BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kimia analitik adalah cabang ilmu kimia yang berfokus pada analisis material untuk
mengetahui komposisi, struktur, dan fungsi kimiawinya. Secara tradisional, kimia analitik
dibagi menjadi dua jenis, kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif bertujuan untuk
mengetahui keberadaan suatu unsur atau senyawa kimia, baik organik maupun anorganik,
sedangkan analisis kuantitatif bertujuan untuk mengetahui jumlah suatu unsur atau senyawa
dalam suatu cuplikan.
Kimia analitik modern dikategorisasikan melalui dua pendekatan, target dan metode.
Berdasarkan targetnya, kimia analitik dapat dibagi menjadi kimia bioanalitik, analisis
material, analisis kimia, analisis lingkungan, dan forensik. Berdasarkan metodenya, kimia
analitik dapat dibagi menjadi spektroskopi, spektrometri massa, kromatografi dan
elektroforesis, kristalografi, mikroskopi, dan elektrokimia.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC
(Hight Performance Liquid Chromatograhy ) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan
awal tahun 1970-an. Saat ini KCKT merupakan tekhnik pemisahan yang diterima secara
luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam sebidang,
antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer dan industri-industri makanan.
Beberapa perkembangan KCKT terbaru antra lain : miniaturisasi`sistem KCKT, penggunaan
KCKT untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat dan analisisi
senyawa-senyawa kiral.
Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC, High Performance Liquid Chromatography)
merupakan suatu tekhnis analisis obat yang paling cepat berkembang. Cara ini ideal untuk
analisis beragam obat dalam sediaan dan cairan biologi, karena sederhana dan kepekaannya
tinggi. KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu
seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis;
menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintetis, atau
1

produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor sampel-sampel yang berasal

dari lingkungan ; memurnikan senyawa-senyawa dalam suatu campuran ; memisahkan
polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran; kontrol
kualitas dan mengikuti jalannya reaksi sintetis.
Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT
dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya
sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan
dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa- fasa ini membentuk suatu lapisan
stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang
merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa stasioner/diam dapat berupa zat
padat atau suatu cairan, dan fasa gerak dapat berbentuk cairan ataupun gas. Maka semua
jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat,gas-padat, caircair, dan gas-cair (Day dan Underwood, 2002). Fase diam akan menahan komponen
campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang
mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut
dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan
dalam memisahkan suatu campuran senyawa.
Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi
piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu
menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid
chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom
dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm;
sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).
HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase
diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit
( kolom ) dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan
memakai tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan
waktu yang relative singkat. HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima
secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada
2

sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industriindustri makanan.

1.2 Tujuan
Tujuan dari pembuatan makalah ini adalah :
1.
2.
3.
4.

Untuk mengetahui komponen utama dari HPLC.

Untuk mengetahui prinsip kerja dan penerapan dari HPLC.
Untuk mengetahui kelebihan dan kekurangan metode analisis dengan HPLC.
Untuk mengetahui penerapan HPLC dalam analisis senyawa (obat) dalam campuran

1.3 Rumusan Masalah

1. Bagaimana penerapan HPLC dalam analisis senyawa (obat) dalam campuran?

BAB II
3

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Perkembangan Kromatografi

Kromatografi pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen yang
akan dipisahkan terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur yaitu fasa diam
dan fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat terlarut oleh
suatu proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih,
salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan
didalamnya zat-zat itu menunjukkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan
tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti, 1998).
Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang
berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga
menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah
yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.
Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu
teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC).
Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai
berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh
Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya
yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan
Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum
langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952
Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara
tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik
analisis yang canggih (Sudjadi, 1986).
Kromatografi cair kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan
dimana fase cair yang mengalir perlahan-lahan melewati kolom akibat gaya gravitasi dan
terjadi proses pemisahan di kolom tersebut. Metode itu dicirikan dengan efisiensi kolom
yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian
4

dalam teknik kolom cair kembali dilirik dengan dikembangkannya sistem kolom bertekanan
tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang mampu bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2
(3000p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel
pendukung berukuran sekitar 30 nm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir
yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat
(sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cair yang biasa (Bassett et. all.,
1994).
Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar,
pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya
sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk
pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi
atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed= Kecepatan Tinggi dan
Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya
instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk
mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom
dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yangsudah matang dan dengan
cepat HPLC mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas (Putra, 2004).
Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah
contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom
tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan
sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa
sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak
yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah
dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom.
Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi
cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari
kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8
mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan
tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).

