PRAKTEK INSTRUMEN FISIKA

SPEKTROFOTOMETRI UV - VIS

Disusun Oleh : Kelompok 2

Anggota/NIM : 1. Dinda Puspita / PO.71.39.1.18.007

2. Elfa Sakinah / PO.71.39.1.18.008

3. Ellen Angelina / PO.71.39.1.18.009

4. Fadila Dwi Wardani / PO.71.39.1.18.010

5. Fatima Roihana / PO.71.39.1.18.011

6. Feli Sabila / PO.71.39.1.18.012

Kelas : Reguler 2A

Dosen Pembimbing : Vera Astuti S.Farm, Apt, M.Kes.

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES PALEMBANG

JURUSAN FARMASI

TAHUN AKADEMIK 2019/2020

 KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan kesehatan jasmani dan
rohani sehingga kita masih tetap bisa menikmati indahnya alam ciptaan-Nya.
Sholawat dan salam semoga senantiasa tercurahkan kepada teladan kita Nabi
Muhammad SAW yang telah menunjukkan kepada kita jalan yang lurus berupa
ajaran agama yang sempurna dan menjadi rahmat bagi seluruh alam.
Saya sangat bersyukur karena telah menyelesaikan tugas pada Mata Kuliah
Praktek Instrumen Farmasi dengan judul “Spektrometer UV-VIS”. Disamping itu,
saya mengucapkan banyak terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu
hingga terselesaikannya tugas ini.
Akhir kata, saya memahami jika makalah ini tentu jauh dari kesempurnaan
maka kritik dan saran sangat saya butuhkan guna memperbaiki karya-karya saya di
waktu-waktu mendatang.

Palembang, 6 September 2019

Penulis

i
 DAFTAR ISI

Kata Pengantar ........................................................................................... i

Daftar Isi ..................................................................................................... ii
BAB I Pendahuluan
1.1 Latar Belakang ......................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah .................................................................... 1
1.3 Tujuan Pembahasan ................................................................. 2
BAB II Pembahasan
2.1 Definisi Spektrofotometer UV-VIS .................................................. 3
2.2 Konsep Dasar Spektrofotometer UV-VIS ......................................... 4
2.3 Prinsip Kerja Spektrofotometer UV-VIS .......................................... 4
2.4 Kegunaan Spektrofotometer UV-VIV .............................................. 5
2.5 Komponen-Komponen Alat Spektrofotometer UV-VIS .................. 5
2.6 Cara Kerja Alat Spektrofotometer UV-VIS ...................................... 10
2.7 Prosedur Pemakaian Spektrofotometer UV-VIS .............................. 10
2.8 Harus Diperhatikan dalam Analisis Spektrofotometer UV-VIS ...... 11
2.9 Kelebihan dan Kekurangan Spektrofotometer UV-VIS ................... 12
2.10 Proses Absorbsi Cahaya Pada Spektrofotometer UV-VIS.............. 12
2.11 Kalibrasi Spektrofotometer UV-VIS .............................................. 14
BAB III Penutup
Kesimpulan ................................................................................................ 16
Daftar Pustaka ............................................................................................ 17

