MAKALAH

SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

Disusun oleh:

1. Desi Herawati 70319038

2. Eka Pujiwati 70319061
3. Elmi Andriyani Salba 70319066
4. Sulis Setiyowati 70319095
5. Indah Safitri 70319103
6. Nurul Hilda Riskiana 70319156
7. Ribka Florensia 70319171
8. Sari Kusuma Widyastuti 70319178

PROGRAM STUDI DIPLOMA III FARMASI

INSTITUT ILMU KESEHATAN BHAKTI WIYATA KEDIRI

2019
 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kami panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena

atas kasih dan rahmat-Nya, makala ini dapat terselesaikan.

Makalah ini dibuat dengan tujuan untuk memenuhi tugas yang diberikan

oleh dosen serta memahami dan mengerti tentang spektrofotometri Uv-Vis dalam

bidang analisis instrumen.

Penulis menyadari bahwa, masih banyak kesalahan dan kekurangan di

dalam penulisan makalah ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan

saran yang konstruktif untuk kesempurnaan makalah ini di masa yang akan

datang. Semoga makalah ini dapat bermanfaat.

Surabaya, 9 November 2019

Tim Penyusun

i
 DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ........................................................................... i

DAFTAR ISI ......................................................................................... ii

BAB I. PENDAHULUAN .....................................................................1

1.1 Latar Belakang ...................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ................................................................. 2

1.3 Tujuan Penelitian .................................................................. 2

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ......................................................... 3

2.1 Spektrofotometri ................................................................... 3

2.2 Prinsip Kerja Spektrofotometri UV-Vis ............................... 5

2.3 Instrumentasi Spektrofotometer UV-Vis .............................. 9

2.4 Hukum Lambert-Beer ......................................................... 12

2.5 Aplikasi Spektrofotometer UV-Vis .................................... 14

BAB III. KESIMPULAN.................................................................... 16

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................... 17

ii
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Dengan semakin kompleksisitas berbagai keperluan saat ini, analisis kimia

dengan mempergunakan metoda fisik dalam hal identifikasi. Spektrofotometri

merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk

menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang

didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Sedangkan peralatan yang

digunakan dalam spektrofometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud

dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa

atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron yang ada pada

atom ataupun molekul yang bersangkutan. Para kimiawan telah lama

menggunakan bantuan warna sebagai bantuan dalam mengenali zat-zat kimia.

Spektrofotometri dapat dianggap sebagai suatu perluasan pemeriksaan visual yang

dengan studi lebih mendalam dari absorpsi energi radiasi oleh macam-macam zat

kimia memperkenankan dilakukannya pengukuran ciri-ciri serta kuantitatifnya

dengan ketelitian lebih besar (Day dan Underwood, 2002).

Spektorofotometri digunakan sebagai metode analisa yang didasarkan pada

pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada

panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi

difraksi dengan detektor fototube. Benda bercahaya seperti matahari atau bohlam

listrik memancarkan spektrum yang lebar terdiri atas panjang gelombang. Panjang

gelombang yang dikaitkan dengan cahaya tampak itu mampu mempengaruhi

1
selaput pelangi mata manusia dan karenanya menimbulkan kesan subyektif akan

ketampakan (vision). Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga daerah

panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV (200 – 380

nm), daerah visible (380 – 700 nm), daerah inframerah (700 – 3000 nm) (Khopkar

2003).

Spektrofotometri UV-Vis adalah pengukuran serapan cahaya di daerah

ultraviolet (200-380 nm) dan sinar tampak (380 – 700 nm) oleh suatu senyawa.

Serapan cahaya UV atau Vis (cahaya tampak) mengakibatkan transisi elektronik,

yaitu promosi elektron-elektron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah

ke orbital keadaan tereksetasi lebih rendah.