HPLC telah digunakan di Indonesia sejak tahun 1997 oleh Wiadnyana dalam
penelitiannya yang bertema menguji dan menentukan kadar toksisitas berbagai macam
fitoplankton di perairan laut. Selain digunakan untuk uji toksisitas, dalam bidang Biokimia
HPLC kerap digunakan untuk menghitung kadar vitamin dan protein dari suatu makanan atau
sampel. Singkatnya, HPLC merupakan sebuah metode analisa modern yang multifungsi dan
sudah ada di Negara kita Indonesia. Oleh karena itu ijinkan penulis untuk bercerita sedikit
tentang High Perfomance Liquid Chromatography.
2.2 Teknik Pemisahan dengan HPLC
Tehnik pemisahan dalam kromatografi melibatkan dua fasa, yakni fasa diam yaitu padat
atau cairan yang terikat pada padatan pendukung, dan fasa gerak yang berupa gas dan cair.
Proses pemisahan dalam kromatografi di dasarkan pada perbedaan laju migrasi masingmasing komponen dalam sistem kromatografi. Perbedaan laju migrasi dari masing-masing
komponen merupakan akibat dari perbedaan keseimbangan distribusi masing-masing
komponen diantara fasa gerak dan fasa diam. Metode kromatografi dibedakan dalam
beberapa macam, berdasar pada fasa gerak, fasa diam, mekanisme, dan tehnik yang
digunakan dan salah satu diantaranya adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC).
Dalam kromatografi cair Kinerja tinggi ini fasa gerak yang digunakan berupa cairan,
sedangkan fasa diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada kolom tertutup
(melekat secara kimia dalam kolom tersebut). Maksud dan tujuan analisis dengan
kromatografi yaitu didapatnya pemisahan yang baik demikian halnya dalam HPLC
diharapkan pemisahannya baik dan dalam waktu proses yang relative singkat. Untuk
mencapai Tujuan analisis ini, maka dipilih pelarut pengembang yang sesuai dengan
komponen yang dipisahkan, kolom yang digunakan juga harus diperhatikan, dan detector
yang memadai.
Parameter baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada lima factor, yaitu
waktu retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, resolusi, dan factor ikutan.
a. Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu
komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat
konsentrasi maksimum.

b. Faktor kapasitas (k) juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika
nilai k kecil, maka komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k yang
lebih besar, maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama
dan dan puncaknya melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k optimum, yaitu antara 1
sampai 10. Kolom dinyatakan baik jika cukup selektif artinya mampu menahan berbagai
komponen dengan kekuatan yang cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan yang baik maka
nilai selektivitas () harus lebih besar daripada 1., dimana semakin besar nilai maka
pemisahannya akan semakin baik. Nilai dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa
gerak (misal: memperbesar polaritas); mengubah fasa diam; mengubah temperature,
karena pada umumnya kenaikan temperature akan memperkecil waktu retensi; dan
mengubah bentuk komponen.
c. Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan
dengan hasil yang memuaskan dan dalam waktu yang singkat.
d. Keterpisahan antara dua puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi R (ukuran
besar kecilnya pemisahan). Jika nilai R 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik.
e. Sedangkan factor terikutan (Tf) merupakan ukuran kesimetrisan suatu puncak. Dengan
catatan nilai Tf < 2,0.
Perkembangan HPLC berkembang dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke
arah yang lebih luas, yaitu proses pemisahan yang berasaskan afinitas. Filtrasi gel dan ion
yang berpasangan., akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan di dalam kolom
disertai pemakaian pelarut pengembangdengan tekanan tinggi (Ahmad dan Suherman, 1995).
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair cair yang dapat digunakan
baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan
teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam
kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Kegunaan umum HPLC
adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ;
analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile);
penentuan molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian
senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawasenyawa dengan jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam
skala proses industry.

2.3 Prinsip Kerja Dari KCKT

Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut
terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom
kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase
diam.
2.4 Kegunaan KCKT
Kegunaan umum KCKT adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities) ; analisis
senyawa-senyawa tidak menguap (non-volatil) ; penentuan molekul-molekul netral, ionik,
maupun zwitter ion ; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang
strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace
element), dalam jumlah banyak dan dalam skala proses industri. KCKT merupakan metode
yang tidak dekstruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.
2.5 Mekanisme Kerja KCKT
Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai
macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom,
kecepataan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel.
Instrumen KCKT pada dasarnya tersiri atas delapaan komponen pokok yaitu :
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Wadah fase gerak

Sistem penghantaran fase gerak
Alat untuk memasukkan sampel
Kolom
Detektor
Wadah penampung buangan fase gerak
Tabung penghubung
Suatu komputer atau integrator atau perekam

Gambar Rangkaian Instrumen HPLC

1. Wadah fase gerak pada KCKT

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Sebelum menggunakan fase gerak
harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya
gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga
akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut pada fase gerak maka sangat
dianjurkan untuk menggunakan pelarut, bufer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat
tinggi xdan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT
berderajat KCKT (HPLC grade).
2. Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi, yang
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponenkomponen sampel.
Deret eluotrofik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan hal penting dalam
pemilihan fase gerak.