ii
 BAB I
1. PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG
Dengan semakin kompleksisitas berbagai keperluan saat ini, analisis kimia
dengan mempergunakan metoda fisik dalam hal identifikasi dari berbagai
selektifitas fungsi polimer campuran, pemodifikasi dan aditif digunakan untuk
plastik dan elastomer. Spektroskopi infra merah, metoda pengukuran fotometer
UV, gas dan liquid kromatografi dan spektroskopi masa bersama sama dengan dari
metoda pengukuran termoanalisis (DSC-TGA) merupakan alat yang teliti sebagai
pilihan untuk analisis kwalitatif dan kwantitatif bahan.
Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang
digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan
kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Sedangkan
peralatan yang digunakan dalam spektrofometri disebut spektrofotometer. Cahaya
yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi
dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron yang
ada pada atom ataupun molekul yang bersangkutan.
Para kimiawan telah lama menggunakan bantuan warna sebagai bantuan
dalam mengenali zat-zat kimia. Spektrofotometri dapat dianggap sebagai suatu
perluasan pemeriksaan visual yang dengan studi lebih mendalam dari absorpsi
energi radiasi oleh macam-macam zat kimia memperkenankan dilakukannya
pengukuran ciri-ciri serta kuantitatifnya dengan ketelitian lebih besar.
1.2 RUMUSAN MASALAH
 Apa definisi Spektrofotometer UV-VIS ?
 Apa konsep dasar Spektrofotometer UV-VIS ?
 Apa prinsip kerja Spektrofotometer UV-VIS?
 Apa kegunaan Spektrofotometer UV-VIS ?
 Apa komponen-komponen alat Spektrofotometer UV-VIS ?
 Bagaimana cara kerja alat Spektrofotometer UV-VIS ?
 Apa hal -hal harus diperhatikan dalam Analisis Spektrofotometer UV-VIS?
 Apa Kelebihan dan kelemahan Spektrofotometer UV-VIS?
 Bagaimana proses Absorbsi Cahaya Pada Spektrofotometer UV-VIS?
 Bagaimana Kalibrasi Spektrofotometer UV-VIS?
1.3 TUJUAN PEMBAHASAN
 Untuk Mengetahui Konsep dasar Spektrofotometer UV/VIS.
 Untuk Mengetahui Prinsip Kerja Spektrofotometer UV/VIS.
 Untuk Mengetahui Komponen Spektrofotometer UV/VIS.
 Untuk Mengetahui Kegunaan Spektrofotometer UV/VIS.
 Untuk Mengetahui Cara Kerja Spektrofotometer UV/VIS

1
 Untuk mengetahui hal -hal harus diperhatikan dalam Analisis
Spektrofotometer UV-VIS
 Untuk mengetahui Kelebihan dan kelemahan Spektrofotometer UV-VIS
 Untuk mengetahui proses Absorbsi Cahaya Pada Spektrofotometer UV-VIS
 Untuk mengetahui Kalibrasi Spektrofotometer UV-VIS

2
 BAB II
2. PEMBAHASAN
2.1 Deinisi Spektrofotometer UV/VIS
Spektrofotometri adalah ilmu yang mempelajari tentang penggunaan
spektrofotometer. Spektriofotometer adalah alat yang terdiri dari spektrofotometer
dan fotometer. Spektofotometer adalah alat yang digunakan untuk mengukur energi
secara relative jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan
sebagai fungsi dari panjang gelombang. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari
spectrum dengan panjang gelombang tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur
intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi.
Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari
spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum
dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas
cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan
untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan,
direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Kelebihan
spektrofotometer dibandingkan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar
putih lebih dapat terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma,
grating ataupun celah optis. Pada fotometer filter, sinar dengan panjang gelombang
yang diinginkan diperoleh dengan berbagai filter dari berbagai warna yang
mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. Pada
fotometer filter, tidak mungkin diperoleh panjang gelombang yang benar-benar
monokromatis, melainkan suatu trayek panjang gelombang 30-40 nm. Sedangkan
pada spektrofotometer, panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat
diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu
spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu,
monokromator, sel pengabsorpsi untuk larutan sampel atau blangko dan suatu alat
untuk mengukur perbedaan absorpsi antara sampel dan blangko ataupun
pembanding.
Spektroskopi UV/VIS merupakan metode penting yang mapan, andal dan
akurat. Dengan menggunakan spektroskopi UV/VIS, substansi tak dikenal dapat
diidentifikasi dan konsentrasi substansi yang dikenal dapat ditentukan. Pelarut
untuk spektroskopi UV harus memiliki sifat pelarut yang baik dan memancarkan
sinar UV dalam rentang UV yang luas.
Spektrofotometer Uv-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi, reflektansi dan absorbsi dari cuplikan sebagai fungsi dari panjang
gelombang. Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan alat yang terdiri
dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum
dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas
cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorbsi. Jadi spektrofotometer digunakan
untuk mengukur energi cahaya secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan,
direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Suatu

