BAB I

PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Kimia analitik adalah cabang ilmu kimia yang berfokus pada analisis material untuk
mengetahui komposisi, struktur, dan fungsi kimiawinya. Secara tradisional, kimia analitik dibagi
menjadi dua jenis, kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif bertujuan untuk mengetahui
keberadaan suatu unsur atau senyawa kimia, baik organik maupun anorganik, sedangkan analisis
kuantitatif bertujuan untuk mengetahui jumlah suatu unsur atau senyawa dalam suatu cuplikan.
Kimia analitik modern dikategorisasikan melalui dua pendekatan, target dan metode.
Berdasarkan targetnya, kimia analitik dapat dibagi menjadi kimia bioanalitik, analisis material,
analisis kimia, analisis lingkungan, dan forensik. Berdasarkan metodenya, kimia analitik dapat
dibagi menjadi spektroskopi, spektrometri massa, kromatografi dan elektroforesis, kristalografi,
mikroskopi, dan elektrokimia.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC
(Hight Performance Liquid Chromatograhy )dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal
tahun 1970-an. Saat ini KCKT merupakan tekhnik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam sebidang, antara lain :
farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer dan industri-industri makanan. Beberapa
perkembangan KCKT terbaru antra lain : miniaturisasi`sistem KCKT, penggunaan KCKT untuk
analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat dan analisisi senyawa-senyawa
kiral.
Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC, High Performance Liquid Chromatography)
merupakan suatu tekhnis analisis obat yang paling cepat berkembang. Cara ini ideal untuk
analisis beragam obat dalam sediaan dan cairan biologi, karena sederhana dan kepekaannya
tinggi.
            KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu
seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis;
menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintetis, atau
produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor sampel-sampel yang berasal dari
lingkungan ; memurnikan senyawa-senyawa dalam suatu campuran ; memisahkan polimer dan
menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran; kontrol kualitas dan mengikuti
jalannya reaksi sintetis.
            Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT
dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya
sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
 Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan
dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa- fasa ini membentuk suatu lapisan
stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes
lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa stasioner/diam dapat berupa zat padat atau suatu
cairan, dan fasa gerak dapat berbentuk cairan ataupun gas. Maka semua jenis kromatografi yang
dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat,gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Day dan
Underwood, 2002). Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan
melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan
tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.
Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan dalam memisahkan suatu campuran senyawa.
Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi
piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu
menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography
(HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter
umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran
dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).
HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase
diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit ( kolom )
dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan
tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relative singkat.
HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi;
lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan.
1.2 Tujuan
Tujuan dari pembuatan makalah ini adalah :
1. Untuk mengetahui teori dasar HPLC.
2. Untuk mengetahui prinsip kerja dan penerapan dari HPLC.
3. Untuk mengetahui kelebihan dan kekurangan metode analisis dengan HPLC.
4. Untuk mengetahui penerapan HPLC dalam bidang analisis
1.3 Rumusan Masalah
1. Apa itu HPLC ?
2. bagaimana prinsip kerja dan penerapan dari HPLC?
3. bagaimana kelebihan dan kekurangan metode analisis dengan HPLC?
4. bagaimana penerapan HPLC dalam bidang analisis?
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Perkembangan Kromatografi