Adapun ciri-ciri yang harus dimiliki oleh fase gerak pada KCKT, yaitu :
1) Kemurnian tinggi (high purity), yaitu cairan eluen yang tidak terkontaminasi.
2) Kestabilan tinggi, yaitu eluen yang tidak bereaksi dengan sampel atau zat yang
berfungsi sebagai fase diam.
3) Kekentalan rendah, yaitu kerapatan eluen sekecil mungkin.
4) Dapat melarutkan sampel, tidak mengubah kolom dan sifat kolom serta cocok
dengan detektor.
Beberapa deret eluotropik KCKT :
Parameter
Pelarut

n-heksana
Sikloheksana
Tetraklorometan

kekuatan
pelarut
(adsorbsi)
0,01
0,04
0,18

Parameter
kekuatan pelarut
(partisi)
0,1
-0,2
1,6

UV cut off
(nm)
195
200
265

Nilai pemenggalan UV merpakan panjang gelombang yang mana pada kuvet 1 cm,
pelarut akan memberi absorbasi lebih dari 1,0 satuan absorbansi. Sangat dianjurkan untuk
menggunakan panjang gelombang deteksi yang tidak bertepatan atau di sekitar panjang
gelombang pemenggalan UV pelarut yang digunakan sebagai fase gerak.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik
adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan
asetonitril.Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan
adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau
menggunakan pelarut jenos alkohol.
3. Pompa
Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu pompa kinerja konstan (constant
pressure) dan pompa pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan
dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa
reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena
itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis
dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan
10

utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang
tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
Tujuannya adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung
secara tepat.Ada 2 jenis pompa KCKT yaitu : pompa dengan tekanan konstan dan pompa
aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tekanan
konstan.
Syarat syarat pompa yang ideal:
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
j.

Mampu membangkitkan tekanan tinggi

Pulse free out put
Control laju alir yang akurat
Tahan korosi
Terbuat dari bahan yang tahan terhadap fasa gerak
Bebas pulsa
Perlude gasser
Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar
Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien
Bekerja pada tekanan sampai 6000 psi (400 atm)

Tiga jenis pompa yang sering digunakan dalam sistem KCKT yaitu :
1) Pompa Bolak-balik (reciprocating pump)
Jenis pompa yang paling banyak digunakan. Kelebihan pompa jenis ini adalah volume
internalnya kecil sekitar 35 400 l, tekanan hingga 10.000 psi, kemampuan untuk
adaptasi menggunakan elusi gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas dari
tekanan balik kolom dan akibat dari kekentalan solven.
2) Pompa Sistem Penggantian (displacement pump)
Sistem penggantian menggunakan sebuah wadah besar seperti syringe dengan sebuah
penekan yang digerakan oleh motor. Menghasilkan aliran yang bebas tekanan balik,
tidak dipengaruhi kekentalan dan bebas denyut. Kekurangan pompa jenis ini adalah
kapasitas pompa terbatas hanya 250 ml dan cukup sulit saat solven harus mengalami
penggantian.
3) Pompa Tekanan Udara (pneumatic pump)
Bentuk paling sederhana sebuah pompa pneumatik merupakan wadah yang ditekan
oleh gas bertekanan tinggi. Harga relatif murah dan bebas denyut merupakan
kelebihan jenis pompa ini. Kekurangannya terletak pada kapasitas terbatas, tekanan
keluaran terbatas hanya sekitar 2000 psi, dipengaruhi oleh tekanan balik dan
kekentalan solven dan tidak dapat digunakan untuk sistem elusi gradien.
11

4. Injektor (penyuntikan sampel)

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fase gerak
yang mengalir dibawah tekanan meuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat
dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample
loop) internal atau eksternal. Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan
mengharapkan bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses
ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah
mempelajarinya).
Pada saat pengisian, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya
dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan katup diputar sehingga fase gerak
mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi
penyuntikkan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1 %. Penyuntikkan
ini mudah digunakan untuk otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada
KCKT.
Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom. Waktu yang
dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut
sebagaiwaktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel
diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari
senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.
Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung
pada: tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel) komposisi yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom 1. Elusi Gradien Elusi
Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis
kromatografi berlangsung.
Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa
yang tertahan kuat pada kolom. Dasar- dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder. Elusi
Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
12

d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak

5. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :
Parameter
Tabung
kolom

Fase diam

Kolom konvensional
Kolom mikrobor
Stainless steel
Stainless steel
Panjang 3,10,15,20 dan 25 Panjang 25 dan 50 cm
Diameter luar 0,25 inci
cm
Diameter dalam 1 atau 2 mm
Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 4,6 cm
Porous, silika ukuran kecil, Porous, silika ukuran kecil, silika
silika

yang

dimodofikasi yang dimodofikasi secara kimiawi

secara

kimiawi

phase),

atau

polimer

Tekanan
operasional

Fase gerak

phase),

atau

stiren/divinil rata diameter partikel 3,5 atau

3,5

diameter 10m dengan kisaran sempit.

atau

10m

dengan kisaran sempit.