3
spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum sinar tampak yang sinambung dan
monokromatis. Sel pengabsorbsi untuk mengukur perbedaan absorbsi antara
cuplikan dengan blanko ataupun pembanding.
Spektrofotometer Uv-Vis merupakan spektrofotometer yang digunakan
untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak. Semua metode
spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh senyawa yang ditentukan,
sinar yang digunakan adalah sinar yang semonokromatis mungkin.
Spektrofotometer UV-Vis (Ultra Violet-Visible) adalah salah satu dari
sekian banyak instrumen yang biasa digunakan dalam menganalisa suatu senyawa
kimia. Spektrofotometer umum digunakan karena kemampuannya dalam
menganalisa begitu banyak senyawa kimia serta kepraktisannya dalam hal preparasi
sampel apabila dibandingkan dengan beberapa metode analisa.
2.2 Konsep Dasar Spektrofotometer UV-VIS
Dasar spektrofotometri UV-VIS adalah serapan cahaya dengan metode
analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh larutan
berwarna pada panjang gelombang spesifik (UV: 200–400 nm; Vis: 400–800 nm)
dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan
detektor fototube. Bila cahaya jatuh pada senyawa, maka sebagian dari cahaya
diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan struktur dari molekul senyawa
tersebut. Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah spektrum UV-VIS tergantung
pada struktur elektronik dari molekul. Spektra UV-VIS dari senyawa-senyawa
organik berkaitan erat dengan transisi-transisi diantara tingkatan-tingkatan tenaga
elektronik. Keuntungan dari serapan ultraviolet yaitu gugus-gugus karakteristik
dapat dikenal dalam molekul-molekul yang sangat kompleks (Riyadi, 2009).
2.3 Prinsip Kerja Spektrofotometer UV-VIS
Spektrofotometri uv-Vis mengacu pada hukum Lambert-Beer. Apabila
cahaya monokromatik melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya
tersebut akan diserap, sebagian dipantulkan dan sebagian lagi akan dipancarkan.
Hukum lambert-beer menyatakan hubungan linear antara absorban dengan
konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan.
HUKUM LAMBERT-BEER
Hukum Lambert-Beer (Beer`s law) adalah hubungan linearitas antara
absorban dengan konsentrasi larutan sampel. Konsentrasi dari sampel di dalam
larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang
tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer.

Biasanya hukum Lambert-Beer ditulis dengan:

4
Menurut Dachriyanus (2004), Hukum Lambert-Beer terbatas karena sifat kimia dan
faktor instrumen. Penyebab non linearitas ini adalah:
· Deviasi koefisien ekstingsi pada konsentrasi tinggi (>0,01 M), yang
disebabkan oleh interaksi elektrostatik antara molekul karena jaraknya yang terlalu
dekat.
· Hamburan cahaya karena adanya partikel dalam sampel.
· Flouresensi atau fosforesensi sampel.
· Berubahnya indeks bias pada konsentrasi yang tinggi.
· Pergeseran kesetimbangan kimia sebagai fungsi dari konsentrasi.
· Radiasi non-monokromatik; deviasi bisa digunakan dengan menggunakan
bagian datar pada absorban yaitu pada panjang gelombang maksimum.
· Kehilangan cahaya.
2.4 Kegunaan Spektrofotometer UV-VIS
a. Larutan ion logam transisi dapat berwarna (misalnya, menyerap cahaya)
karena d elektron dalam atom logam dapat tertarik dari satu negara elektronik
lainnya. Warna larutan ion logam sangat dipengaruhi oleh kehadiran spesies lain,
seperti anion tertentu atau ligan. Sebagai contoh, warna larutan encer tembaga sulfat
adalah biru yang sangat terang; menambahkan amonia meningkat dan perubahan
warna panjang gelombang serapan maksimum (λ m a x).
b. Senyawa organik, terutama mereka yang memiliki tingkat tinggi konjugasi,
juga menyerap cahaya pada daerah UV atau terlihat dari spektrum elektromagnetik.
Pelarut untuk penentuan ini sering air untuk senyawa larut dalam air, atau etanol
untuk senyawa organik yang larut. (Pelarut organik mungkin memiliki penyerapan
sinar UV yang signifikan; tidak semua pelarut yang cocok untuk digunakan dalam
spektroskopi UV. Ethanol menyerap sangat lemah di paling panjang
gelombang.).Polaritas pelarut dan pH dapat mempengaruhi penyerapan spektrum
senyawa organik. Tirosin, misalnya, peningkatan penyerapan maksimum dan
koefisien molar kepunahan ketika pH meningkat 6-13 atau ketika polaritas pelarut
berkurang.
c. Sementara kompleks transfer biaya juga menimbulkan warna, warna sering
terlalu kuat untuk digunakan dalam pengukuran kuantitatif.
2.5 Komponen-Komponen Alat Spektrofotometer UV-VIS
Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari
etectorter dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkam sinar dari etector dengan
panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya
yang ditransmisikan atau yang diarbsorbsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk
mengukur etect secara etector jika etect tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau

5
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Kelebihan spektrofotometer
dibandingkan dengan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih dapat
lebih terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma, grating
ataupun celah optis. Pada fotometer filter, sinar dengan panjang gelombang yang
diinginkan diperoleh dengan berbagai filter dengan berbagai warna yang
mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. Suatu
spektrofotometer tersusun dari sumber spectrum tampak yang kontinyu,
monokromator, sel pengarbsorbsi untuk larutan sample dan blanko ataupun
pembanding.
Spektrofotometer terdiri dari :
· Sumber cahaya.
· Monokromator.
· Kompartemen sampel.
· Detektor dan pengukur intensitas cahaya.
· Skema konstruksi spektrofotometer
Secara sederhana Instrumen spektrofotometri yang disebut spektrofotometer terdiri
dari:

sumber cahaya – monokromator – sel sampel – etector – read out (pembaca).

1. Sumber Cahaya
Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran
radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk
daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar
dengan kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola
lampu pijar biasa, daerah panjang gelombang (l ) adalah 350 – 2200 nanometer
(nm).

6
 Di bawah kira-kira 350 nm, keluaran lampu wolfram itu tidak memadai
untuk spektrofotometer dan harus digunakan sumber yang berbeda. Paling lazim
adalah lampu tabung tidak bermuatan (discas) hidrogen (atau deuterium) 175 ke
375 atau 400 nm. Lampu hidrogen atau lampu deuterium digunakan untuk sumber
pada daerah ultraviolet (UV).

2. Monokromator
Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya
polikromatis menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu
(monokromatis) yang bebeda (terdispersi).
Ada 2 macam monokromator yaitu :
A. Prisma

B. Grating (kisi difraksi)

Keuntungan menggunakan kisi difraksi :

7
· Dispersi sinar merata
· Dispersi lebih baik dengan ukuran pendispersi yang sama
· Dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spectrum
Cahaya monokromatis ini dapat dipilih panjang gelombang tertentu yang
sesuai untuk kemudian dilewatkan melalui celah sempit yang disebut slit. Ketelitian
dari monokromator dipengaruhi juga oleh lebar celah (slit width) yang
dipakai. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu
mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya
monokromatis.
3. Sel sampel
Berfungsi sebagai tempat meletakan sampel, UV-VIS menggunakan kuvet
sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet
dari kuarsa yang terbuat dari silika memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini
disebabkan yang terbuat dari kaca dan plastik dapat menyerap UV sehingga
penggunaannya hanya pada spektrofotometer sinar tampak (VIS). Kuvet biasanya
berbentuk persegi panjang dengan lebar 1 cm. Cuvet harus memenuhi syarat- syarat
sebagai berikut :
· Tidak berwarna sehingga dapat mentransmisikan semua cahaya.
· Permukaannya secara optis harus benar- benar sejajar.
· Harus tahan (tidak bereaksi) terhadap bahan- bahan kimia.
· Tidak boleh rapuh.
· Mempunyai bentuk (design) yang sederhana.
4. Detektor
Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan
mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :
· Kepekaan yang tinggi
· Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
· Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
· Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
· Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.
Macam-macam detektor :
· Detektor foto (Photo detector)
· Photocell, misalnya CdS.