Kromatografi pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen yang
akan dipisahkan terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur yaitu fasa diam dan
fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat terlarut oleh suatu
proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu
diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu
menunjukkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul
atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti, 1998).
Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang
berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga
menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang
pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi. Penyelidikan
tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk
kromatografi padatan cair (LSC).
Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai
berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov
dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik
sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak
hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk
pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James
mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir
tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih
(Sudjadi, 1986).
Kromatografi cair kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan
dimana fase cair yang mengalir perlahan-lahan melewati kolom akibat gaya gravitasi dan terjadi
proses pemisahan di kolom tersebut. Metode itu dicirikan dengan efisiensi kolom yang rendah
dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik
kolom cair kembali dilirik dengan dikembangkannya sistem kolom bertekanan tinggi oleh
Kirchland dan Huber, yang mampu bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm -2 (3000p.s.i).
Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung
berukuran sekitar 30 nm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar
1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih
cepat) daripada dengan kromatografi cair yang biasa (Bassett et. all., 1994).
 Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada
dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat
membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan
kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance =
Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed= Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah
berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan
kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian
membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini
dengan teknik yangsudah matang dan dengan cepat HPLC mencapai suatu keadaan yang
sederajat dengan kromatografi gas (Putra, 2004).
Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-
contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung
gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai
penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya
cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam. Secara
keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk
menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel
penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high
performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC
menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel
penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar,
2003).
HPLC telah digunakan di Indonesia sejak tahun 1997 oleh Wiadnyana dalam
penelitiannya yang bertema menguji dan menentukan kadar toksisitas berbagai macam
fitoplankton di perairan laut. Selain digunakan untuk uji toksisitas, dalam bidang Biokimia
HPLC kerap digunakan untuk menghitung kadar vitamin dan protein dari suatu makanan atau
sampel. Singkatnya, HPLC merupakan sebuah metode analisa modern yang multifungsi dan
sudah ada di Negara kita Indonesia. Oleh karena itu ijinkan penulis untuk bercerita sedikit
tentang High Perfomance Liquid Chromatography.
 BAB III
PEMBAHASAN
a. TEORI DASAR
Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi
dari komponen campuran tersebut diantarany dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fase
bergerak (mobile). Fase diam dapat berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fase bergerak dapat
berupa zat cair atau gas. Dalam kromatografi fase bergerak dapat berupa gas atau zat cair dan
fase diam dapat berupa zat padat atau zat cair (Acun, dkk, 2010).
Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap
komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa
konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Analisa kualitatif bertujuan
untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analat dalam suatu sample. Sedangkan
analisa kuantitaif untuk mengetahui jumlah dan konsentrasi analat tersebut dalam sample
(Riyadi, 2009).
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair yang dapat digunakan baik
untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC
didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan
dengan luas atau area larutan standar. Pada prakteknya, perbandingan kurang menghasilkan data
yang akurat bila hanya melibatkan satu standar, oleh karena itu maka perbandingan dilakukan
dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi (Cupritabu, 2010).
Saat ini, HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain :
farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan. Kegunaan umum
HPLC adalah untuk: pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis
; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile);
penentuan molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa;
pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hamper sama; pemisahan senyawa- senyawa
dengan jumlah sekelumit (traceelements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses
industry, HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk
analisis kualitatif maupun kuantitatif (Cupritabu, 2010).
Menurut Khopkar (1990), zat dengan kepolaran berbeda dapat dipisahkan dengan HPLC
berdasarkan partisi cair-cair. Prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi adsorbsi dan
banyak digunakan dalam industi farmasi dan pestisida. Prinsip umum kromatografi:
Keterangan :