500-3000 psi
(35-215 bar

1000-5000 psi
(70-350 bar)

Hidrokarbon+pelarut

Hidrokarbon+pelarut

terklorinasi

atau

terbalik

terklorinasi

alkohol atau alkohol untuk fase normal.

untuk fase normal. Untuk Untuk

fase

polimer-

polimer- polimer stiren/divinil benzen.Rata-

benzen.Rata-rata
partikel

(bonded (bonded

fase

terbalik

(reversed

(reversed phase) digunakan metanol atau

phase) digunakan metanol asetonitril

atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan

air
alir

atau
10-100

bufer.Kecepatan alir : 1-3 l/menit.Modifikasi instrumen

Sistem penghantaran pelarut yang
ml/menit
mampu memberikan kontrol aliran
di bawah 10l/menit.Katup injeksi
sampekl

bervolume

kecil;sel

detektor bervolume kecil.

13

Kinerja

Efisiensi meningkat dengan Sangat efisiensi dan sensitif, akan

bekurannya ukuran partikel tetapi lambat,konsumsi fase gerak
fase diam, akan tetapi umur hanya dari kolom konvensional.
kolom

dengan

ukuran

partikel 3 m lebih pendek.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibandingkan dengan kolom
konvensional, yakni :
1. Konsumsi fase gerak mikrobor hanya 80% atau lebhi kecil dibandingkan dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih
lambat (10-100 l/menit)
2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.
3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis
kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Kolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel, walaupun
untuk tekanan di bawah 600 psi kolom kaca dapat digunakan. Kolom untuk analisis
KCKT memiliki ukuran panjang kolom berkisar dari 10 30 cm berbentuk lurus dan jika
diperlukan dapat disambung dengan kolom yang lain. Diameter dalam kolom 4 10 mm
dengan ukuran partikel 5 10 m. Kolom dari jenis ini mempunyai 40.000 hingga
60.000 lempeng/meternya.
Saat ini, pabrik pembuat kolom telah merancang dan memproduksi kolom dengan
kecepatan dan kinerja tinggi. Beberapa kolom hanya memiliki panjang 1 hingga 4,6 cm
dengan ukuran partikel 3 5 m. Beberapa jenis kolom memiliki jumlah lempeng hingga
100.000 hanya dengan panjang 3 sampai 7,5 cm dengan kelebihan pada kecepatan dan
sedikitnya solven yang diperlukan dalam pemisahan. Jumlah solven minimum menjadi
pertimbangan penting karena mahalnya solven dengan tingkatan kromatografi
(chromatography grade).
Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair yaitu jenis pellicular dan
partikel berpori (porous particle). Jenis pellicular terdiri dari partikel dengan bentuk bola,
tidak berpori berbahan dasar gelas atau polimer dengan diameter 30 hingga 40 m.

14

Lapisan tipis berpori silika, alumina, divinil benzen sintetis polystirena atau resin penukar
ion dilapiskan pada permukaannya.
Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel berpori dengan diameter
partikel 3 10m terbuat dari silika, alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena
atau resin penukar kation yang kemudian dilapisi lapisan tipis film berbahan organik
sehingga berikatan secara kimia atau fisika terhadap permukaannya. (Skoog et al., 1998)
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Berbeda dengan kolom
kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable). Banyak analisis
yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi,
kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan. Kolom diisi dengan partikel
padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu cairan yang berfungsi
sebagai fasa diam. Komponen-komponen sample dibawa oleh cairan fasa gerak yang
dialirkan dengan bantuan tekanan tinggi melewati kolom fasa diam.
Komponen- komponen dipisahkan berdasarkan partisi antara fasa diam dan fasa
gerak yang satu sama lain tidak bercampur. Efisiensi kolom salah satunya sangat
tegantung dari besarnya partikel fase stasioner. Oleh karena itu bila ukuran fase stasioner
lebih kecil, maka tinggi plat teoritik akan berkurang, sehingga jumlah plat teoritik akan
bertambah, yang meningkatkan efisiensi kolom. Dengan kolom yang pendek dan
efisiensi, pemisahan akan berjalan dengan cepat.
Terdapat banyak analisis yang dikerjakan pada suhu kamar, suhu kolom sering
dapat diatur dengan konstan dengan memakai cara pemanasan. Sering dibutuhkan suhu
kolom yang lebih tinggi dari suhu kamar untuk mengatasi masalah daya larut solute yang
dianalisis dan viskositas fase gerak yang agak tinggi.
6. Fase diam
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen.Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus
silanol (Si-OH).