8
· Phototube
· Hantaran foto
· Dioda foto
· Detektor panas
5. Read out
merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang
berasal dari detektor.
Berdasarkan sistem optiknya terdapat 2 jenis spektrofotometer.
a. Spektrofotometer single beam (berkas tunggal)
Pada spektrofotometer ini hanya terdapat satu berkas sinar yang dilewatkan melalui
cuvet. Blanko, larutan standar dan contoh diperiksa secara bergantian.

b. Spektrofotometer double beam (berkas ganda)

Pada alat ini sinar dari sumber cahaya dibagi menjadi 2 berkas oleh cermin yang
berputar (chopper).
· Berkas pertama melalui kuvet berisi blanko
· Berkas kedua melalui kuvet berisi standar atau contoh
Blanko dan contoh diperiksa secara bersamaan seperti terlihat pada gambar.
Blanko berguna untuk menstabilkan absorbsi akibat perubahan voltase atau Io dari
sumber cahaya. Dengan adanya blanko dalam alat kita tidak lagi mengontrol titik
nolnya pada waktu-waktu tertentu, hal ini berbeda jika pada single beam.

9
2.6 Cara Kerja Alat Spektrofotometer UV-VIS
Spektrum elektromagnetik terdiri dari urutan gelombang dengan sifat-sifat
yang berbeda. Kawasan gelombang penting di dalam penelitian biokimia adalah
ultra lembayung (UV, 180-350 nm) dan tampak (VIS, 350-800 nm). Cahaya di
dalam kawasan ini mempunyai energi yang cukup untuk mengeluarkan elektron
valensi di dalam molekul tersebut
Penyerapan sinar UV-Vis dibatasi pada sejumlah gugus fungsional atau
gugus kromofor yang mengandung elektron valensi dengan tingkat eksutasi rendah.
Tiga jenis elektron yang terlibat adalah sigma, phi, dan elektron bebas. Kromofor-
kromofor organik seperto karbonil, alkena, azo, nitrat, dan karboksil mampu
menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang gelombang maksimumnya
dapat berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan. Auksokrom adalah gugus
fungsional yang mempunyai elektron bebas nseperti hidroksil, metoksi, dan amina.
Terkaitnya gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju
ke panjang gelombang yang lebih besar dan disertai dengan peningkatan intensitas
Ketika cahaya melewati suatu larutan biomolekul, terjadi dua kemungkinan.
Kemungkinan pertama adalah cahaya ditangkap dan kemungkinan kedua adalah
cahaya discattering. Bila energi dari cahaya (foton) harus sesuai dengan perbedaan
energi dasar dan energi eksitasi dari molekul tersebut. Proses inilah yang menjadi
dasar pengukuran absorbansi dalam spektrofotometer .
Cara kerja spektrofotometer dimulai dengan dihasilkannya cahaya
monokromatik dari sumber sinar. Cahaya tersebut kemudian menuju ke kuvet
(tempat sampel/sel). Banyaknya cahaya yang diteruskan maupun yang diserap oleh
larutan akan dibaca oleh detektor yang kemudian menyampaikan ke layar pembaca.
Larutan yang akan diamati melalui spektrofotometer harus memiliki warna
tertentu. Hal ini dilakukan supaya zat di dalam larutan lebih mudah menyerap
energi cahaya yang diberikan. Secara kuantitatif, besarnya energi yang diserap oleh
zat akan identik dengan jumlah zat di dalam larutan tersebut. Secara kualitatif,
panjang gelombang dimana energi dapat diserap akan menunjukkan jenis zatnya.
2.7 Prosedur Pemakaian Spektrofometer UV-VIS
1. Putar tombol on-off (disebelah kiri) kekanan. Biarkan 15 menit untuk
memanaskan alat. Atur tombol sampai menunjuk angka nol pada petunjuk
%T.
2. Putar tombol pengatur panjang gelombang (yang ada di sebelah atas alat)
untuk memilah panjang gelombang sesuai panjang gelombang yang
diinginkan.
3. Masukkan kuvet yang berisi paling sedikit 3 ml aquadest kedalam tempat
sampel (sebelum memasukkan kuvet, pastikan kuvet dalam keadaan kering
dengan mengeringkannya dengan kertas tissue (tutup penutup sampel.
4. Putar tombol pengatur cahaya (tombol yang terletak disebelah kanan)
sehingga %T menunjuk angka 100 atau A menunjuk angka nol.