1. Fase gerak
2. Fase diam
3. Kolom
4. Detektor
5. Rekorder
Parameter baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada lima factor, yaitu waktu
retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, resolusi, dan factor ikutan.
a.       Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu
komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat
konsentrasi maksimum.
b.      Faktor kapasitas (k’) juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika
nilai k’ kecil, maka komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k’ yang lebih besar,
maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan dan puncaknya
melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k’ optimum, yaitu antara 1 sampai 10. Kolom dinyatakan
baik jika cukup selektif artinya mampu menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang
cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai selektivitas (α) harus lebih besar
daripada 1., dimana semakin besar nilai α maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai α dapat
diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa gerak (misal: memperbesar polaritas); mengubah fasa
diam; mengubah temperature, karena pada umumnya kenaikan temperature akan memperkecil
waktu retensi; dan mengubah bentuk komponen.
c.       Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan
dengan hasil yang memuaskan dan dalam waktu yang singkat.
d.      Keterpisahan antara dua puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi ‘R’ (ukuran
besar kecilnya pemisahan). Jika nilai R ≥ 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik.
e.       Sedangkan factor terikutan (Tf) merupakan ukuran kesimetrisan suatu puncak. Dengan
catatan nilai Tf < 2,0.
Perkembangan HPLC berkembang dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke arah
yang lebih luas, yaitu proses pemisahan yang berasaskan afinitas. Filtrasi gel dan ion yang
berpasangan., akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan di dalam kolom disertai
pemakaian pelarut pengembangdengan tekanan tinggi (Ahmad dan Suherman, 1995).
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair– cair yang dapat digunakan baik
untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC
didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan
dengan luas atau area larutan standar. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan sejumlah
senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities);
analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic,
maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang
strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace
elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry.
Kegunaan umum KCKT adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik,
maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities) ; analisis senyawa-senyawa
tidak menguap (non-volatil) ; penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter
ion ; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir
sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element), dalam jumlah
banyak dan dalam skala proses industri. KCKT merupakan metode yang tidak dekstruktif dan
dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.
Keuntungan metode HPLC:
 Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis dan pengolahan data
 Volume sampel kecil
 Daya pisaht inggi
 Merupakan metode analitis Cepat,Peka, Akurat,Tepat, Reproducible, Preparatif
 Dapat digunakan untuk analisis sampel organik dan anorganik, bersifat volatil dan non-
volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal.
 Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas.
Kekurangan metode HPLC:
 Harga sebuah HPLC cukup mahal
 Sering ada larutan standard yang tertinggal diinjektor
 Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan
mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali
dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga

b. PRINSIP DAN MEKANISME HPLC

Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut
terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom
kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase
diam.
Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai
macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom,
kecepataan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel.
Instrumen KCKT pada dasarnya tersiri atas komponen pokok yaitu :

Gambar Rangkaian Instrumen HPLC

1.      Wadah fase gerak pada KCKT

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Sebelum menggunakan fase gerak harus
dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan
berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan
 analisis. Pada saat membuat pelarut pada fase gerak maka sangat dianjurkan untuk menggunakan
pelarut, bufer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi xdan lebih terpilih lagi jika
pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat KCKT (HPLC grade).
2.      Fase Gerak

Kiri: Methanol khusus HPLC ; Kanan: Reservoir yang terhubung ke pompa

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi, yang ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.
Deret eluotrofik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan hal penting dalam
pemilihan fase gerak.
Adapun ciri-ciri yang harus dimiliki oleh fase gerak pada KCKT, yaitu :
1) Kemurnian tinggi (high purity), yaitu cairan eluen yang tidak terkontaminasi.
2) Kestabilan tinggi, yaitu eluen yang tidak bereaksi dengan sampel atau zat yang berfungsi
sebagai fase diam.
3) Kekentalan rendah, yaitu kerapatan eluen sekecil mungkin.
4) Dapat melarutkan sampel, tidak mengubah kolom dan sifat kolom serta cocok dengan
detektor.

Beberapa deret eluotropik KCKT :

Parameter
Parameter
kekuatan UV cut off
Pelarut kekuatan pelarut
pelarut (nm)
(partisi)
(adsorbsi)
n-heksana 0,01 0,1 195
Sikloheksana 0,04 -0,2 200
 Tetraklorometan 0,18 1,6 265

Nilai pemenggalan UV merpakan panjang gelombang  yang mana pada kuvet 1 cm,
pelarut akan memberi absorbasi lebih dari 1,0 satuan absorbansi. Sangat dianjurkan untuk
menggunakan panjang gelombang deteksi yang tidak bertepatan atau di sekitar panjang
gelombang pemenggalan UV pelarut yang digunakan sebagai fase gerak.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah
campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.Untuk pemisahan
dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut
hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut jenos alkohol.
3.      Pompa