15

Silika yang dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen

yang akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus
fungsional yang lain. Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang
stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang
dimodifikasi ini mempu karekateristik kromatografi dan selektifitas yang berbeda jika
dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi.
Oktadesil silika (ODS atau C18 )merupakan fase diam paling sering digunakan
karena mampu memisahkan senyawa-senyawa denngan kepolaran yang rendah, sedang
maupun tinggi.
Solut-solut yang polar, terutama yang bersofat basa akan mengekor (tailing peak)
pada penggunaan fase diam silika fase terikat. Hal ini disebabkan oleh adanya interaksi
adsorbsi antara solut-solut ini dengan residu silanol dan pengotor logam pada
silika.Masalah ini dapat diatasi dengan end-chapping yakni proses menutupi residu
silanol ini dengan gugus-gugus trimetilsilil dan menggunakan silika dengan
menggunakan silika dengan kemurnian yang tinggi (kandungan logam <1ppm)
7. Detektor KCKT
Detektor pada KCKT dikelompokkan dalam 2 golongan yaitu : detektor universal
(yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik dan tidak bersifat
selektif) seperti detektor indeks bias dan detektro spektrometri massa; dan golongan
detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif
seperti detektor UV-Vis, detektor Fluoresensi dan elektrokimia.
Detektor ideal pada sistem KCKT mempunyai persyaratan :
1)

Memiliki sensitifitas yang memadai. Kisaran umum sensitifitas berkisar dari 10 -8

hingga 10-15gram zat terlarut per pembacaan

2)

Stabil dan memiliki keterulangan yang baik

3)

Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi

4)

Waktu respon yang singkat

5)

Kemudahan pada penggunaan

6)

Memiliki volume internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran puncak

Suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
16

2. Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil.
3. Stabil dalam pengoperasiannya
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8l atau lebih kecil, sementara kolom
mikrobor selnya bervolume 1 l atau lebih kecil lagi.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang
luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Beberapa jenis detektor yang digunakan pada sistem KCKT :
1) Detektor Absorban (UV-Vis)
Pada detektor absorban, aliran akan mengalir melalui detektor dari kolom
kromatografi. Untuk meminimalkan pelebaran puncak, detektor dirancang dalam
volume yang sekecil mungkin. Ukuran volume dibatasi 1 10 l dengan panjang sel
2 10 mm. Umumnya sel detektor mampu menahan tekanan hingga 600 psi sehingga
peralatan pengurang tekanan diperlukan sebelum aliran memasuki detektor.
2) Detektor Fluorescens
Detektor fluorescens yang digunakan sama halnya dengan detektor pada
spektrofluoro-fotometer. Detektor paling sederhana menggunakan lampu merkuri
sebagai sumber cahaya dan filter untuk mengisolasi panjang gelombang emisi radiasi.
Lampu Xenon digunakan pada instrumen yang lebih baik dengan gratting sebagai
monokromatornya.
3) Detektor Refraktif Indeks
Detektor jenis ini bekerja dengan mengukur nilai indeks bias yang senyawa yang
melalui sel. Sel akan mengukur indeks bias solven fasa gerak sebagai blanko dan
sampel secara bersamaan untuk mendapatkan nilai indeks bias relatif.
4) Detektor Elektrokimia
Detektor dengan mendasarkan kerjanya pada pengukuran arus listrik. Perubahan arus
akan dideteksi terhadap waktu dan ditampakkan dalam bentuk kromatogram. Contoh
penggunaan detektor adalah pada penetapan senyawa tiol dan disulfida.
5) Detektor Spektra Massa

17

Sejumlah fraksi kecil cairan dari kolom dimasukkan ke dalam spektrometer massa
pada kecepatan alir 10 50 l per menit atau menggunakan termospray. Analat akan
diionisasikan, dipisahkan pada analisator, dibaca oleh detektor dan menghasilkan
spektrum massa.
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode
umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.
Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang
gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom
dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan
langsung berapa besar sinar yang diserap.
Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang
melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang
digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda,
senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda
dari specktrum UV.
2.6 Jenis Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
a. Kromatografi adsorbsi
Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang bersifat
agak polar. Partikel-partikel silika atau alumina biasanya digunakan sebagai adsorben.
Jenis kromatografi ini menggunakan fasa gerak non polar seperti heksana dan disebut
jugakromatografi fasa normal.
b. Kromatografi partisi
Kromatografi partisi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa non polar. Jenis
kromatografi ini disebut dengan kromatografi fasa terbalik karena fasa geraknya lebih
polar daripada fasa diam. Salah satu kendala kromatografi ini adalah keterbatasan
selektivitas sebagai ketidakcampuran kedua fasa. Karena keterbatasan ini maka
kromatografi partisi tidak digunakan lagi sebagai teknik analisis rutin.
c. Kromatografi fasa terikat
Kromatografi fasa terikat merupakan teknik HPLC yang paling penting dan paling
banyak digunakan saat ini. Dalam hal penerapann kromatografi fasa terikat dan
18

kromatografi partisi memiliki persamaan. Akan tetapi, sorben fasa terbalik terdiri dari
partikel silika yang dimodifikasi secara kimia dengan rantai alkil sebaliknya, fasa diam
pada kromatografi partisi terdiri dari partikel yang dilapisi secara fisik dengan zat cair
non polar.
Keuntungan kromatografi fasa terikat, yaitu :
1)
2)

Merupakan fasa yang stabil

Kepolaran fasa gerak dapat diubah selama proses pemisahan berlangsung bila

kepolaran solut-solut bervariasi.