10
 5. Angkat kuvet yang berisi aquadest deri tempat sampel dengan tutup. ganti
isi kuvet dengan larutan lampu, baca serapannya.
6. Ganti larutan blanko dalam kuvet dengan larutan standar atau larutan uji,
baca serapannya.
2.8 Hal-Hal Yang Harus Diperhatikan Dalam Analisis Spektrofotometri UV -
VIS
Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan
spektrofotometri Uv-Vis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang
akan dianalisis dengan spektrofotometri visibel karena senyawa tersebut harus
diubah terlebih dahulu menjadi senyawa yang berwarna.
Berikut adalah tahapan-tahapan yang harus diperhatikan:
1. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar Uv-Vis hal ini perlu dilakukan
jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah tersebut. Cara yang
digunakan adalah dengan merubah menjadi senyawa lain atau direaksikan dengan
pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi beberapa persyaratan
yaitu:
 Reaksinya selektif dan sensitive
 Reaksinya cepat, kuantitatif dan reprodusibel
 Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama
2. Waktu operasional (operating time)
Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan
warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu
operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran
dengan absorbansi larutan. Pada saat awal terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang
berwarna ini meningkat smpai waktu tertentu hingga diperoleh absorbansi yang
stabil. Semakin lama waktu pengukuran, maka ada kemungkinan senyawa yang
berwarna tersebut menjadi rusak atau terurai sehingga intensitas warnanya turun
akibatnya absorbansinya juga turun. Karena alasan inilah, maka untunk pengukuran
senyawa berwarna (hasil suatu reaksi kimia) harus dilakukan pada saat waktu
operasional.
3. Pemilihan panjang gelombang
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah
panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Untuk memilih
panjang gelombang maksimal, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara
absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsenterasi
tertentu. Kadang-kadang dijumpai keadaan yang mana pemakaian panjang
gelombang maksimal kurang baik. Hal ini karena karena misalnya, selain zat yang
akan dianalisis, juga terdapat zat lain yang mempunyai absorbansi pada panjang
gelombang tersebut. Ada beberapa variable yang dapat mempengaruhi absorbansi
yaitu jenis pelarut, pH larutan, suhu, konsentrasi dan zat-zat pengganggu.

11
4. Pembuatan kurva baku
Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianilisis dengen berbagai
konsenterasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi
kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi (y) dengan
konsentrasi (X). bila hokum Lamber-Beer terpenuhi, maka kurva baku berupa garis
lurus.
4. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan
Absorban yang terbaca pada spektrofotometri hendaknya antara 0,2 sampai
0,8 atau 15% sampai 70% jika dibaca sebagai transmitansi. Anjuran ini berdasarkan
anggapan bahwa kesalahan dalam pembacaan T adalah 0,005 atau 0,5% .
2.9 Kelebihan dan Kelemahan Spektrofotometer UV-VIS
a. Kelebihan Spektrofotometri Uv-Vis
1. Panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi.
2. Caranya sederhana.
3. Dapat menganalisa larutan dengan konsentrasi yang sangat kecil.
b. Kekurangan Spektrofotometri Uv-Vis
1. Absorbsi dipengaruhi oleh pH larutan, suhu dan adanya zat pengganggu dan
kebersihan dari kuvet.
2. Hanya dapat dipakai pada daerah ultra violet yang panjang gelombang >185
nm.
3. Pemakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung elektron valensi
dengan energy eksitasi rendah.
4. Sinar yang dipakai harus monokromatis. Proses Absorbsi Cahaya pada
Spektrofotometri
2.10 Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri UV-VIS
Ketika cahaya dengan berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis)
mengenai suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja yang
akan diserap. Di dalam suatu molekul yang memegang peranan penting adalah
elektron valensi dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu materi. Elektron-
elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi), berputar
(rotasi) dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi.
Jika zat menyerap cahaya tampak dan Uv maka akan terjadi perpindahan
elektron dari keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron
ini disebut transisi elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya
inframerah maka elektron yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada suatu
molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi). Sedangkan gerakan berputar elektron
terjadi pada energi yang lebih rendah lagi misalnya pada gelombang radio.

