang inilah daya absorbansinya optimal. Pada saat akan
menggunakan Microlab, pipa perlu dicuci dengan aquadest dengan tujuan supaya tidak
terkontaminasi senyawa/ bahan-bahan sebelumnya.
Glukosa oksidase (GOD) adalah enzim yang mengkatalisis oksidasi β-D-glukosa menjadi
glukonolakton yang kemudian dengan adanya molekul air terhidrolisis menjadi asam glukolonat dan
peroksida. Reaksinya sebagai berikut:

GOD
β-D-glukosa + FAD β-D-glukonolakton + FADH2
β-D-glukonolakton + H2O asam D-glukolonat
FADH2 + O2 H2O2 + FAD
β-D-glukosa + O2 + H2O asam-D-glukolonat + H2O2 (Whitaker, 1972).

Berdasarkan teori seharusnya kadar glukosa normal dalam darah adalah sekitar 70-110
mg/dl, namun pada percobaan kami dihasilkan kadar glukosa yang sangat tinggi melebihi standar, hal
ini dapat disebabkan karena pemipetan serum yang kurang benar dan pencucian alat yang tidak bersih,
sehingga masih ada zat pengotor lainnya yang tertinggal di dalam tabung reaksi. Hal ini dapat
mengganggu hasil pengukuran dengan Microlab-200 yang sensitif.
Dari data-data di atas, didapatkan range dari hasil percobaan sebesar 82,147 −
175,631 . Dari range tersebut, terdapat dua data yang tidak masuk dalam range tersebut. Hal
ini dapat disebabkan oleh kesalahan praktikan, baik dari pemipetan maupun pencucian alat yang
kurang bersih.
 G. KESIMPULAN
1. Dari percobaan yang telah dilakukan didapatkan data sebagai berikut:
a. Range kadar glukosa yang didapat sebesar 82,147 − 175,631
b. Kadar rata-rata dari glukosa yang diuji sebesar 128,889 mg/ dL
2. Kadar glukosa terbesar sebesar 224 mg/ dL, kadar glukosa terkecil sebesar 78 mg/ dL
3. Reaksi dalam percobaan ini adalah
HO OH
HO OH HO
O
O O O HO OH
HO
oxygen H H hydrogen peroxide
O
water O HO OH
HO OH glucuronic acid
glucose

HO OH N HO HN O
hydrogen peroxide
NH2
phenol quinone imine
O
4-aminoantipyrine

H. DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2002, Kamus Kedokteran Dorland Edisi 29, 931-932, Penerbit Buku Kedokteran
EGC, Jakarta
Anonim, 2009, Glucose GOD-PAP, http://www.chemoquip.com/html/downloads/18.pdf+god
+pap&cd=10&hl=id&ct=clnk=&gl=id, diakses tanggal 6 April 2010
Diachem, 2007, GLUCOSE GOD/PAP DIACHEM Ltd, http://www.diachem.hu/CE%20Diag
on%20angol%20utas/Glucose_PAP_stable_liliqu.pdf, diakses tanggal 19 April 2010
Mayes, P. A. A., 1984, Biokimia, 146, 284, 285, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta
Murray, R. F., 1999, Biokimia Harper edisi 24, 141-142, EGC, Jakarta
Poedjiadi, A., 1994, Dasar-Dasar Biokimia, 8-11, UI Press, Jakarta
Whitaker, R.J., 1972, Principle of Enzimology for The Food Science, 561-570, Mergel
Dekker Inc., New York
Wirahadikusumah, M., 1985, Biokimia Metabolisme Energi, Karbohidrat, dan Lipid, 127-
128, ITB Press, Bandung
 Yogyakarta, 20 April 2010
Praktikan,
1. Hayu Ajeng Anggana Raras (098114004)

2. Amelia Felicia Cornelius Putri (098114005)

3. Kenny Ryan Limanto (098114006)