1.2. Rumusan Masalah

1. Prinsip dasar spektrofotometri Uv-Vis

2. Instrumentasi spektrofotometer Uv-Vis

3. Perhitungan Hukum Lambert-Beer

4. Aplikasi metode spektrofotometri Uv-Vis untuk analisis kuantitatif sediaan

farmasi

1.3. Tujuan

1. Mengetahui prinsip kerja spektrofotometer Uv-Vis

2. Mengetahui fungsi dari bagian-bagian spektrofotometer Uv-Vis.

3. Mengetahui hukum yang mendasari prinsip kerja spektrofotometer Uv-

Vis

4. Mengetahui keuntungan analisis secara spektrofotometer Uv-Vis

2
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Spektrofotometri

Spektrofotometri sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari

spektrometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari

spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat

pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Jadi

spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi relatif jika energi

tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi panjang

gelombang. Kelebihan spektrofotometer dengan fotometer adalah panjang

gelombang dari sinar putih dapat lebih di deteksi dan cara ini diperoleh dengan

alat pengurai seperti prisma, grating atau celah optis. Pada fotometer filter

dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek pada

panjang gelombang tertentu (Gandjar, 2007).

Salah satu syarat senyawa dianalisis dengan spektrofotometri adalah

karena senyawa tersebut mengandung gugus kromofor. Kromofor adalah gugus

fungsional yang mengabsorbsi radiasi ultraviolet dan tampak, jika diikat oleh

gugus auksokrom. Hampir semua kromofor mempunyai ikatan rangkap

terkonjigasi diena (C=C-C=C), dienon (C=C-C=O), benzen dan lain-lain.

Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elektron bebas, seperti –

OH, NH2, NO2,-X (Harmita, 2006).

Pada umumnya ada beberapa spektrofotometri yang sering digunakan dalam

analisis secara kimiawi, antara lain:

3
 a. Spektrofotometri UV (ultraviolet)

b. Spektrofotometri Vis (Visible)

c. Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis adalah gabungan antara spektrofotometri Uv dan

Visible, menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda pengukuran panjang

gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi

oleh sampel. Sinar ultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup

untuk mentransmisikan elektron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih

tinggi. Spektroskopi UV-Vis biasanya digunakan untuk molekul dan ion

anorganik atau kompleks di dalam larutan. Spektrum UV-Vis mempunyai bentuk

yang lebar dan hanya sedikit informasi tentang struktur yang bisa didapatkan dari

spektrum ini. Tetapi spektrum ini sangat berguna untuk pengukuran secara

kuantitatif. Spektrum elektromagnetik dibagi dalam beberapa daerah cahaya.

Suatu daerah akan diabsorbsi oleh atom atau molekul dan panjang gelombang

cahaya yang diabsorbsi dapat menunjukan struktur senyawa yang diteliti.

Spektrum elektromagnetik meliputi suatu daerah panjang gelombang yang

luas dari sinar gamma gelombang pendek berenergi tinggi sampai pada panjang

gelombang mikro (Marzuki Asnah, 2012).

4
 Gambar 2.1 Spektrum Elektomagnetik

Keuntungan utama metode spektrofotometri adalah bahwa metode ini

memberikan cara sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang sangat

kecil. Selain itu, hasil yang diperoleh cukup akurat, dimana angka yang terbaca

langsung dicatat oleh detector dan tercetak dalam bentuk angka digital ataupun

grafik yang sudah diregresikan (Yahya, 2013). Terdapat tiga jenis

spektrofotometer yaitu:

a. Singel beem (Berkas Sinar Tunggal)

Spektrofotometer jenis ini hanya memiliki satu berkas sinar saja sehingga

dalam melakukan pengukuran sampel dan larutan blanko atau standar harus

dilakukan secara bergantian dengan sel yang sama. Gambar 2.2 dibawah ini

adalah skema alat spektrofotometer UV-Vis yang memiliki sumber cahaya

tunggal, dimana sinyal pelarut dihilangkan terlebih dahulu dengan mengukur

pelarut tanpa sampel, setelah itu larutan sample dapat diukur.

5
 Gambar 2.2 Skema alat spektrofotometer UV-Vis single-beam

Gambar 2.3 spektrofotometer UV-Vis single-beam (spectronik 20)

b. Double beem (Berkas Ganda)

Spektrofotometer jenis ini hanya memiliki berkas sinar ganda, sehingga

dalam pengukuran absorbansi tidak perlu bergantian antara sampel dan

larutan blanko. Spektrofotometer jenis ini memakai absorbansi (A) otomatis

sebagai fungsi panjang gelombang.