12
 Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi
suatu suatu yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel sampel
disinari dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Ketika cahaya
mengenai sampel sebagian akan diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian
lagi akan diteruskan. Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau
cahaya yang mengenai permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat
diukur, yang dapat diukur adalah It/I0atau I0/It (perbandingan cahaya datang dengan
cahaya setelah melewati materi (sampel)). Proses penyerapan cahaya oleh suatu zat
dapat digambarkan sebagai berikut:

Gambar 5. Proses penyerapan cahaya

Gambar diatas merupakan proses penyerapan cahaya oleh zat dalam sel
sampel. dari gambar terlihat bahwa zat sebelum melewati sel sampel lebih terang
atau lebih banyak di banding cahaya setelah melewati sel sampel. Cahaya yang
diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang hamburkan diukur
sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambert-beer atau Hukum Beer,
berbunyi: “Jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya)
yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi
eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan”. Pengurangan intesitas cahaya
monokromatis yang melalui suatu larutan berwarna berlangsung secara ekspnensial
dan bergantung pada panjang larutanyang dilalui cahaya dan kadar zat dalam
larutan.

Dimana: I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah intensitas

cahaya setelah melewati sampel,
I = Intensitas cahaya keluar

13
k = Konstanta yang didasarkan pada sifat-sifat zat dalam larutan
c = Konsentrasi zat tersebut
l = panjang larutan yang dilalui cahaya.
Rumus yang diturunkan dari Hukum Beer dapat ditulis sebagai:
A= a . b . c atau A = ε . b . c
Dimana:
A = absorbansi
b atau terkadang digunakan l = tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga
umumnya 1 cm)
c = konsentrasi larutan yang diukur
ε = tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam molar)
a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam ppm).
Perbandingan I/I0 disebut sebagai transmisi sinar (T) dan dinyatakan dalam
persen (%). Serapan absorbance) = A atau disebut juga kerapatan optic (optical
density) = OD, merupakan istilah yang lebih sering digunakan dan berasal dari
persamaan:
A = -log T, Jadi A=kcl
Pada alat spektrofotometer yang lebih canggih, sinar yang dating benar-
benar diusahakan berupa sinar monokromatis dengan cara membuat container
larutan (kuvet) yang sedemikian rupa, sehingga tidak ada sinar yang tertahan. Jika
jalur sinar pada setiap bagian kuvet itu sama, maka nilai k untuk berbagai senyawa
dalam berbagai larutan dan berbagai panjang gelombang dapat dihitung. Bila
konsentrasi dinyatakan mol/liter, jarak tempuh cahaya dalam cm, maka nilai k
disebut sebagai koefisien ekstingsi molar yaitu serapan atau absorbansi satu molar
suatu larutan dengan jarak tempuh cahaya 1 cm. Pada pengenceran kadar dalam
darah atau urin akan terjadi pengenceran bahan-bahan yang diperiksa dengan
berbagai pereaksi.
2.11 Kalibrasi Spektrofotometri UV-VIS
Yang perlu dikalibrasi adalah panjang gelombang dan absorbansi.
1. Kalibrasi Panjang gelombang
Menggunakan filter gelas helium oksida yang mempunyai panjang
gelombang acuan (nm) , pasang filter gelas holium oksida pada kompartemen
sampel dan kompartemen pembanding dibiarkan kosong (udara) , Scan spektrum
serapan holium oksida, bandingkan panjang gelombang spektrum yang diperoleh
dengan data panjang gelombang acuan.