3) Kolom mempunyai umur panjang.
4) Memiliki keterulangan waktu retensi yang baik.
5) Lebih ekonomis.
d. Kromatogarfi penukar ion
Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan campuran ion-ion atau molekulmolekul yang dapat diionkan. Ion-ion bersaing dengan ion-ion fase gerak untuk
memperebutkan tempat berikatan dengan fasa diam. Dasar pemisahan kromatografi ini
berasal dari perbedaan afinitas senyawa bermuatan terhadap permukaan penukar ion.
e. Kromatografi ekslusi ukuran
Ukuran molekul merupakan kriteria utama dalam pemisahan dengan kromatografi ekslusi
ukuran. Pemisahan terjadi karena solut-solut berdifusi masuk dan keluar pori-pori paking
kolom. Molekul-molekul yang lebih besar dari diameter pori-pori akan melewati kolom
secara cepat dan dikenal dengan istilah volume terekslusi begitu pula sebaliknya. Teknik
ini berguna untuk mengkarakterisasi distribusi berat molekul polimer, pemurnian
cuplikan biologis dan pemisahan senyawa-senyawa dengan berat molekul 2000 atau lebih
2.7 Ada 3 sistem KCKT yang dikenal, yaitu:
1. Sistem elusi isokratik (isocratic elution)
Sampel diinjeksikan ke dalam kolom yang komposisi fasa geraknya tidak berubah selama
analisis dilakukan sampai sampel terelusi dari kolom, sistem isokratik yang memiliki
nilai k (rasio atau koefisien partisi yang bervariasi) akan menghasilkan resolusi yang
buruk dan sukar mendeteksi pita elusinya.
2. Sistem elusi gradient (gradient elution)

19

Ada perubahan fasa gerak baik secara bertahap atau berkesinambungan selama proses
berlangsung. Pada mula-mula elusi, seluruh komponen sampel ditahan di bagian atas
kolom, setelah gradien mulai, kekuatan elusi fase gerak akan meningkat. Pada akhirnya
harga k akan menjadi cukup kecil sehingga komponen zat tersebut akan bermigrasi
sepanjang kolom secara cepat sampai ia keluar dari kolom.
3. Sistem elusi bertahap
Baik digunakan untuk sampel yang mengandung komponen-komponen yang bergerak
cepat, yang diikuti senyawa-senyawa yang lambat gerakannya, tetapi tidak mengandung
senyawa dengan nilai k setelah sampai diinjeksikan. Komposisi fase gerak secara
bertahap diganti.
Hasil sistem KCKT dan optimasinya sangat tergantung pada beberapa hal, antara lain :
a.
b.
c.
d.
e.

Temperatur
Tekanan
Diameter partikel fase diam
Viskositas
Panjang kolom

2.8 Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC

Kromatografi

Cair

Kinerja

Tinggi

(HPLC)

atau

High

Pressure

Liquid

Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC
termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan
dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan
metode lainnya. Kelebihan itu antara lain:
a.
b.
c.
d.

Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran

Mudah melaksanakannya
Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis Resolusi

yang baik
e. Dapat digunakan bermacam- macam detektor
f. Kolom dapat digunakan kembali
g. Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan,
karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis.
h. Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena
HPLC dilakukan pada suhu kamar.
i. Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.
20

j. Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik didihnya
sangat tinggi seperti polimer
k. Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas
l. Banyak pilihan fasa geraknya Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam.
Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang
tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
m. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana
interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi
dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
n. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak
pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang
diinginkan.
o. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat.
p. Detektor- detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai
picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks
Refraksi, Radiometri, dll, dapat juga digunakan dalam HPLC
q. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik,
kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa
dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi,
kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan
r. Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat zat yang tidak bisa dianalisis
dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis
psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk
mengalissis zat zat tersebut.
s. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC tidak
menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh
karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah
melewati detector.
t. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi
penukar ion memerlukan prosedur khusus.
Sedangkan kekurangannya adalah:
a. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu
b. Hanya bisa digunakan untuk asam organic
c. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi
21

d. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

BAB III
PEMBAHASAN

A.