Gambar 2.4 Skema alat spektrofotometer UV-Vis double-beam

6
c. Gliford Spektrofotometer

Spektrofotometer jenis ini keunggulan dapat membaca absorbansi (A)

sampai satuan 3 (Spektrofotometer biasa 0,1-1,0) karena jenis ini

menggunakan photomultiple feed back sircuit.

2.2. Prinsip Kerja Spektrofotometer UV-Vis

Prinsip kerja spektrofotometer yakni apabila cahaya yang berasal dari lampu

deuteriun maupun wolfram yang bersifat polikromatis diteruskan melalui lensa

menuju ke monokromator pada spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer.

Monokromator kemudian akan mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya

monokromatis (tunggal). Berkas-berkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian

akan dilewatkan pada sampel yang mengandung zat dalam konsentrasi tertentu.

Untuk itu terdapat cahaya yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan.

Cahaya yang dilewatkan ini kemudian diterima oleh detektor. Detektor kemudian

akan menghitung cahaya yang diterima dan mengetahui cahaya yang diserap oleh

sampel. Cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung

dalam sampel sehingga akan diketahui konsentrasi zat dalam sampel secara

kuantitatif (Dachriyanus, 2004).

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam analisis spektrofotometri Uv-Vis

adalah :

1. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis

Perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah

tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan menrubah menjadi senyawa lain

atau direaksikan dengan pereaksi tertentu.

7
2. Waktu Operasional

Biasa digunakan dalam pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna.

Bertujuan untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu

operasional ditentukan dengan mengukur hubungan anatara waktu

pengukuran dengan absorbansi larutan.

3. Pemilihan panjang Gelombang

Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang

gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Untuk memilih panjang

gelombang maksimal, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara

absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada

konsentrasi tertentu.

Dilihat secara kualitatif absorpsi cahaya dapat diperoleh dengan pertimbangan

absorpsi cahaya pada daerah tampak. Melihat obyek dengan pertolongan

cahaya yang diteruskan atau dipantulkan. Apabila cahaya polikromatis (cahaya

putih) yang berisi seluruh spektrum panjang gelombang melewati medium

tertentu, akan menyerap panjang gelombang lain, sehingga medium itu akan

tampak berwarna. Oleh karena hanya panjang gelombang yang diteruskan yang

sampai ke mata maka panjang gelombang inilah yang menentukan warna

medium. Warna ini disebut warna komplementer terhadap warna yang

diabsorpsi. Spektrum tampak dan warna-warna komplementer ditunjukkan dalam

Tabel 1 berikut ini :

8
 Tabel 1. Spektrum tampak dan warna-warna komplementer

Panjang gelombang Warna yang diabsorpsi Warna yang dipantulkan

340 –450 Lembayung Kuning – hijau

450 – 495 Biru Kuning
495 – 570 Hijau Violet
570 – 590 Kuning Biru
590 – 620 Jingga Hijau – biru
620 - 750 Merah Biru - hijau

2.3. Instrumentasi Spektrofotometer UVEN-Vis

Sebagai sumber cahaya biasanya digunakan lampu hidrogen atau deuterium

untuk pengukuran uv dan lampu tungsten untuk pengukuran pada cahaya tampak.

Panjang gelombang dari sumber cahaya akan dibagi oleh pemisah panjang

gelombang (wavelength separator) seperti prisma atau monokromator. Spektrum

didapatkan dengan cara scanning oleh wavelength separator sedangkan

pengukuran kuantitatif bisa dibuat dari spektrum atau pada panjang gelombang

tertentu. Secara sederhana instrument spektrofotometer dapat dilihat pada gambar

2.5 terdiri dari:

Sumber cahaya – monokromatis – sel sampel – detector- read

out

9
 Gambar 2.5 Pembacaan spektrofotometer

Fungsi masing-masing bagian :

1. Sumber c ah a ya

Sumber cahaya yang biasa digunakan pada spektroskopi absorbsi adalah

lampu wolfram. Pada daerah UV digunakan lampu hidrogen atau lampu

deuterium. Cahaya yang berasal dari lampu deuterium bersifat polikromatis,

berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan berbagai macam

rentang panjang gelombang.

2. Monokromator

Monokromator adalah alat yang akan memecah cahaya polikromatis menjadi

cahaya tunggal (monokromatis) dengan panjang gelombang tertentu.

Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu

mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi

cahaya monokromatis. Pada gambar di atas disebut sebagai pendispersi atau

penyebar cahaya dengan adanya pendispersi hanya satu jenis cahaya atau

cahaya dengan panjang gelombang tunggal yang mengenai sel sampel. Pada

gambar di atas hanya cahaya hijau yang melewati pintu keluar. Proses

dispersi atau penyebaran cahaya seperti yang tertera pada gambar 2.6.

10
 Gambar 2.6 Proses dispersi cahaya

3. Wadah sampel (Kuvet)

Kuvet merupakan wadah sampel yang akan dianalisis. Kuvet dari leburan

silika (kuarsa) dipakai untuk analisis kualitatif dan kuantitatif pada daerah

pengukuran 190-1100 nm, dan kuvet dari bahan gelas dipakai pada daerah

pengukuran 380-1100 nm karena bahan dari gelas mengabsorbsi radiasi UV.

Gambar 2.7 Kuvet

4. Detektor

Detektor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan. Sinar kemudian

diubah menjadi sinyal listrik oleh amplifier dan rekorder akan ditampilkan

dalam bentuk angka-angka pada reader (komputer).

11
5. Read out

Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat

listrik yang berasal dari detector, menyatakan dalam bentuk % transmitan

maupun abrorbansi. Adapun hal-hal yang harus diperhatikan dalam

spektrofotometri adalah :

a. Pada saat pengenceran alat alat pengenceran harus betul-betul bersih tanpa

adanya zat pengotor

b. Dalam penggunaan alat-alat harus betul-betul steril

c. Jumlah zat yang dipakai harus sesuai dengan yang telah ditentukan

d. Dalam penggunaan spektrofotometri uv, sampel harus jernih dan tidak

keruh

e. Dalam penggunaan spektrofotometri uv-vis, sampel harus berwarna

(Khopkar, 2003).

2.4. Hukum Lambert-Beer

Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan linearitas antara absorban

dengan konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan.

Dalam hukum Lambert-Beer tersebut ada beberapa pembatasan yaitu:

a. Sinar yang digunakan dianggap monokromatis

b. Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang yang

sama

c. Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap

yang lain dalam larutan tersebut.

d. Tidak terjadi fluoresensi atau fosforisensi

12
 e. Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan

Hukum Lambert-Beer menyatakan jika suatu cahya monokromatis dengan

kekuatan Po dilewatkan kepada balok yang tegak lurus pada permukaan dengan

ketebalan b dan mengandung n partikel pengabsorbsi, maka kekuatan cahaya

menurun menjadi P, dapat dilihat dalam persamaan :

P = Po 10-abc

-log P/P = abc

-log T = abc

A = a.b.c

Keterangan :

T : transmisi

A : absorbansi

a : absopsivitas molar

b : tebal kuvet (cm)

c : konsentrasi

Hukum Lambert-Beer menyatakan nilai absorbansi cahaya berbanding lurus

dengan konsentrasi dan ketebalan bahan/medium. Cahaya akan diserap jika energi

cahaya sesuai dengan energi yang dibutuhkan untuk mengalami perubahan dalam

molekul. Absorbansi larutan bertambah dengan pengurangan ketebalan dan

konsentrasi. Nilai absorbansi berbanding terbalik dengan transmitan. Energi

maksimum yang diserap oleh larutan ditujukan pada panjang gelombang yang

memiliki nilai absorbansi tertingi dan % transmitan terendah. Energi maksimum

dinyatkan dengan:

13
 E = h f atau

E = h c/ λ

Keterangan : E = energi cahaya

h = konstanta Planck (6,67492 x 10-34 j sec)

f = frekuensi

c = panjang gelombang cahaya (3 x 108)