14
2. Kalibrasi Absorbans
Buat larutan kalium dikromat 50 + 0,5 mg dalam 1 liter 0,005 mol/L asam
sulfat (larutan A) , Buat larutan kalium dikromat 100 + 1 mg dalam 1 liter 0,005
mol/L asam sulfat (larutan B) , buat larutan 0,005 mol/L asam sulfat sebagai
pembanding dan bandingkan hasilnya dengan data acuan (+ 2%).
3. Cara Pemeliharaan
Cara pemeliharaan spektrofotometer Uv- Vis adalah kompartment sampel
selalu dibersihkan, suhu penyimpanan stabil, meja permanen, gunakan stabilizer,
masukkan kuvet tegak lurus, alat harus selalu diperiksa, kuvet yang digunakan
harus bersih. Sebelum digunakan, biarkan mesin warming-up selama 15-20 menit.
Spektrofotometer sebisa mungkin tidak terpapar sinar matahari langsung, karena
akan dapat mengganggu pengukuran. Simpan spektrofotometer di ruangan yang
suhunya stabil dan diatas meja yang permanen. Pastikan kompartemen sampel
bersih dari bekas sampel. Saat memasukkan kuvet, pastikan kuvet kering. Lakukan
kalibrasi panjang gelombang dan absorban secara teratur.
4. Aplikasi
Uv-Vis spektroskopi secara rutin digunakan dalam kuantitatif penentuan larutan
dari logam transisi ion dan sangat dikonjugasikan senyawa organik, studi
fotoelektrokimia lapisan tipis CdS hasil deposisi metode CBD, meneliti pengaruh
kelembaban terhadap absorbansi optik lapisan gelatin dan dalam penentuan
konsentrasi suatu larutan yang belum diketahui konsentrasinya menggunakan
larutan standar.

15
 BAB III
PENUTUP
3.1 KESIMPULAN
1. Spektrofotometri Uv-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi, reflektansi dan absorbsi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang serta untuk pengukuran didaerah ultraviolet dan
didaerah tampak.
2. Prinsip Spektrofotometri Uv-Vis mengacu pada hukum Lambert-Beer.
Apabila cahaya monokromatik melalui suatu media (larutan), maka
sebagian cahaya tersebut akan diserap, sebagian dipantulkan dan sebagian
lagi akan dipancarkan.
3. Bagian-bagian Spektrofotometri Uv-Vis antara lain: sumber cahaya,
monokromator, Kompartemen sampel, detektor, read out.
4. Cara kerja Spektrofotometri Uv-Vis yaitu Cahaya yang berasal dari lampu
deuterium maupun wolfram yang bersifat polikromatis di teruskan melalui
lensa menuju ke monokromator pada spektrofotometer dan filter cahaya
pada fotometer. Monokromator kemudian akan mengubah cahaya
polikromatis menjadi cahaya monokromatis (tunggal).
5. Hal-hal yang diperhatikan pada Spektrofotometri UV-VIS antara lain:
Pembentukan molekul, Waktu operasional (operating time), Pemilihan
panjang gelombang, Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan.
6. Kelebihan Spektrofotometri UV-VIS yaitu: Panjang gelombang dari sinar
putih dapat lebih terseleksi, caranya sederhana, dapat menganalisa larutan
dengan konsentrasi yang sangat kecil.
7. Kekurangan Spektrofotometri UV-VIS yaitu: Absorbsi dipengaruhi oleh
pH larutan, suhu dan adanya zat pengganggu dan kebersihan dari kuvet
Hanya dapat dipakai pada daerah ultra violet yang panjang gelombang >185
nm, Pemakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung elektron
valensi dengan energy eksitasi rendah Sinar yang dipakai harus
monokromatis.
8. Yang perlu dikalibrasi adalah panjang gelombang dan absorbsi.

16
 DAFTAR ISI
 Cresswell, Clifford.J. 2005. Analisis Spektrum Senyawa Organik. Bandung:
ITB
 http://ammaazt.blogspot.com/2016/02/spektrofotometer-ultra-violet-
visibleuv.html
 http://andriyanto507.blogspot.com/2013/12/makalah-spektrofotometri-uv-vis-
infra.html

17