Penerapan HPLC Dalam Analisis Senyawa (Obat) Dalam Campuran

HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat,
produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan
farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika
HPLC dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah sampel
sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
Penggunaan KCKT dalam bidang farmasi
Metode KCKT merupakan metode yang sangat populer untuk menetapkan kadar
senyawa obat baik dalam bentuk sediaan atau dalam sampel hayati .Hal ini disebabkan
KCKT merupakan metode yang memberikan sensitifitas dan spesifitas yang tinggi. Berikut
ini adalah beberapa contoh penggunaan KCKT untuk analisis beberapa sediaan farmasi :
Obat (sediaan)

Fase diam

Fase gerak

Detektor
22

Asetonitril-asam
Adriamisin (serum)

C18

Aktinomisin (Serbuk)

C18

Allopurinol (tablet)

C18; 4 x 30 cm

Fluoresen
fosfat 0,01 N ph EK : 465 nm
EM : 580 nm
2,3 (50:50)
CH3CN-H2O
Elektrometer
(1:1)
KH2PO4 0,05M;
UV 254 nm
1,5 ml/menit

1. Parasetamol:

Nama Kimia
Rumus Molekul
Berat Molekul
Pemerian
Kelarutan

: 4- Hidroksiasetanilida
: C8H9NO2
: 151,16
: serbuk, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit.
: larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N,

mudah larut dalam etanol. (Depkes RI, 1995).

Parasetamol atau N-asetil-p-aminofenol atau asetaminofen merupakan derivat
para-amino fenol yang berkhasiat sebagai analgesik-antipiretik. Asetaminofen merupakan
pengganti yang baik untuk analgesik dan antipiretik aspirin pada penderita dengan
keluhan saluran cerna dan pada mereka dengan perpanjangan waktu perdarahan yang
tidak menguntungkan. Asetaminofen merupakan analgetik dan antipiretis.
Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang
dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa
ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti
C-18 dan fasa gerak polar seperti methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan
sempurna melalui saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu jam
dan masa paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma,
25% parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan
antipiretik.
Pengujian kadar parasetamol dalam obat menggunakan teknik HPLC , dalam
proses analisisnya HPLC memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan menginjeksikan
sampel uji yaitu larutan obat yang sebelumnya telah disaring dengan membran PTFE ke
23

dalam kolom HPLC dengan injektor khusus / syringe yang bervolume 20 L,

penyaringan sebelum penginjeksian ini dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam
kolom dan menghilangkan gas dari pelarutnya. Sampel didorong cepat saat melalui
kolom dengan bantuan pompa bertekanan tinggi. Di dalam kolom, komponen- komponen
pada sampel dipisahkan berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi solut terhadap
fasa diamnya. Solut yang interaksinya kurang kuat akan keluar lebih lambat dari kolom
daripada solut lainnya. Komponen akan keluar dari kolom dengan kecepatan yang
berbeda dan terdeteksi oleh detektor. Detektor yang digunakan adalah detektor UV
karena parasetamol merupakan senyawa organik yang dapat menyerap sinar UV.
Pengujian ini menggunakan panjang gelombang 243 nm dengan mempertimbangkan
panjang gelombang methanol yaitu 205 nm dan air yaitu 190 nm. Teknik yang dilakukan
kali ini merupakan reverse phase atau fasa terbalik karena teknik ini menggunakan
pelarut polar sebagai fasa gerak sedangkan fasa diamnya menggunakan pelarut nonpolar. Penggunaan fasa gerak dan fasa diam yang berbeda kepolarannya ini bertujuan
agar sampel uji tidak bereaksi dengan fasa diamnya saat melewati kolom HPLC. Sampel
melewati kolom HPLC tentunya memiliki jangka waktu yang terukur dan juga menjadi
parameter, waktu yang dibutuhkan sampel untuk melewati kolom ini disebut waktu
retensi.
Dalam pengujian parasetamol dalam obat, waktu retensi yang terukur adalah
antara 2,19 hingga 2,2. Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini menghasilkan suatu
citra berupa kromatogram. Kromatogram ini merupakan grafik antara intensitas
komponen yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi. Seharusnya tampilan
kromatogram ini berupa grafik lurus, lancip, dan simetris. Tetapi data yang diperoleh
pada percobaan ini sedikit melebar dan tidak simetris tentunya. Ini disebabkan antara lain
oleh adanya difusi didalam kolom HPLC, difusi yang terjadi adalah difusi longitudinal
dan difusi transfer massa. Difusi longitudinal itu sendiri disebabkan oleh penyebaran
komponen yang tidak sama sedangkan difusi transfer massa disebabkan oleh kecepatan
komponen yang tidak merata. Terdapat beberapa parameter pemisahan dalam HPLC,
yaitu laju alir eluen yaitu sebesar 0,5 mL/ menit, ketebalan stasioner kolom C-18 yaitu 15
cm, ukuran partikel analit, dan laju difusi yang sudah disebutkan diatas. Parameterparameter ini dapat menyebabkan kejanggalan dalam pencitraan kromatogram seperti
24

pelebaran pada puncak. Adanya pelebaran puncak pada kromatogram mengindikasikan

terjadinya overlapping analit yang belum terpisahkan dalam kolom. Semakin tinggi laju
difusinya maka komponen dalam sampel akan semakin sulit dipisahkan secara efisien.
Dari grafik luas area terhadap konsentrasi (ppm) dapat dihitung kadar parasetamol
dalam sampel obat. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa dari sampel obat sebanyak
12,5 mg diperoleh kadar parasetamol sebesar 83,444 % sedangkan dari massa rata-rata
tablet obat sebesar 738,2 mg diperoleh massa parasetamol pada tiap tablet obat sebesar
615,9836 mg. Dapat disimpulkan bahwa kadar parasetamol dalam tablet obat adalah
sebesar 615,98 mg per tabletnya.
2. Kafein

Nama Kimia
: 1,3,7-Trimetil xantin
Rumus Molekul : C8H10N4O2
Berat Molekul : 194,19
Pemerian
: serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat putih, biasanya

menggumpal, tidak berbau, rasa pahit.