λ = panjang gelombang

2.5. Aplikasi Spektrofotometri UV-Vis

Salah satu contoh aplikasi penggunaan UV-Vis untuk analisis kuantitatif

sediaan farmasi yang dilakukan oleh pri iswati dan sahara feronika :

o Penetapan Kadar Levofloksasin Dalam Tablet Dengan Metode

Spektrofotometri UV-Vis

Dalam penetapan kadar Levofloksasin digunakan bahan antara lain baku

pembanding yaitu Levofloksasin, tablet Levofloksasin sebagai sampel dan

aquabidestilata sebagai pelarut. Dengan metode yakni dilakukan pembuatan

larutan baku Levofloksasin 1000 µg/mL dalam pelarut aquabidestilata. Dilakukan

penentuan panjang gelombang maksimal untuk larutan baku Levofloksasin 10

µg/mL, dibaca pada serapan pada λ 200 – 400 nm dan ditentukan panjang

gelombang maksimum. Dibuat kurva kalibrasi Levofloksasin dengan kadar

larutan baku seri kadar 3,5,7,8,9 µg/mL dibaca pada panjang gelombang

maksimal. Dibuat kurva hubungan antara kadar versus serapan kemudian

ditentukan persamaan regresi linier serta koefisien korelasinya. Kemudian

dilakukan validasi metode analisisnya dengan pengukuran presisi yang dikatakan

14
baik apabila KV ≤ 2%, linearitas dan ketepatan. Untuk metode penetapan kadar

Levofloksasin disiapkan sebanyak 10 tablet yg memenuhi keseragaman bobot

digerus hingga halus dan homogen. Serbuk tablet ditimbang dengan seksama

setara dengan 100 mg Levofloksasin, dilarutkan sampai 100 mL dengan

aquabidestilata. Kemudian dilakukan pengenceran 250 kali dengan

aquabidestilata. Kemudian didiamkan pada operating time dan absorbasinya

dibaca pada panjang gelombang maksimum. Hasil yang didapatkan dari scanning

didapatkan panjang gelombang maksimum untuk larutan Levofloksasin pada 289

nm, hasil spektrum dapat dilihat pada gambar 2.7 dan kurva baku Levofloksasin

gambar 2.8

Gambar 2.7 Spektrum Levofloksasin

Gambar 2.8 Kurva Baku Levofloksasin

15
Diadapatkan hasil persamaan kurva baku:

y = 0,0823 x – 0,0391 dan r = 0,9917

Tabel 2. Hasil Validasi Metode Analisa

Keterangan Hasil Persyaratan
Ketelitian (presisi) RSD : 0,59 % RSD : < 2%,
kerelitian 99,994%
Linearitas r = 0,9917 r = ± 1 atau nilai r hitung >
r tabel
Ketepatan % recovery 106,55 % % recovery 80-120 %
± 10,33% (KV 9,69)

Tabel 3. Hasil Penetapan Kadar Tablet Levofloksasin Generik

Berat
Ulangan Penimbangan Kadar mg/tab % Etiket
(mg)
1 145,78 519,44 103,80
2 145,80 531,46 106,29
3 145,82 525,72 105,15
Rata-rata 145,80 525,53 105,11

Berdasarkan hasil diatas dapat disimpulkan bahwa metode

spektrofotometri UV-Vis sensitif untuk penetapan kadar levofloksasin dalam

tablet.

16
 BAB III

KESIMPULAN

Berdasarkan dari penjelasan diatas dapat kita mengabil kesimpulan bahwa

Spektrofotometer UV-Vis merupakan Spektrofotometer yang dapat digunakan

untuk pengukuran di daerah ultra violet dan di daerah tampak. Spektrofotometer

UV-Vis adalah salah satu instrumen yang dapat digunakan dalam menganalisa

suatu senyawa kimia baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Spektrofotometri

dapat tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel

pengabsorbsi untuk larutan sampel atau blanko dan suatu alat pengukur perbedaan

adsorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding. Cara kerja

spektrofometer UV-Vis yaitu sinar dari sumber radiasi diteruskan menuju

monokromator, cahaya dari monokromator diarahkan terpisah melalui sampel

dengan cermin berrotasi, detektor menerima cahaya dari sampel secara bergantian

dan berulang-ulang kemudian sinyal listrik dari detektor diproses dan diuvah ke

digital sehingga dapat dilihat hasilnya untuk dilakukan perhitungan dengan

komputer yang sudah terprogram.

17
 Daftar Pustaka

Dachriyanus, 2004. Analisis Struktur Senywa Organik Spektroskopi. Padang :

LPTIK.

Day R dan Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta, Erlangga.

Gandjar, I.G., dan rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta :

Pustaka pelajar

Harmita. 2006. Analisis Kuantitatif Bahan Baku dan Sediaan Farmasi. Jakarta :
UI Press.

Khopkar S.M., 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press.

18