Pompa HPLC
Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu pompa kinerja konstan (constant pressure)
dan pompa pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi
menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan
suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau
peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor
sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa
syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
Tujuannya adalah  untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara
tepat.Ada 2 jenis pompa KCKT yaitu : pompa dengan tekanan konstan dan pompa aliran fase
gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tekanan konstan.
Syarat – syarat pompa yang ideal:
a. Mampu membangkitkan tekanan tinggi
b. Pulse free – out put
c. Control laju alir yang akurat
d. Tahan korosi
e. Terbuat dari bahan yang tahan terhadap fasa gerak
f. Bebas pulsa
g. Perlu“de gasser”
h. Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar
i. Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien
j. Bekerja pada tekanan sampai 6000 psi (400 atm)
Tiga jenis pompa yang sering digunakan dalam sistem KCKT yaitu :
1) Pompa Bolak-balik (reciprocating pump)
Jenis pompa yang paling banyak digunakan. Kelebihan pompa jenis ini adalah volume
internalnya kecil sekitar 35 – 400 μl, tekanan hingga 10.000 psi, kemampuan untuk adaptasi
menggunakan elusi gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas dari tekanan balik kolom dan
akibat dari kekentalan solven.
2) Pompa Sistem Penggantian (displacement pump)
Sistem penggantian menggunakan sebuah wadah besar seperti syringedengan sebuah
penekan yang digerakan oleh motor. Menghasilkan aliran yang bebas tekanan balik, tidak
dipengaruhi kekentalan dan bebas denyut. Kekurangan pompa jenis ini adalah kapasitas pompa
terbatas hanya 250 ml dan cukup sulit saat solven harus mengalami penggantian.
3) Pompa Tekanan Udara (pneumatic pump)
Bentuk paling sederhana sebuah pompa pneumatik merupakan wadah yang ditekan oleh gas
bertekanan tinggi. Harga relatif murah dan bebas denyut merupakan kelebihan jenis pompa ini.
Kekurangannya terletak pada kapasitas terbatas, tekanan keluaran terbatas hanya sekitar 2000
psi, dipengaruhi oleh tekanan balik dan kekentalan solven dan tidak dapat digunakan untuk
sistem elusi gradien.
4.      Injektor (penyuntikan sampel)

System injeksi otomatis

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fase gerak yang
mengalir dibawah tekanan meuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga
tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau
eksternal. Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana
mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama
halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).
Pada saat pengisian, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya
dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan katup diputar sehingga fase gerak mengalir
melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikkan dengan keluk
sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1 %. Penyuntikkan ini mudah digunakan untuk
otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada KCKT.
Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom. Waktu yang dibutuhkan oleh
senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagaiwaktu retensi. Waktu
retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan
ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki
waktu retensi yang berbeda.
Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) kondisi dari
fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) komposisi
yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom 1. Elusi Gradien Elusi Gradien didefinisikan
sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung.
Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang
tertahan kuat pada kolom. Dasar- dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder. Elusi Gradien
menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
5. Kolom
 Kolom Silika dari ThermoScientific

Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :
Parameter Kolom konvensional Kolom mikrobor
Tabung Stainless steel Stainless steel
kolom Panjang 3,10,15,20 dan 25 Panjang 25 dan 50 cm
cm Diameter luar 0,25 inci
Diameter luar 0,25 inci Diameter dalam 1 atau 2 mm
Diameter dalam 4,6 cm
Fase diam Porous, silika ukuran kecil, Porous, silika ukuran kecil, silika
silika yang dimodofikasi yang dimodofikasi secara kimiawi
secara kimiawi (bonded (bonded phase), atau polimer-
phase), atau polimer- polimer stiren/divinil benzen.Rata-
polimer stiren/divinil rata diameter partikel 3,5 atau
benzen.Rata-rata diameter 10µm dengan kisaran sempit.
partikel 3,5 atau 10µm
dengan kisaran sempit.
Tekanan 500-3000 psi 1000-5000 psi
operasional (35-215 bar (70-350 bar)