Kelarutan : Agak sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam kloroform,
sukar larut dalam eter. (Depkes RI, 1995).
Dalam penetapan kandungan kafein digunakan sampel berupa minuman

berkafein. HPLC yang digunakan adalh jenis HPLC Series 200 dengan detector 275 nm
Perkin Elmer, Kolom : Supelcosil LC : 18, ( 25 cm X 4,6mm, 5 m ). Menggunakan
asam asetat 70% dan methanol 30% sebagai fasa gerak. Proses pengerjaan terdiri dari 2
tahap, yaitu tahap preparasi dan tahap injection ke HPLC.

ANALISIS KUANTITATIF
Metoda Persentase Tinggi / Lebar Puncak
Metoda ini disebut juga Metoda Normalisasi Internal. Untuk analisis kuantitatif
diasumsikan bahwa lebar atau tinggi Puncak (Peak) sebanding (proportional) dengan
kadar / konsentrasi zat yang menghasil puncak. Dalam metoda yang paling sederhana
25

diukur lebar atau tinggi Puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa setiap
lebar atau tinggi Puncak diekspresikan sebagai suatu persentase dari total). Hasil
normalisasi dari lebar atau tinggi puncak memberikan komposisi dari campuran yang
dianalisis, seperti contoh pada Tabel berikut:
Peak area
No

Kafein
standar

Kafein
sampel

2601417,4
0

2216635,31

dalam

Berdasarkan data table diatas, maka kadar kafein dalam sampel ( teh poci ) dapat dianalisis
dengan mengunakan persamaan :
Cx

= Ax / Ap X Cp
= x 200 ppm
= 170,42 ppm

Maka dalam 1 mL sampel yang diuji terdapat 0,17042 mg kafein.

Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu:
Kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap
komponen muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada kromatogram. Komponenkomponen dapat berkoelusi, atau ditahan di dalam kolom, atau, terelusi tanpa terdeteksi.
Kita harus mengasumsi bahwa kita memperoleh respons detektor yang sama untuk setiap
komponen
Untuk mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor diperlukan.
Kafein berkhasiat menstimulasi SSP, dengan efek menghilangkan rasa letih, lapar
dan mengantuk, juga daya konsentrasi dan kecepatan reaksi dipertinggi, prestasi otak dan
suasana jiwa diperbaiki. Kofein juga memperkuat kontraksi jantung, vasodilatasi perifer
26

dan diuretis. Kofein digunakan sebagai penyegar. Zat ini sering dikombinasikan dengan
Parasetamol atau asetosal untuk memperkuat efek analgetisnya.
Kafein dosis sedang menyebabkan insomnia, ansietas dan agitasi. Dosis tinggi
diperlukan untuk memperlihatkan toksisitas berupa muntah dan konvulsi. Dosis letal
sekitar 10 g (kira-kira 100 cangkir kopi) yang menimbulkan aritmia jantung. Kematian
karena kafein sangat tidak mungkin. Letargi, iritabel dan sakit kepala terjadi pada pengguna
yang secara rutin minumg lebih dari 600 mg kopi per hari ( sekitar 6 cangkir kopi per hari)
dan mendadak berhenti. (Mycek, 2001).

BAB IV
PENUTUP

4.1 Kesimpulan
a. Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector,
pengolahan data.
b. Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan
senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase
stasioner (diam). HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa
aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi
dalam sediaan farmasi. Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam
suatu campuran.
c. HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu
menghasilkan pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah
menguap ataupun tak tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk
mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada KCKT tidak merusak komponen zat
yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi
pemisahan. Sedangkan kekurangannya adalah larutan harus dicari fase diamnya terlebih
dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus mengetahui kombinasi yang
27

optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya mahal sehingga
penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas
4.2 Saran
Penulis berharap kromatografi gas yang telah disajikan dalam bab isi dapat dijadikan
referensi ataupun tambahan wawasan bagi pembaca sehingga dapat membedakannya dan
dapat menerapkannya secara tepat dengan tujuan memajukan pendidikan di Indonesia.

DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, M., dan Suherman 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press. Surabaya.
Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University
Press. Surabaya.
Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas Padjajaran. Bandung.
Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif
Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Day, R.A dan Underwood, A.L., 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.
Khopkar, S.M., 2008, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.
Putra,Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Jurusan
Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara :3
Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan. Kanisius. Yogyakarta.

28