Fase gerak Hidrokarbon+pelarut Hidrokarbon+pelarut terklorinasi

terklorinasi atau alkohol atau alkohol untuk fase normal.
untuk fase normal. Untuk Untuk fase terbalik (reversed
fase terbalik (reversed phase) digunakan metanol atau
phase) digunakan metanol asetonitril + air atau
atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir 10-100
bufer.Kecepatan alir : 1-3 µl/menit.Modifikasi instrumen
ml/menit Sistem penghantaran pelarut yang
mampu memberikan kontrol aliran
di bawah 10µl/menit.Katup injeksi
sampekl bervolume kecil;sel
detektor bervolume kecil.
Kinerja Efisiensi meningkat dengan Sangat efisiensi dan sensitif, akan
bekurannya ukuran partikel tetapi lambat,konsumsi fase gerak
 fase diam, akan tetapi umur hanya ¼ dari kolom konvensional.
kolom dengan ukuran
partikel 3 µm lebih pendek.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibandingkan dengan kolom
konvensional, yakni :
1.      Konsumsi fase gerak mikrobor hanya 80% atau lebhi kecil dibandingkan dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100
µl/menit)
2.      Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.
3.      Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom
ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Kolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel, walaupun untuk tekanan
di bawah 600 psi kolom kaca dapat digunakan. Kolom untuk analisis KCKT memiliki ukuran
panjang kolom berkisar dari 10 – 30 cm berbentuk lurus dan jika diperlukan dapat disambung
dengan kolom yang lain. Diameter dalam kolom 4 – 10 mm dengan ukuran partikel 5 – 10 μm.
Kolom dari jenis ini mempunyai 40.000 hingga 60.000 lempeng/meternya.
Saat ini, pabrik pembuat kolom telah merancang dan memproduksi kolom dengan kecepatan
dan kinerja tinggi.Beberapa kolom hanya memiliki panjang 1 hingga 4,6 cm dengan ukuran
partikel 3 – 5μm. Beberapa jenis kolom memiliki jumlah lempeng hingga 100.000 hanya dengan
panjang 3 sampai 7,5 cm dengan kelebihan pada kecepatan dan sedikitnya solven yang
diperlukan dalam pemisahan. Jumlah solven minimum menjadi pertimbangan penting karena
mahalnya solven dengan tingkatan kromatografi (chromatography grade).
Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair yaitu jenis pellicular dan partikel
berpori (porous particle). Jenispellicular terdiri dari partikel dengan bentuk bola, tidak berpori
berbahan dasar gelas atau polimer dengan diameter 30 hingga 40 μm. Lapisan tipis berpori silika,
alumina, divinil benzen sintetis polystirena atau resin penukar ion dilapiskan pada
permukaannya.
Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel berpori dengan diameter partikel 3 –
10μm terbuat dari silika, alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena atau resin penukar
kation yang kemudian dilapisi lapisan tipis film berbahan organik sehingga berikatan secara
kimia atau fisika terhadap permukaannya. (Skoog et al., 1998)

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
 Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali
(reusable). Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis
sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan. Kolom diisi
dengan partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu cairan yang
berfungsi sebagai fasa diam. Komponen-komponen sample dibawa oleh cairan fasa gerak yang
dialirkan dengan bantuan tekanan tinggi melewati kolom fasa diam.
Komponen- komponen dipisahkan berdasarkan partisi antara fasa diam dan fasa gerak
yang satu sama lain tidak bercampur. Efisiensi kolom salah satunya sangat tegantung dari
besarnya partikel fase stasioner. Oleh karena itu bila ukuran fase stasioner lebih kecil, maka
tinggi plat teoritik akan berkurang, sehingga jumlah plat teoritik akan bertambah, yang
meningkatkan efisiensi kolom. Dengan kolom yang pendek dan efisiensi, pemisahan akan
berjalan dengan cepat.
Terdapat banyak analisis yang dikerjakan pada suhu kamar, suhu kolom sering dapat
diatur dengan konstan dengan memakai cara pemanasan. Sering dibutuhkan suhu kolom yang
lebih tinggi dari suhu kamar untuk mengatasi masalah daya larut solute yang dianalisis dan
viskositas fase gerak yang agak tinggi.
6. Fase diam
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
silika yang tidak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.Permukaan silika
adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika yang dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen yang akan
bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang stabil terhadap hidrolisis
karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang dimodifikasi ini mempu
karekateristik kromatografi dan selektifitas yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang
tidak dimodifikasi.

Oktadesil silika (ODS atau C18)merupakan fase diam paling sering digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa denngan kepolaran yang rendah, sedang maupun tinggi.
Solut-solut yang polar, terutama yang bersofat basa akan mengekor (tailing peak) pada
penggunaan fase diam silika fase terikat. Hal ini disebabkan oleh adanya interaksi adsorbsi
antara solut-solut ini dengan residu silanol dan pengotor logam pada silika.Masalah ini dapat
diatasi denganend-chapping yakni proses menutupi residu silanol ini dengan gugus-gugus
trimetilsilil dan menggunakan silika dengan menggunakan silika dengan kemurnian yang tinggi
(kandungan logam <1ppm)
6. Detektor KCKT

Detector HPLC
Detektor pada KCKT dikelompokkan dalam 2 golongan yaitu : detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik dan tidak bersifat selektif) seperti
detektor indeks bias dan detektro spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang
hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti detektor UV-Vis, detektor
Fluoresensi dan elektrokimia.

Detektor ideal pada sistem KCKT mempunyai persyaratan :

1) Memiliki sensitifitas yang memadai. Kisaran umum sensitifitas berkisar dari 10-8 hingga 10-
15
gram zat terlarut per pembacaan
2) Stabil dan memiliki keterulangan yang baik
3) Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi
4) Waktu respon yang singkat
5) Kemudahan pada penggunaan
6) Memiliki volume internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran puncak

Suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :

1.      Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
2.      Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil.
3.      Stabil dalam pengoperasiannya
4.      Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Untuk
kolom konvensional, selnya bervolume 8µl atau lebih kecil, sementara kolom mikrobor selnya
bervolume 1 µl atau lebih kecil lagi.
5.      Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas
(kisaran dinamis linier).
6.      Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Beberapa jenis detektor yang digunakan pada sistem KCKT :
1) Detektor Absorban (UV-Vis)
Pada detektor absorban, aliran akan mengalir melalui detektor dari kolom kromatografi.
Untuk meminimalkan pelebaran puncak, detektor dirancang dalam volume yang sekecil
mungkin. Ukuran volume dibatasi 1 – 10 μl dengan panjang sel 2 – 10 mm. Umumnya sel
detektor mampu menahan tekanan hingga 600 psi sehingga peralatan pengurang tekanan
diperlukan sebelum aliran memasuki detektor.
2) Detektor Fluorescens
Detektor fluorescens yang digunakan sama halnya dengan detektor pada spektrofluoro-
fotometer. Detektor paling sederhana menggunakan lampu merkuri sebagai sumber cahaya dan
filter untuk mengisolasi panjang gelombang emisi radiasi. Lampu Xenon digunakan pada
instrumen yang lebih baik dengan grattingsebagai monokromatornya.
3) Detektor Refraktif Indeks
Detektor jenis ini bekerja dengan mengukur nilai indeks bias yang senyawa yang melalui sel.
Sel akan mengukur indeks bias solven fasa gerak sebagai blanko dan sampel secara bersamaan
untuk mendapatkan nilai indeks bias relatif.
4) Detektor Elektrokimia
Detektor dengan mendasarkan kerjanya pada pengukuran arus listrik. Perubahan arus akan
dideteksi terhadap waktu dan ditampakkan dalam bentuk kromatogram.Contoh penggunaan
detektor adalah pada penetapan senyawa tiol dan disulfida.

5) Detektor Spektra Massa

Sejumlah fraksi kecil cairan dari kolom dimasukkan ke dalam spektrometer massa pada
kecepatan alir 10 – 50 μl per menit atau menggunakan termospray. Analat akan diionisasikan,
dipisahkan pada analisator, dibaca oleh detektor dan menghasilkan spektrum massa.